Summary
Hechtingen zijn meestal nodig om weefsel te herstellen tijdens chirurgische procedures. Echter, de toepassing problematisch omdat ze invasief en tast weefsel. De fabricage en applicatie methoden van een nieuwe weefsel lijm worden hier gemeld. Deze kleeffolie laser geactiveerd en vereist niet het gebruik van hechtingen.
Abstract
Fotochemische weefsel bonding (PTB) is een techniek voor hechtingen weefselherstel, wat wordt bereikt door een oplossing Bengaals (RB) tussen twee weefselranden 1,2. Deze worden vervolgens bestraald door een laser die selectief wordt geabsorbeerd door de RB. De resulterende fotochemische reacties zou verknopen de collageenvezels in het weefsel met minimale warmteproductie 3. In dit rapport, is RB opgenomen in dunne chitosan films op een nieuw weefsel lijm dat is met een laser-geactiveerde fabriceren. Zelfklevende films, gebaseerd op chitosan en met 0,1 gew% ~ RB zijn vervaardigd en verbonden met kalf ingewanden en rat tibiale zenuwen door een vaste-stof laser (λ = 532 nm, Fluence ~ 110 J / cm 2, puntgrootte ~ 0,5 cm) . Een kolom tensiometer, gekoppeld aan een personal computer wordt gebruikt om de hechting te testen. De RB-chitosan lijmverbindingen stevig aan de darm met een sterkte van 15 ± 6 kPa (n = 30). De kleefkracht daalt tot 2 ±, 2 kPa (n = 30) wanneer de laser niet wordt toegepast op de kleefstof. De anastomose van scheenbeen zenuwen kunnen ook aangevuld worden zonder het gebruik van hechtingen. A novel chitosan lijm is vervaardigd dat obligaties fotochemisch aan weefsel en vereist geen hechtingen.
Protocol
1. Chitosan Lijm Voorbereiding
- De chitosan poeder is oplosbaar in azijnzuuroplossing, voor de bereiding van een voorraad oplossing van azijnzuur (2% v / v), 10 ml ijsazijn aan 490 ml gedeïoniseerd water (DI-H 2 O).
- Voor de bereiding van een voorraadoplossing van Rose Bengal (RB) (0,01% w / v) in azijnzuur, wegen 5 mg van RB in een injectieflacon omwikkeld met aluminiumfolie om te voorkomen fotobleken. Voeg 0,5 ml van DI-H 2 O om het poeder op te lossen dan 49,5 ml van het azijnzuur stockoplossing (beschreven in paragraaf 1.1) toe te voegen.
- Voor de bereiding van chitosan-oplossing (1,7% w / v) Weeg 0,85 g chitosan poeder (MW medium, 85% acetylatiegraad) en voeg 50 ml RB azijnzuuroplossing. De controle werd bereid door de chitosan in azijnzuur oplossing zonder RB.
- Voeg een magnetische roerder aan het chitosan en roer bij kamertemperatuur. Om de volledige oplossing van de bestanddelen te garanderen, roer de chitosanin azijnzuur + RB twee weken en chitosan in azijnzuur gedurende 5 dagen (controle). Wanneer chitosan wordt ontbonden zijn de pH stijgt van ~ 2,6 tot ~ 3.9. Merk op dat RB is slecht oplosbaar in zure pH, en vereist een toename van de pH van de oplossing en een langere roertijd te lossen.
- Centrifugeer de oplossingen bij 3270 xg gedurende 1 uur en verzamel de supernatant met bijvoorbeeld een steriele 10 ml spuit. Zorg ervoor dat u de onzuiverheid pellet te verstoren. Tijdens deze stap wordt de oplossing gereinigd van macroscopische onzuiverheden en onoplosbaar materiaal.
