Bioengineering

निर्माण और गुलाब बंगाल chitosan फिल्म्स की लेजर ऊतकों की मरम्मत में आवेदन

Published: October 23, 2012 doi: 10.3791/4158

Antonio Lauto¹, Marcus Stoodley², Matthew Barton¹, John W. Morley¹, David A. Mahns¹, Leonardo Longo³, Damia Mawad¹

¹Bioelectronics and Neuroscience (BENS) research group, University of Western Sydney, NSW Australia, ²Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, NSW Australia, ³School of Medicine, University of Siena, Italy

Summary

Sutures आमतौर शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं के दौरान ऊतकों की मरम्मत की जरूरत है. हालांकि, उनके आवेदन समस्याग्रस्त हो सकता है के रूप में वे आक्रामक हैं और ऊतकों को नुकसान हो सकता है कर सकते हैं. एक उपन्यास ऊतक चिपकने के निर्माण और आवेदन के तरीकों यहाँ रिपोर्ट कर रहे हैं. यह चिपकने वाला फिल्म लेजर सक्रिय है और sutures के उपयोग की आवश्यकता नहीं है.

Abstract

Photochemical ऊतक संबंध (PTB) ऊतकों की मरम्मत, जो दो ऊतक किनारों ^{1,2 के} बीच गुलाब बंगाल (आरबी) के एक समाधान को लागू करने से हासिल की है के लिए एक sutureless तकनीक है. ये तो एक लेजर कि चुनिंदा आरबी द्वारा अवशोषित कर लेता है विकिरणित हैं. परिणामस्वरूप photochemical प्रतिक्रियाओं माना जाता है कि कम से कम गर्मी उत्पादन ^{3 के} साथ ऊतकों में कोलेजन फाइबर Crosslink. इस रिपोर्ट में, आरबी पतली chitosan फिल्मों में शामिल किया गया है के लिए एक उपन्यास ऊतक चिपकने वाला है कि लेजर सक्रिय बनाना. चिपकने वाली फिल्मों, chitosan और ~ 0.1% wt आरबी युक्त पर आधारित है, गढ़े और एक ठोस राज्य लेजर (λ = 532 एनएम, Fluence ~ 110 जम्मू / ² सेमी स्थान आकार ~ 0.5 सेमी) बछड़ा आंत और चूहे tibial नसों को बंधुआ . एक tensiometer एकल - स्तंभ, एक पर्सनल कंप्यूटर के साथ interfaced संबंध ताकत का परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. आरबी chitosan 15 की एक ताकत ± 6 kPa (एन 30 =) के साथ चिपकने वाला मजबूती से आंत के लिए बांड. आसंजन ताकत & 2 के लिए चला जाता हैplusmn; 2 kPa (n = 30) जब लेजर चिपकने के लिए लागू नहीं है. tibial नसों के सम्मिलन भी sutures के उपयोग के बिना पूरा किया जा सकता है. एक उपन्यास chitosan चिपकने वाला गढ़े किया गया है कि बांड photochemically ऊतकों को और sutures की आवश्यकता नहीं है.

