Fabrication et application de Rose Bengale-chitosane Films à la réparation des tissus au laser

Summary

Les sutures sont généralement nécessaires pour réparer les tissus pendant les interventions chirurgicales. Cependant, leur application peut être problématique car elles sont envahissantes et peuvent endommager les tissus. Les procédés de fabrication et l'application d'un adhésif tissulaire roman sont ici rapportés. Ce film adhésif est activé par laser et ne nécessite pas l'utilisation de fils de suture.

Abstract

Soudure tissulaire photochimique (PTB) est une technique de suture pour la réparation des tissus, ce qui est obtenu en appliquant une solution au rose bengale (RB) entre deux bords de tissu ^1,2. Ceux-ci sont ensuite irradiés par un laser qui est sélectivement absorbée par le RB. Les réactions photochimiques résultant prétendument réticuler les fibres de collagène dans le tissu avec ³ la production de chaleur minimale. Dans le présent rapport, RB a été incorporé dans des films minces de chitosane pour fabriquer une colle tissulaire roman qui est activée par laser. Des films adhésifs, sur la base de chitosane et contenant ~ 0,1% en poids, RB sont fabriqués et liée à d'intestin de veau et nerfs tibiaux rat par un laser à l'état solide (λ = 532 nm, la fluence ~ 110 J / cm ^2, la taille de tache ~ 0,5 cm) . Un tensiomètre à colonne unique, en interface avec un ordinateur personnel, est utilisé pour tester la résistance de liaison. Les obligations RB-chitosane adhésives fermement à l'intestin avec une force de 15 ± 6 kPa, (n = 30). La force d'adhérence diminue à 2 etplusmn; 2 kPa (n = 30) lorsque le laser n'est pas appliquée à l'adhésif. L'anastomose des nerfs tibial peut être également réalisé sans l'utilisation de fils de suture. Un nouveau chitosane adhésif qui a été fabriqué à des liaisons photochimique tissu et ne nécessite pas de sutures.

Protocol

1. Chitosan adhésif Préparation

1. La poudre de chitosane est soluble dans une solution d'acide acétique, pour la préparation d'une solution mère d'acide acétique (2% v / v), ajouter 10 ml d'acide acétique glacial à 490 ml d'eau désionisée (DI-H ₂ O).
2. Pour la préparation d'une solution mère de Rose Bengale (RB) (0,01% p / v) dans de l'acide acétique, pèse 5 mg de RB dans un flacon enveloppé d'une feuille d'aluminium pour éviter photoblanchiment. Ajouter 0,5 ml de DI-H ₂ O pour dissoudre la poudre puis ajouter 49,5 ml de la solution mère d'acide acétique (décrit dans la section 1.1).
3. Pour la préparation d'une solution de chitosan (1,7% v / v), 0,85 g de poids de poudre de chitosane (MW moyen, le degré d'acétylation de 85%) et ajoute à 50 ml d'une solution d'acide acétique RB. Le contrôle a été préparé par dissolution du chitosane dans une solution d'acide acétique sans RB.
4. Ajouter un agitateur magnétique au mélange chitosane et agiter à la température ambiante. Pour assurer la dissolution complète des composants, mélanger le chitosanedans l'acide acétique + RB pour deux semaines et le chitosan dans l'acide acétique pendant 5 jours (témoin). Quand le chitosane est dissous, le pH de la solution augmente de ~ 2,6 à ~ 3,9. Noter que RB est peu soluble à pH acide et il nécessite une augmentation du pH de la solution et une période prolongée sous agitation pour dissoudre.
5. Centrifuger les solutions à 3270 xg pendant 1 heure et recueillir le surnageant en utilisant, par exemple, une seringue stérile de 10 ml. Assurez-vous de ne pas perturber le culot impureté. Au cours de cette étape, la solution est nettoyé des impuretés macroscopiques et de la matière insoluble.
6. Injecter la solution (centrifugation) chitosane sur une dalle plate Perpex coulé à l'aide d'une seringue stérile. L'épaisseur du film sec est fonction du rapport entre la quantité distribuée de la solution et la surface sur laquelle la solution est étalée. Faire en sorte que la solution est exempte de bulles d'air et également répartis sur la dalle. Pour obtenir des films minces d'une épaisseur ~ um 13, injecter la solution ~ 1 ml de plus de 12 cm ² de surfacezone (dimensions 3x4 cm ~, figure 1A).
7. Couvrir la plaque en plexiglas avec un écran, en feuille d'aluminium, par exemple, pour éviter photoblanchiment de la solution. Faire en sorte que suffisamment d'air de ventilation est assurée à sécher la solution sous l'écran.
8. Laisser la solution sécher à la température ambiante (25 ° C) et de pression (1 atm) jusqu'à ce que le film résultant est insoluble dans l'eau et ne gonfle pas macroscopiquement. Ceci est généralement réalisé en 2 semaines.
9. Détachez les films avec soin à l'aide d'une spatule mince et plat: ces films peuvent être facilement décollée de la plaque en plexiglas sans les endommager.
10. Mesurer l'épaisseur des films à l'aide d'un micromètre.
11. Coupez l'adhésif en bandes rectangulaires avec un ciseau tranchant propre et placez-les entre des lames de verre stériles pour préserver leur forme plate. Enveloppez les lames dans du papier aluminium pour protection contre la lumière et les conserver à la température ambiante. Étiqueter les adhésifs avec ou sans RB comme "rose adhésif" ou "ADHES chitosaneive "respectivement.
12. La rose des films adhésifs peuvent être stérilisés à l'aide d'éthanol (90%) ou avec un rayonnement gamma (0,1 kGy / h pendant 24 h) ^4,5.