- Injecteer de (gecentrifugeerde) chitosan-oplossing op een vlakke plaat met behulp van perpex een steriele spuit. De dikte van de gedroogde film afhankelijk van de verhouding tussen de afgegeven hoeveelheid oplossing en het oppervlak waarover de oplossing is verspreid. Verzekeren dat de oplossing vrij van luchtbellen en gelijkmatig op de plaat. Om dunne films te verkrijgen met ~ 13 micrometer dikte, injecteer ~ 1 ml oplossing meer dan 12 cm 2 oppervlaktearea (afmetingen ~ 3x4 cm, Figuur 1A).
- Bedek de perspex plaat met een scherm van aluminiumfolie bijvoorbeeld voorkomen fotobleken van de oplossing. Zorg ervoor dat er voldoende ventilatie is gewaarborgd om de oplossing te drogen onder het scherm.
- De oplossing bij kamertemperatuur (25 ° C) en druk (1 atm) drogen tot de resulterende film is onoplosbaar in water en niet macroscopisch zwellen. Dit wordt typisch bereikt in 2 weken.
- Maak de films voorzichtig met een dun en plat spatel: deze films kan gemakkelijk worden afgepeld de perspex plaat zonder ze te beschadigen.
- De dikte van de films met een micrometer.
- Snijd de lijm in rechthoekige stroken met een schone scherpe schaar en leg ze tussen de steriele glazen dia's om hun platte vorm te behouden. Wikkel de slides in aluminiumfolie lichtafschermende en bewaar bij kamertemperatuur. Label de lijmen met of zonder RB als "rose lijm" of "chitosan Adhesive "respectievelijk.
- De roos zelfklevende films kunnen worden gesteriliseerd met ethanol (90%) of met gammastraling (0,1 KGy / h gedurende 24 uur) 4,5.
2. Lijm optische demping
- Bevestig de roos lijm in een kwarts cuvet.
- Noteer de verzwakte spectrum in het bereik van 400 - 800 nm met een dual-beam spectrofotometer 4.
- Uitgaande van de geldigheid van de wet van Beer, berekent de verzwakkingslengte van de lijm als volgt: I = I 0 e-Ax waarbij I 0 de invallende bundel intensiteit, 1 / A is de verzwakkingslengte, en x is de filmdikte.
- Herhaal stap 2,1 tot 2,3 voor de chitosan lijm dienen als controle.
3 In Vitro Toepassing:. Laser Tissue Bonding op Darm
- Oogst kalf darm direct na dier euthanasie en bewaar bij -80 ° C.
- Voor gebruik ontdooien en hydrateren de tissue door onderdompeling in DI-H 2 O 10 minuten.
- Halveren van het weefsel in secties (2 x 1 cm) met behulp van een # 10 mes onder een operationele microscoop (x10). Houd de secties vochtig met behulp van DI-H 2 O.
- Breng de incisie stronken dicht bij elkaar (eind tot eind). Veeg het overtollige water uit het oppervlak met behulp van wattenstaafjes.
- Plaats een rose plakstrook (10 x 6 mm) over de incisie op de serosa laag met microforceps de volledige contact met de darm (figuur 2).
- Het weefsel hechting van de roos kleefstof wordt geactiveerd door een diode-gepompte vaste stof laser, die is gekoppeld met een multimode optische vezel (kerndiameter 200 pm) 4.
- Stel het vermogen van de laser 180 mW en bestralen van het hechtmiddel voor ~ 6 min met een bundelvlek grootte van ~ 5 mm, met de parameters van tabel 1. Spot-bestralen van de lijm zodat elk spot wordt bestraald ~ 5 seconden alvorens de bundel op de aangrenzende plaats. Tzijn procedure garandeert dat de laserstraal het gehele oppervlak van de lijm meerdere keren scant.
- Het weefsel hechtsterkte beoordelen klem een monster een gekalibreerde kolom tensiometer (Instron, MA, USA) met mechanische handgrepen. Verplaats de grepen op 22 mm / min tot de twee weefsel stompen aparte 4.