Protocol

1. Chitosan चिपकने वाला तैयारी

chitosan पाउडर एसिटिक एसिड के घोल में घुलनशील है, एसिटिक एसिड (2% v / v) के एक शेयर समाधान की तैयारी के लिए, 490 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी ₍₂ डि एच ओ) से 10 मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक एसिड जोड़ें.
गुलाब (आरबी) (0.01% w / v) एसिटिक एसिड में बंगाल के एक शेयर समाधान की तैयारी के लिए एक एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपटे photobleaching से बचने शीशी में आरबी की 5 मिलीग्राम तौलना. पाउडर तो भंग एसिटिक एसिड स्टॉक समाधान (1.1 खंड में वर्णित) के 49.5 मिलीलीटर जोड़ने डि एच ₂ हे के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें.
Chitosan समाधान (1.7% w / v) की तैयारी के लिए, chitosan पाउडर (मध्यम मेगावाट, एसिटिलीकरण के 85% की डिग्री) 0.85 ग्राम वजन और आरबी एसिटिक एसिड समाधान के 50 मिलीलीटर जोड़ें. नियंत्रण एसिटिक एसिड के घोल में आरबी बिना chitosan भंग द्वारा तैयार किया गया था.
Chitosan मिश्रण करने के लिए एक चुंबकीय दोषी जोड़ें और कमरे के तापमान पर हलचल. घटकों का पूरा विघटन सुनिश्चित करने के लिए, chitosan हलचल+ एसिटिक एसिड में दो सप्ताह और 5 दिनों के लिए एसिटिक एसिड में chitosan (नियंत्रण) के लिए आरबी. जब chitosan भंग कर रहा है, समाधान पीएच ~ 2.6 से 3.9 ~ बढ़ जाती है. ध्यान दें कि आरबी खराब अम्लीय पीएच में घुलनशील है और यह समाधान के पीएच और एक विस्तारित क्रियाशीलता को भंग करने के लिए समय में एक वृद्धि की आवश्यकता है.
1 घंटा के लिए 3270 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र और तैरनेवाला इकट्ठा का उपयोग कर, उदाहरण के लिए, एक बाँझ 10 मिलीलीटर सिरिंज. सुनिश्चित करें कि अशुद्धता गोली परेशान नहीं. इस चरण के दौरान, समाधान macroscopic दोष और अघुलनशील बात से साफ किया जाता है.
बाँझ सिरिंज का उपयोग कर एक फ्लैट perpex पटिया पर (Centrifuged) chitosan समाधान सुई. फिल्म के सूखे मोटाई समाधान के तिरस्कृत राशि और सतह क्षेत्र से अधिक समाधान फैला हुआ है के बीच अनुपात पर निर्भर करता है. सुनिश्चित करें कि समाधान हवाई बुलबुले से मुक्त है और समान रूप से स्लैब पर फैल. ~ 13 माइक्रोन मोटाई के साथ पतली फिल्मों को प्राप्त करने के लिए, 12 सेमी ² सतह पर ~ 1 मिलीलीटर समाधान इंजेक्षनक्षेत्र (आयाम ~ 3x4 सेमी, चित्रा 1 ए).
एक स्क्रीन के साथ Perspex पटिया, उदाहरण के लिए एल्यूमीनियम पन्नी से बना है, को कवर करने के लिए समाधान के photobleaching से बचने के लिए. सुनिश्चित करें कि पर्याप्त हवा वेंटिलेशन के लिए स्क्रीन के नीचे समाधान सूखी गारंटी है.
परिणामस्वरूप फिल्म पानी में अघुलनशील है और है macroscopically प्रफुल्लित नहीं तक कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) और दबाव (1 एटीएम) पर सूखे का समाधान छोड़ दें. यह आम तौर पर 2 हफ्तों में हासिल की है.
ध्यान से एक पतली और फ्लैट रंग का उपयोग फिल्मों को अलग: इन फिल्मों को नुकसान पहुँचाए बिना उन्हें आसानी से किया जा सकता है Perspex स्लैब से खुली.
एक micrometer का उपयोग फिल्मों की मोटाई मापने.
एक साफ तेज कैंची से काटना के साथ आयताकार स्ट्रिप्स में चिपकने वाला कट और उन्हें बाँझ गिलास स्लाइड के बीच जगह के लिए अपने फ्लैट आकार की रक्षा. एल्यूमीनियम पन्नी में स्लाइड प्रकाश परिरक्षण के लिए लपेटें और उन्हें कमरे के तापमान पर स्टोर. लेबल के साथ या बिना आरबी चिपकने के रूप में या "chitosan adhes" चिपकने वाला गुलाब "ive क्रमशः ".
गुलाब चिपकने वाली फिल्मों इथेनॉल (90%) का उपयोग कर या गामा विकिरण (0.1 / KGy 24 घंटे के लिए ज) ^{4,5 के} साथ निष्फल किया जा सकता है.