2. Adhésif atténuation optique

1. Fixer la colle rose à l'intérieur d'une cuve en quartz.
2. Enregistrer le spectre atténué dans la plage de 400 à 800 nm en utilisant un spectrophotomètre à double faisceau ^4.
3. En supposant que la validité de la loi de Beer, calculer la longueur d'atténuation de l'adhésif comme suit: I = I ₀ ^e-Ax où I ₀ est l'intensité du faisceau incident, 1 / A est la longueur d'atténuation, et x est l'épaisseur du film.
4. Répétez les étapes 2,1 à 2,3 pour l'adhésif de chitosane pour servir de contrôle.

3 Dans d'application in vitro:. Collage de tissus au laser sur Intestin

1. Intestin de veau récolte immédiatement après l'euthanasie des animaux et conserver à -80 ° C.
2. Avant utilisation, décongeler et hydrater la tiDITION en l'immergeant dans DI-H ₂ O pendant 10 min.
3. Bissecter le tissu en sections (2 x 1 cm) à l'aide d'une lame n ° 10 sous microscope opératoire (x10). Maintenir l'humidité sections en utilisant DI-H ₂ O.
4. Apportez les souches incision rapprochés (bout à bout). Essuyez l'excès d'eau sur la surface à l'aide des conseils du coton.
5. Placer une bande adhésive rose (10 x 6 mm) à travers l'incision sur la couche séreuse avec microforceps assurant le contact complet avec l'intestin (Figure 2).
6. L'adhérence de l'adhésif tissu rose est activé par un pompage par diode laser à l'état solide, qui est couplé à une fibre optique multimode (diamètre du noyau 200 um) ^4.
7. Réglez le niveau de puissance du laser à 180 mW et d'irradier l'adhésif pour ~ 6 min avec une taille de spot lumineux de ~ 5 mm, en utilisant les paramètres indiqués dans le tableau 1. Place irradier l'adhésif en sorte que chaque spot est irradié pendant environ 5 secondes avant de déplacer le faisceau à l'endroit adjacent. Tson procédé garantit que le faisceau laser balaie toute la surface de l'adhésif plusieurs fois.
8. Pour évaluer la force de collage de tissus, serrer un échantillon à un tensiomètre seule colonne calibrée (Instron, MA, USA) en utilisant poignées mécaniques. Déplacez les poignées à 22 mm / min jusqu'à ce que les deux souches de tissus séparés ^4.
9. Placez un adhésif rose sur le tissu comme décrit à l'étape 3.5. Ne pas irradier l'échantillon et à mesurer la résistance de liaison du tissu comme décrit dans l'étape 3,8. Cet échantillon sert de témoin.