- Plaats een roos lijm op het weefsel zoals beschreven in stap 3.5. Niet bestralen het monster en meet het weefsel hechtsterkte zoals beschreven in stap 3.8. Dit monster dient als controle.
4 In Vivo Toepassing:. Nervus tibialis anastomose
- Bezadigde de Wistar rat met isofluraan / O 2 mengsel (4% tijdens de inductie, 2% daarna) 5. Subcutaan injecteren Buprenex (0,03 mg / kg) voor de intra-operatieve analgetische activiteit te bieden en eventuele pijn of ongemak te verlichten.
- De volgende chirurgische ingreep dient te worden uitgevoerd onder een operationele microscoop (x10). Maak een schuine huidincisie ongeveer 3 cm lang in de dorso-laterale deel van de rechter dij en bloot de nervus tibialis met een spier-splitsing aanpak door de bilspieren 2.
- Gedeeltelijk ontleden en trim de adventitia van de nervus tibialis het gebruik van rechte micro-schaar en absorberen overtollig water met steriel gaas of katoen tips.
- Snijd de nervus tibialis met micro-schaar.
- Plaats een steriel chitosan strip (afmetingen 5 x 4 mm) onder de nervus tibialis met behulp van micro-pincet.
- Benaderen de zenuwstompen end-to-end met micro-forceps de roos plakstrip.
- De strip zich volledig aan de zenuw die een kraag, die met de rotatie van de zenuw helpen tijdens de laserbestraling van de strip.
- Activeer de roos lijm met de laser zoals beschreven in stap 3.6) en 3,7).
- Knip de overtollige lijm steeg van de kraag van de geopereerde zenuw.
- Sluit de spieren en de huid met vijf 3-0 hechtingen 5. Standaard postoperatieve herstel procedures moeten worden gevolgd met inbegrip van dagelijkse inspectie voor dehiscentie of pus vorming en pijnstillende administratie, indien nodig.
5. Representatieve resultaten
De films die verkregen zijn licht roze van kleur, dun en hebben een glad oppervlak (figuur 1). Ze zijn ook flexibel en oprolbaar in buizen met kleine diameter zonder dat scheuren of andere zichtbare schade (Figuur 1B). De roos kleefmiddel twee absorptiepieken bij 530 en 562 nm en de groene laser dus sterk geabsorbeerd door het hechtmiddel en de overeenkomstige verzwakkingslengte bij 532 nm ~ 12 urn (figuur 3). Daarentegen chitosan films zonder RB verzwakt zwak de laser (1 / A ~ 162 urn) waarschijnlijk door verstrooiing. Uit de spectra plot dat geen significante aggregatie van RB optreedt in de films.
De roos lijmverbindingen stevigde darm bij laserbestraling (figuur 2) het bereiken van een typische maximale belasting bij breuk van 0,9 ± 0,4 N (n = 30). De hechtsterkte werd geschat als de maximale belasting gedeeld door de klevende oppervlak, namelijk 15 ± 6 kPa (n = 30). De onbestraalde rose kleefstof aanzienlijk minder gebonden aan weefsel (2 ± 2 kPa, n = 30, ongepaarde t-test p <10 6). De in-vivo anastomose van de tibialis werd versterkt na het aanbrengen en binden van de roos lijm in combinatie met de groene laser. Een week na de operatie was de geopereerde zenuw in continuïteit en de reparatie kracht bedroeg 17 ± 9 kPa (n = 10).
Figuur 1. A) De RB-chitosan-oplossing wordt gegoten op een vlakke Perspex plaat (plaatdikte ~ 5 mm). Millimeterpapier wordt onder de plaat op de droge-cast stap vergemakkelijken. De in water oplosbare film wordt verkregen twee weken na gieten. B) De roos lijm is flexibel en kan worden opgerold in een kleine cilinder.