2. चिपकने वाला ऑप्टिकल क्षीणन

फिक्स एक क्वार्ट्ज क्युवेट अंदर गुलाब चिपकने वाला.
800 एनएम का उपयोग कर एक दोहरी बीम ⁴ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर - 400 की रेंज में अपनी तनु स्पेक्ट्रम रिकार्ड.
मान लिया जाये कि बीयर कानून की वैधता, चिपकने के क्षीणन लंबाई की गणना के रूप में इस प्रकार है: मैं मैं = ₀ ई ^{- कुल्हाड़ी} जहाँ मैं ₀ घटना किरण तीव्रता, 1 / क्षीणन लंबाई है, और एक्स फिल्म मोटाई है.
Chitosan चिपकने के लिए 2.3 से 2.1 के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए कदम दोहराएँ.

इन विट्रो ऍप्लिकेशन 3: आंत पर लेजर ऊतक संबंध

हार्वेस्ट बछड़ा आंत तुरंत बाद पशु इच्छामृत्यु और -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस
उपयोग करने के लिए पिछले defrost, और हाइड्रेट तीयह 10 मिनट के लिए डि एच ₂ हे में डुबो कर ssue.
(2 एक्स 1 सेमी) वर्गों एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप (x10) के तहत एक # 10 ब्लेड का उपयोग कर में ऊतक द्विविभाजित. वर्गों डि एच ₂ ओ का उपयोग नम रखें
चीरा स्टंप के पास एक साथ लाना (अंत करने के लिए अंत). कपास युक्तियों का उपयोग सतह से अतिरिक्त पानी से साफ कर लें.
Serosa परत पर चीरा भर microforceps आंत (2 चित्रा) के साथ पूर्ण संपर्क सुनिश्चित करने के साथ एक गुलाब चिपकने वाली पट्टी (10 x 6 मिमी) रखें.
गुलाब चिपकने के ऊतक आसंजन एक डायोड पंप ठोस राज्य लेजर, जो एक बहुपद्वति ऑप्टिकल फाइबर (कोर व्यास 200 सुक्ष्ममापी) ⁴ के लिए युग्मित है से सक्रिय है.
लेजर की 180 मेगावाट बिजली का स्तर सेट और ~ ~ 5 मिमी की एक बीम स्थान आकार के साथ 6 मिनट, तालिका 1 में सूचीबद्ध मापदंडों का उपयोग करने के लिए चिपकने वाला चमकाना. स्पॉट चमकाना चिपकने वाला यह सुनिश्चित करना है कि हर जगह ~ 5 सेकंड के लिए आसन्न हाजिर करने के लिए बीम चलती से पहले विकिरणित है. टीउसकी प्रक्रिया की गारंटी देता है कि लेजर बीम चिपकने वाला कई बार की पूरी सतह क्षेत्र स्कैन.
ऊतक संबंध ताकत का आकलन करने के लिए, एक calibrated एकल स्तंभ (Instron, MA, संयुक्त राज्य अमेरिका) tensiometer यांत्रिक पकड़ती का उपयोग करने के लिए एक नमूना क्लैंप. / दो ऊतक ⁴ अलग स्टंप तक 22 मिमी मिनट में पकड़ ले जाएँ.
ऊतक पर एक गुलाब चिपकने वाला 3.5 चरण में वर्णित के रूप में रखें. चमकाना और नहीं नमूना ऊतक संबंध शक्ति को मापने के रूप में 3.8 चरण में वर्णित है. यह नमूना एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है.