4 Dans demande Vivo:. Anastomose nerf tibial

1. Calmer le rat Wistar avec de l'isoflurane / O ₂ mélange (4% pendant l'induction, 2% par la suite) ^5. Voie sous-cutanée injecter Buprenex (0,03 mg / kg) pour fournir intra-opératoire activité analgésique et soulager la douleur ou d'inconfort possible.
2. La procédure suivante chirurgicale doit être réalisée sous microscope opératoire (x10). Faire une peau obliqueincision d'environ 3 cm de long dans la partie dorso-latérale de la cuisse droite et exposer le nerf tibial avec une approche de division des muscles dans les muscles fessiers ^2.
3. Partiellement décortiquer et couper l'adventice du nerf tibial à l'aide de micro-ciseaux droits et absorber l'excès d'eau avec une gaze stérile ou des conseils en coton.
4. Couper le nerf tibial avec des micro-ciseaux.
5. Placez une solution stérile de chitosan bande (dimensions 5 x 4 mm) en dessous du nerf tibial à l'aide de micro-pince.
6. Rapprochant les souches nerveuses de bout en bout avec les micro-pince sur la bande adhésive rose.
7. La bande adhère pleinement à la formation d'une collerette nerveuse, qui peut aider à la rotation du nerf lors de l'irradiation laser de la bande.
8. Activer la rose adhésif avec le laser comme décrit dans les étapes 3.6) et 3.7).
9. Coupez l'adhésif double emploi a augmenté depuis le collier le nerf opéré.
10. Fermez les muscles et la peau avec cinq points de suture 3-0 ^5. Les procédures standards de récupération post-opératoires doivent être observées, y compris l'inspection quotidienne de déhiscence ou la formation de pus et de l'administration d'analgésiques, si nécessaire.

5. Les résultats représentatifs

Les films obtenus sont rose vif en couleur, mince et avoir une surface lisse (Figure 1). Ils sont également plus souples et peuvent être roulées dans des tubes de petit diamètre sans larmes qui causent ou tout autre dommage apparent (figure 1B). L'adhésif rose a deux pics d'absorption à 530 et 562 nm; le laser vert est donc fortement absorbée par l'adhésif et la longueur d'atténuation correspondant à 532 nm est de ~ 12 um (figure 3). En revanche, le chitosan films sans RB atténue faiblement le laser (1 / A 162 ~ um), probablement en raison de la diffusion. Il ressort de l'intrigue spectres qu'aucune agrégation significative de RB se produit dans les films.

La rose des liaisons adhésives fermementà l'intestin lors d'une irradiation par laser (figure 2) la réalisation d'une caractéristique de charge maximale à la rupture de 0,9 ± 0,4 N (n = 30). La force d'adhérence a été estimé que la charge maximale divisée par la surface adhésive, à savoir ± 15 6 kPa (n = 30). L'adhésif non irradié rose collé beaucoup moins de tissu (2 ± 2 kPa, n = 30, test t non apparié p <10 ^6). L'anastomose in vivo du nerf tibial a été réalisée avec succès après l'application et le collage de l'adhésif rose en liaison avec le laser vert. Une semaine après l'opération, le nerf opéré était dans la continuité et la solidité de réparation était de 17 ± 9 kPa (n = 10).

Figure 1. A) La solution RB-chitosane est coulé sur une dalle plate en plexiglas (épaisseur de la dalle ~ 5 mm). Papier millimétré est placé sous la dalle de faciliter l'étape sèche-cast. Le f insoluble dans l'eauilm est obtenue de deux semaines après la coulée. B) L'adhésif rose est flexible et peut être roulé dans un cylindre de petite taille.

Figure 2. L'adhésif est collé à la rose intestin de veau après l'irradiation laser. Irradiation uniforme est appliquée sur l'adhésif pendant RB liaison tissulaire; toutefois taches sélectionnés sont présentés dans cette image pour illustrer l'effet photo-blanchiment du laser sur l'adhésif.

Figure 3. Le spectre d'absorption (en unités arbitraires) de l'adhésif rose montre deux pics à 530 et 562 nm. Le laser vert (λ = 532 nm) est donc fortement absorbée par l'adhésif lors de l'exposition au laser. L'adhésif sans chitosane RB absorbe mal du faisceau laser.

	n	2)	Puissance (W)	Temps (s)	Fluence (J / cm 2)	I (W / cm 2)	Charge Max / zone (kPa)
Adhésif + Laser	30	60 ± 10	0,18 ± 0,03	365 ± 5	~ 110	~ 0,9	15 ± 1
Adhésif	30	60 ± 10	NA	NA	NA	NA	2 ± 2

Tableau 1. Légende. n, le nombre d'échantillons; Area, surface de l'adhésif rose (moyenne ± erreur maximum); Puissance, la puissance du laser (moyenne ± erreur maximum); Time, temps d'irradiation (moyenne ± erreur maximum); Fluence, la fluence laser moyenne, moi, estimée irradiance; maxi / zone, la charge maximale à la rupture du tissu réparé divisée par la surface adhésive (moyenne ± SE).