Figuur 2. Het rose lijm gehecht aan kalfsdarm na laserbestraling. Uniforme bestraling wordt toegepast op de RB lijm tijdens weefsel-bonding, maar geselecteerd spots worden getoond in deze afbeelding op de foto-blekende werking van de laser geïllustreerd aan de lijm.
Figuur 3. Het absorptiespectrum (in willekeurige eenheden) van het roos kleefmiddel toont twee pieken bij 530 en 562 nm. De groene laser (λ = 532 nm) is dus sterk geabsorbeerd door het hechtmiddel tijdens de laserbelichting. De chitosan lijm zonder RB absorbeert slecht de laserstraal.
| n | Vermogen (W) | Tijd (s) | Fluence (J / cm 2) | I (W / cm 2) | Max Load / Area (kPa) | ||
| Lijm + Laser | 30 | 60 ± 10 | 0,18 ± 0,03 | 365 ± 5 | ~ 110 | ~ 0,9 | 15 ± 1 |
| Adhesive | 30 | 60 ± 10 | NA | NA | NA | NA | 2 ± 2 |
Tabel 1. Legend. n, monsternummer, Ruimte, oppervlakte van de roos lijm (gemiddelde ± maximale fout), Power, laservermogen (gemiddelde ± maximale fout); Tijd, bestralingstijd (gemiddelde ± maximale fout); Fluence, gemiddelde laser Fluence, ik, geschatte irradiance; Max Load / Area, maximale belasting bij breuk van het gerepareerde weefsel gedeeld door het klevende oppervlak (gemiddelde ± SE).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De roos lijm fabricage is gebaseerd op een eenvoudige droge-cast proces, hoewel het oplossen van RB in zure pH heeft langdurig roeren van de chitosan-oplossing. Het is belangrijk dat de oplossing drogen totdat het een in water onoplosbaar film. Dit gebeurt wanneer het gewicht watergehalte ~ 10% in de gedroogde film 6. Onoplosbare films worden gewoonlijk verkregen 2 weken na droog-casting bij standaardomstandigheden van temperatuur en druk (~ 25 ° C en ~ 1 atm). Het mechanisme van weefsel binding is nog niet duidelijk, maar werd waargenomen dat RB diffundeert van het kleefmiddel in het aangrenzende weefsel, waardoor de laser het efficiënt foto-schakelen op het weefsel interface. Het kan worden gespeculeerd dat de RB vermogen van de productie singlet zuurstof, bij bestraling met licht, een rol in crosslinking weefsel collageen en chitosan spelen via de aminogroepen 7,8. Een recente studie over de roos lijm heeft ook aangetoond dat de maximale temperatuur bereikt tijdens de tissue-lijmen was ~ 32 ° C, het ondersteunen van de hypothese van een fotochemisch proces 4. Andere hechtingen technieken voor weefselherstel worden momenteel onderzocht door verschillende onderzoeksgroepen. Laser weefsel lassen (LTW) bijvoorbeeld is met succes toegepast in oogheelkundige chirurgie door Pini et al. 9. In het algemeen echter, kan LTW veroorzaken collateral thermische schade weefsel temperatuur kan 65-75 ° C bereiken in laser-bestraling. Cyanoacrylaatlijmen ook klinisch aangebracht op huidwonden plaats van hechtingen sluiten, maar niettemin algemeen niet gebruikt voor interne orgaanherstel vanwege hun toxiciteit 10. Hoewel de roos lijm (~ 15 KPa) hogere hechtsterkte dan fibrinelijmen (~ 8 kPa) 11 cyanoacrylaatlijmen steeds de sterkste adhesie (150 kPa) 12. De dikte van de roos lijm vereist bijzondere aandacht tijdens fabricage: een dikke kleefmiddel (≥ 20 um) zouden bijvoorbeeld voorkomen laservan het bereiken van het weefsel interface en zou een verzwakking van de hechtkracht als gevolg van overmatige absorptie van de laser door de Bengaals. Een dunne lijm (<10 urn), anderzijds, zou de laser bestraling en fluentie in het kleefmiddel