Vivo आवेदन में 4: tibial तंत्रिका सम्मिलन

शांत isoflurane हे / ₂ (अधिष्ठापन के दौरान 4%, उसके बाद 2%) मिश्रण ^{5 के} साथ Wistar चूहे. Subcutaneously Buprenex (0.03 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्षन अंतर ऑपरेटिव एनाल्जेसिक गतिविधि प्रदान और संभव दर्द या बेचैनी को कम.
निम्नलिखित शल्य प्रक्रिया एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप (x10) के तहत किया जाना चाहिए. एक परोक्ष त्वचासही जांघ के dorso पार्श्व भाग में 3 लंबी और gluteal ² मांसपेशियों के माध्यम से एक मांसपेशी बंटवारे दृष्टिकोण के साथ tibial तंत्रिका बेनकाब सेमी के बारे में चीरा.
आंशिक रूप से काटना और tibial तंत्रिका सीधे माइक्रो कैंची का उपयोग करने की बाह्यकंचुक ट्रिम और बाँझ धुंध या कपास सुझावों के साथ अतिरिक्त पानी को अवशोषित.
माइक्रो कैंची के साथ tibial तंत्रिका कट.
Tibial तंत्रिका सूक्ष्म संदंश का उपयोग कर के नीचे एक बाँझ chitosan पट्टी (5 आयाम x 4 मिमी) स्थिति.
लगभग तंत्रिका स्टंप गुलाब चिपकने वाली पट्टी पर सूक्ष्म संदंश के साथ अंत करने के लिए अंत.
पट्टी तंत्रिका एक कॉलर, है जो तंत्रिका के रोटेशन के साथ पट्टी के लेजर विकिरण के दौरान सहायता कर सकते हैं बनाने के लिए पूरी तरह पालन करता है.
सक्रिय करें लेजर के साथ चिपकने वाला गुलाब 3.6 चरणों में वर्णित के रूप में) और 3.7).
छाँटो संचालित तंत्रिका के कॉलर से निरर्थक गुलाब चिपकने वाला.
पाँच 3-0 ⁵ sutures के साथ मांसपेशियों और त्वचा बंद करें. मानक पोस्ट ऑपरेटिव वसूली प्रक्रिया dehiscence या मवाद गठन और एनाल्जेसिक प्रशासन के लिए दैनिक निरीक्षण सहित पालन किया जाना चाहिए, यदि आवश्यक.

5. प्रतिनिधि परिणाम

फिल्मों है कि प्राप्त कर रहे हैं रंग में उज्ज्वल गुलाब, पतली और चिकनी सतह (1 चित्रा) हैं. उन्होंने यह भी लचीला और छोटे व्यास के ट्यूबों में आँसू के कारण या किसी अन्य स्पष्ट क्षति (चित्रा 1 बी) के बिना लुढ़का कर सकते हैं. गुलाब चिपकने वाला 530 और 562 एनएम पर दो अवशोषण चोटियों है, हरे रंग की लेजर इस प्रकार दृढ़ता से और 532 एनएम पर इसी क्षीणन लंबाई चिपकने वाला द्वारा अवशोषित कर लेता है ~ 12 सुक्ष्ममापी (3 चित्रा) है. इसके विपरीत, आरबी बिना chitosan फिल्मों कमजोर लेजर (1 / A ~ 162 सुक्ष्ममापी) attenuates, संभावना बिखरने की वजह से. यह स्पेक्ट्रा साजिश से प्रतीत होता है कि आरबी का कोई महत्वपूर्ण एकत्रीकरण फिल्मों में होता है.

चिपकने वाला बांड दृढ़ता से गुलाबलेजर विकिरण पर आंत (2 चित्रा) 0.9 की विफलता पर एक ठेठ अधिकतम लोड ± 0.4 N (एन 30 =) को प्राप्त करने. चिपकने वाला शक्ति चिपकने वाली सतह अर्थात्, क्षेत्र 15 से विभाजित अधिकतम लोड ± 6 kPa (एन 30 =) के रूप में अनुमान लगाया गया था. गैर विकिरणित गुलाब चिपकने वाला ऊतकों को काफी कम (2 ± 2 kPa बंधुआ, n = 30, unpaired टी परीक्षण 10 ⁶ <पी). tibial तंत्रिका में vivo सम्मिलन सफलतापूर्वक आवेदन और हरे रंग की लेजर के साथ संयोजन के रूप में गुलाब के चिपकने के संबंध के बाद हासिल की थी. एक सप्ताह postoperatively, संचालित तंत्रिका निरंतरता में था और मरम्मत ताकत था 17 ± 9 kPa (एन 10 =).