Discussion

Le rose adhésif fabrication est basé sur un simple processus de fonte à sec, mais la dissolution de RB à pH acide sous agitation prolongée nécessite de la solution de chitosane. Il est important de laisser la solution sécher jusqu'à ce qu'il devienne un film insoluble dans l'eau. Cela se produit lorsque la teneur en eau du poids est environ 10% dans le film sec ^6. Des films insolubles sont généralement obtenus 2 semaines après la coulée à sec dans des conditions standard de température et de pression (~ 25 ° C et ~ 1 atm). Le mécanisme de la soudure tissulaire n'est pas encore clair, mais il a été observé que diffuse RB de la colle dans le tissu adjacent, permettant au laser pour le photo-activer efficacement à l'interface des tissus. Il peut être supposé que la capacité RB de production d'oxygène singulet, lors d'une irradiation lumineuse, peut jouer un rôle dans le collagène des tissus de réticulation et le chitosane via leurs groupes amino ^7,8. Une étude récente sur l'adhésif rose a également montré que la température maximale atteinte pendant le tissue-adhésif de collage était d'environ 32 ° C, supportant l'hypothèse d'un processus photochimique ^4. D'autres techniques de suture pour la réparation tissulaire sont actuellement examinées par plusieurs groupes de recherche. Soudage au laser des tissus (LTW) par exemple, a été appliquée avec succès en chirurgie ophtalmique par Pini et al ^9. En général cependant, LTW peut causer des dommages collatéraux thermique la température des tissus peut atteindre 65-75 ° C pendant l'irradiation laser. Colles cyanoacrylates sont également appliqués en clinique pour fermer les plaies cutanées au lieu de sutures, et pourtant ils ne sont généralement pas utilisés pour la réparation des organes internes en raison de leur toxicité ^10. Bien que la colle rose (~ 15 kPa) a une plus grande résistance de liaison que les colles de fibrine (~ 8 kPa) ^11, colles à base de cyanoacrylate encore fournir la plus forte adhérence (~ 150 kPa) ^12. L'épaisseur de l'adhésif rose nécessite une attention particulière lors de la fabrication: un adhésif épais (≥ 20 mm) serait, par exemple, empêcher le laserd'atteindre l'interface avec le tissu et affaiblirait la résistance de liaison en raison d'une absorption excessive du laser par le rose bengale. Un adhésif mince (<10 um), d'autre part, augmenterait le rayonnement laser et la fluence à l'interface adhésif-tissu. Cependant, il faut veiller à réduire l'épaisseur du film, afin d'éviter un échauffement excessif du tissu pendant l'irradiation laser. L'adhésif rose induit aucun effet significatif cytotoxiques sur des fibroblastes humains ⁴ et a donc une utilisation prometteuse dans la réparation des tissus mous à l'intérieur du corps, tels que l'intestin et les nerfs périphériques. Cet adhésif peut également avoir des applications en ingénierie tissulaire: Il peut être intégré, par exemple, dans un bandage avec des matrices extracellulaires pour réparer les tissus et améliorer la cicatrisation de la plaie sans l'aide de points de suture ^13. Il convient de noter que nous n'avons pas observé d'effets négatifs importants, y compris une inflammation localisée, à être associés à cette procédure.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rose Bengal	Sigma-Aldrich	632-69-9
Chitosan (medium MW)	Sigma-Aldrich	10318AJ
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	08050051	2% v/v in DI water
Magnetic stirrer	Heidolph	MR Hei-Mix S
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allegra X-12R
Spectrophotometer	Varian Inc., Agilent	Cary 4000 UV-Visible
Laser	CNI Laser	MGL-532
Micrometer	Mitutoyo	Series 227
Surgical microscope	Carl Zeiss, Inc.	OPMI