weefselinterface. Er moet echter worden in het verminderen van de laagdikte teneinde overmatige verwarming van weefsel te voorkomen tijdens laserbestraling. De roos kleefstof veroorzaakt geen significante cytotoxische effecten op humane fibroblasten 4 en heeft derhalve een veelbelovende gebruik bij het repareren zacht weefsel in het lichaam, zoals darm en perifere zenuwen. Deze lijm kan ook toepassingen in weefsel engineering kan worden geïntegreerd, bijvoorbeeld in verband met een extracellulaire matrices om weefsel te herstellen en te verbeteren wondgenezing zonder hulp van hechtingen 13. Opgemerkt dat er is geen significante bijwerkingen, inclusief lokale ontsteking geassocieerd met deze procedure waargenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de UWS Research Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 632-69-9 | |
| Chitosan (medium MW) | Sigma-Aldrich | 10318AJ | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 08050051 | 2% v/v in DI water |
| Magnetic stirrer | Heidolph | MR Hei-Mix S | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allegra X-12R | |
| Spectrophotometer | Varian Inc., Agilent | Cary 4000 UV-Visible | |
| Laser | CNI Laser | MGL-532 | |
| Micrometer | Mitutoyo | Series 227 | |
| Surgical microscope | Carl Zeiss, Inc. | OPMI |
References
- O'Neill, A. C., Winograd, J. M. Microvascular anastomosis using a photochemical tissue bonding technique. Lasers Surg. Med. 39, 716-722 (2007).
- Yao, M., Yaroslavsky, A. Phototoxicity is not associated with photochemical tissue bonding of skin. Lasers Surg. Med. 42, 123-131 (2010).
- Lauto, A., Mawad, D. Photochemical Tissue Bonding with Chitosan Adhesive Films. Biomedical Engineering OnLine. 9, 47 (2010).
- Chan, B. P., Kochevar, I. E. Enhancement of porcine skin graft adherence using a light-activated process. J. Surg. Res. 108, 77-84 (2002).
- Lauto, A., Faster, L. J. Sutureless nerve repair with laser-activated chitosan adhesive: a pilot in vivo study. Photomed. Laser Surg. 26, 227-234 (2008).
- Lauto, A., Hook, J. Chitosan adhesive for laser tissue repair: in vitro characterization. Lasers Surg. Med. 36, 193-201 (2005).
- Au, V., Madison, S. A. Effects of singlet oxygen on the extracellular matrix protein collagen: oxidation of the collagen crosslink histidinohydroxylysinonorleucine and histidine. Arch. Biochem. Biophys. 384, 133-142 (2000).
- Encinas, M. V., Rufs, A. M. Xanthene dyes/amine as photoinitiators of radical polymerization: A comparative and photochemical study in aqueous medium. Polymer. 13, 2762-2767 (2009).
- Pini, R., Rossi, F. A new technique for the closure of the lens capsule by laser welding. Ophtalmic Surgery Lasers & Imaging. 39, 260-2626 (2008).
- Wieken, K., Angioi-Duprez, K., Lim, A. Nerve anastomosis with glue: comparative histologic study of fibrin and cyanoacrylate glue. J. Reconstr. Microsurg. 19, 17-20 (2003).
- Menovsky, T., Beek, J. F. Laser, fibrin glue, or suture repair of peripheral nerves: a comparative functional, histological, and morphometric study in the rat sciatic nerve. J. Neurosurg. 95, 694-699 (2001).
- García, P., Jorge, H. E. Comparative study of the mechanical behavior of a cyanoacrylate and a bioadhesive. J. Mater. Sci. Mater. Med. 15, 109-115 (2004).
- Lauto, A. Integration of extracellular matrix with chitosan adhesive film for sutureless tissue fixation. Lasers Surg. Med. 41, 366-371 (2009).