चित्रा 1 ए) आरबी chitosan समाधान एक फ्लैट Perspex स्लैब (स्लैब ~ 5 मिमी मोटाई) पर casted है. ग्राफ़ पेपर स्लैब के नीचे रखा जाता है सूखी डाली कदम की सुविधा है. च जल अघुलनशीलइल्म कास्टिंग दो सप्ताह के बाद प्राप्त होता है. बी) गुलाब चिपकने वाला लचीला है और एक छोटे सिलेंडर में लुढ़का दिया जा सकता है.

चित्रा 2. गुलाब चिपकने वाला लेजर विकिरण के बाद बछड़ा आंत को बंधुआ है. वर्दी विकिरण आरबी चिपकने वाला ऊतक संबंध के दौरान लागू किया जाता है, लेकिन चयनित स्थानों इस चित्र में दिखाए जाते हैं चिपकने वाला पर लेजर की तस्वीर विरंजन प्रभाव वर्णन.

चित्रा 3 गुलाब चिपकने के अवशोषण स्पेक्ट्रम (मनमाना इकाइयों में) 530 और 562 एनएम पर दो चोटियों से पता चलता है. हरे रंग की लेजर (λ = 532 एनएम) है इस प्रकार जोरदार प्रदर्शन के दौरान लेजर चिपकने द्वारा अवशोषित. आरबी बिना chitosan चिपकने वाला खराब लेजर बीम को अवशोषित कर लेता है.

	n	(2 मिमी) ट्रोंग	पावर (डब्ल्यू)	समय (ओं)	Fluence (जम्मू / ² सेमी)	मैं (डब्ल्यू / ² सेमी)	अधिकतम लोड / Area (kPa)
चिपकने वाला + लेजर	30	60 ± 10	0.18 ± 0.03	365 ± 5	~ 110	0.9 ~	15 ± 1
चिपकने वाला	30	60 ± 10	NA	NA	NA	NA	2 ± 2

1 टेबल लीजेंड. n, नमूना संख्या, क्षेत्र, गुलाब चिपकने वाला (± अधिकतम त्रुटि मतलब है) की सतह क्षेत्र, पावर, लेजर शक्ति (± अधिकतम त्रुटि का मतलब), समय, विकिरण समय (± अधिकतम त्रुटि मतलब है); Fluence, औसत लेजर fluence, मैं, अनुमानित IRRadiance; / लोड Area मैक्स, मरम्मत चिपकने वाली सतह क्षेत्र द्वारा विभाजित ऊतक की विफलता पर अधिकतम भार (± एसई मतलब है).

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Discussion

गुलाब चिपकने वाला एक साधारण प्रक्रिया सूखी डाली निर्माण पर आधारित है, हालांकि अम्लीय पीएच में आरबी के विघटन chitosan समाधान के लंबे समय तक क्रियाशीलता की आवश्यकता है. यह महत्वपूर्ण है कि समाधान सूख जब तक यह एक फिल्म जल अघुलनशील हो जाता है. यह तब होता है जब वजन पानी सामग्री ~ सूखे ⁶ फिल्म में 10% है. अघुलनशील फिल्मों में आमतौर पर तापमान और दबाव (~ 25 डिग्री सेल्सियस और ~ 1 एटीएम) की मानक स्थितियों में सूखी कास्टिंग 2 सप्ताह के बाद प्राप्त की. ऊतक संबंध का तंत्र अभी तक स्पष्ट नहीं है, हालांकि यह देखा गया है कि यह ऊतक इंटरफेस में आसन्न ऊतकों में चिपकने से आरबी diffuses, लेजर अनुमति देता है कुशलतापूर्वक फोटो सक्रिय. यह अनुमान लगाया जा सकता है कि स्वेटर ऑक्सीजन के उत्पादन के आरबी की क्षमता, प्रकाश विकिरण पर, अपने अमीनो ^7,8 समूहों के माध्यम से crosslinking ऊतक कोलेजन और chitosan में एक भूमिका निभा सकते हैं. गुलाब चिपकने वाला पर हाल ही में एक अध्ययन में यह भी पता चला है कि आज़ादी के दौरान अधिकतम तापमान हासिलमुकदमा चिपकने वाला संबंध ~ 32 डिग्री सेल्सियस था, एक photochemical ⁴ प्रक्रिया की परिकल्पना का समर्थन है. ऊतकों की मरम्मत के लिए अन्य sutureless तकनीक वर्तमान में कई अनुसंधान समूहों द्वारा जांच कर रहे हैं. लेजर उदाहरण के लिए ऊतक वेल्डिंग (LTW) सफलतापूर्वक किया गया है Pini एट अल ⁹ द्वारा नेत्र शल्य चिकित्सा में लागू होता है. सामान्य में हालांकि, LTW संपार्श्विक थर्मल क्षति के कारण के रूप में ऊतक लेजर विकिरण के दौरान तापमान 65-75 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच सकते हैं कर सकते हैं. Cyanoacrylate glues भी चिकित्सकीय लागू कर रहे हैं sutures के बजाय त्वचा के घावों को बंद, फिर भी वे आम तौर पर उनके ¹⁰ विषाक्तता के कारण आंतरिक अंग की मरम्मत के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं. हालांकि गुलाब चिपकने वाला (~ 15 केपीए) उच्च आतंच glues से संबंध ताकत (~ 8 kPa) ^11, cyanoacrylate glues अभी भी मजबूत आसंजन ¹² (~ 150 kPa) प्रदान करते हैं. चिपकने के गुलाब मोटाई निर्माण के दौरान विशेष रूप से ध्यान देने की आवश्यकता है: एक मोटी चिपकने वाला (≥ 20 सुक्ष्ममापी), उदाहरण के लिए, लेजर को रोका जा सकेसे ऊतक इंटरफ़ेस तक पहुँचने और संबंध गुलाब बंगाल लेजर की अत्यधिक अवशोषण के कारण शक्ति कमजोर होगा. एक पतली चिपकने वाला (<10 सुक्ष्ममापी), दूसरे हाथ पर, चिपकने वाला ऊतक इंटरफ़ेस में लेजर विकिरण और प्रभाव में वृद्धि होगी. हालाँकि, ध्यान फिल्म मोटाई कम करने में लिया किया जाना चाहिए क्रम में लेजर विकिरण के दौरान ऊतक के अत्यधिक ताप को रोकने के लिए. गुलाब चिपकने वाला मानव ⁴ fibroblasts पर कोई महत्वपूर्ण साइटोटोक्सिक प्रभाव लाती है और इस प्रकार शरीर के अंदर आंत और परिधीय नसों जैसे नरम ऊतक की मरम्मत में एक आशाजनक इस्तेमाल किया है. यह चिपकने वाला ऊतक इंजीनियरिंग में भी आवेदन कर सकते हैं: यह कोशिकी matrices के साथ एक पट्टी के ऊतकों की मरम्मत और ¹³ sutures की सहायता के बिना घाव भरने बढ़ाने में उदाहरण के लिए, एकीकृत किया जा सकता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हम स्थानीय सूजन सहित किसी भी महत्वपूर्ण प्रतिकूल प्रभाव, इस प्रक्रिया के साथ जुड़े होने की नहीं मनाया है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम UWS अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rose Bengal	Sigma-Aldrich	632-69-9
Chitosan (medium MW)	Sigma-Aldrich	10318AJ
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	08050051	2% v/v in DI water
Magnetic stirrer	Heidolph	MR Hei-Mix S
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allegra X-12R
Spectrophotometer	Varian Inc., Agilent	Cary 4000 UV-Visible
Laser	CNI Laser	MGL-532
Micrometer	Mitutoyo	Series 227
Surgical microscope	Carl Zeiss, Inc.	OPMI