Summary
Interstitiel fluid strømning er forhøjet i solide tumorer og kan modulere tumorcelleinvasion. Her beskriver vi en metode til at anvende interstitielt fluid strømning til celler indlejret i en matrix, og derefter måle deres virkning på celleinvasion. Denne teknik kan let tilpasses til at studere andre systemer.
Abstract
Vækst og udvikling af de fleste faste tumorer afhænger første transformation af cancerceller og deres reaktion på stroma-associeret signalering i tumormikromiljøet 1. Tidligere har forskningen på tumormikromiljøet primært fokuseret på tumor-stroma interaktion 1-2. Men tumormikromiljøet også omfatter en række biofysiske kræfter, hvis virkninger stadig dårligt forstået. Disse kræfter er biomekaniske følger tumorvækst, der fører til ændringer i genekspression, celledeling, differentiering og invasion 3. Matrixdensiteten 4, stivhed 5-6, og strukturen 6-7, interstitiel fluid tryk 8, og interstitiel fluidstrøm 8 ændres alle ved cancer progression.
Interstitiel fluid strømning i særdeleshed er højere i tumorer sammenlignet med normale væv 8-10. Den anslåede interstitielvæske flow hastigheder blev målt og fundet at være i området på 0,1-3 um s -1, afhængigt af tumorstørrelse og-differentiering 9, 11. Dette skyldes forhøjet interstitielt fluid tryk forårsaget af tumor-induceret angiogenese og forøget vaskulær permeabilitet 12. Interstitiel fluidstrøm har vist sig at forøge invasion af cancerceller 13-14, vaskulære fibroblaster og glatte muskelceller 15. Denne invasion kan skyldes autologe kemotaktiske gradienter skabt omkring celler i 3-D 16 eller forøget matrixmetalloproteinase (MMP) ekspression 15, chemokin sekretion og celleadhæsionsmolekyle ekspression 17. Imidlertid er den mekanisme, ved hvilken cellerne mærke fluidumstrøm ikke godt forstået. Ud over at ændre tumorcelle adfærd, modulerer interstitielt fluid strømning aktiviteten af andre celler i tumormikromiljøet. Det er associeret med (a) kørsel differentiering af fibroblaster i tumorfremmende myofibroblaster 18, (b) transport af antigener og andre opløselige faktorer til lymfeknuder 19, og (c) modulering lymfatiske endotelcelle morfogenese 20.
Den teknik, der præsenteres her medfører interstitiel fluidstrøm på celler in vitro og kvantificerer dens indvirkning på invasion (figur 1). Denne fremgangsmåde er blevet offentliggjort i flere undersøgelser til måling af virkningerne af fluidstrømmen på stromal og cancer celleinvasion 13-15, 17. Ved at ændre matrixsammensætning, celletype og cellekoncentrationen, kan denne metode anvendes til andre sygdomme og fysiologiske systemer til undersøgelse af virkningerne af interstitiel flow på cellulære processer, såsom invasion, differentiering, proliferation og genekspression.
Protocol
1. Assay Set-up
- Optø en lille portion (<500 ul) af Matrigel på is ved 4 ° C (ca. 2 timer).
- Forbered gel opskrift (se f.eks mængder i tabellen nedenfor): 10x PBS (1x i samlet volumen), 1 N natriumhydroxid (svarende til 0,023 mængder tilføjet kollagen, eller pr kollagen fabrikantens anbefalinger, som er relevant), skrive Matrigel-og collagen I til slutkoncentrationer på 1 mg / ml og 1,3 mg / ml (andre matrixformuleringer kan anvendes afhængigt af celletypen og eksperiment).
Eksempel gel opskrift
| Komponenter | Stock Koncentration | Slutkoncentration | Tilføj volumen |
| 10X PBS | 10X | 1X | 0,090 ml |
| Sterilt vand | 0,346 ml | ||
| 1N NaOH | 0,008 ml | ||
| Matrigel | 9,90 mg / ml | 1 mg / ml | 0,101 ml |
| Rotte hale type I collagen | 3,66 mg / ml | 1,3 mg / ml | 0,355 ml |
- Blande komponenter i gelen på is i den samme sekvens som ovenfor og inkuberes endelige opløsning i 1 time ved 4 ° C. I vores erfaring. En 1 times inkubation før cellepodning resulterer i en mere ensartet gelering af kollagen Sørg for at holde Matrigel-og collagen på is til alle tider og til at arbejde så hurtigt som muligt for at forhindre gelering.
- Sted 12 mm diameter 8 um pore cellekultur indsættes i en 12-brønds plade under anvendelse steriliserede pincetter.
- Tæl celler og resuspender i serumfrie medier ved 5 x 10 6 celler / ml (samlet volumen på 10% af gelen opløsning).
- Tilsæt 100 ul af celle suspension til 900 pi gelopløsning (endelig cellekoncentration 5 x 10 5 celler / ml) og blandes grundigt ved at pipettere forsigtigt op og ned.
- Tilsæt 150 pi af den endelige blanding til hvert insert og overføres til en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 30 minutter, indtil gelen polymeriserer.
- Under anvendelse af serum-frie medier,
- Tilsæt 100 pi på toppen af gelen og 1200 ul under indsatsen for statisk tilstand. Væsken niveauer inde i indsatsen og uden i brønden skal være omtrent lige, hvilket resulterer i minimal trykforskel over gelen og ikke interstitiel strømning.
- Tilsættes 100 ul under indsatsen og 650 pi ovenfor gel til strømningstilstand. Være omhyggelig med at undgå luftbobler neden insertet, da de vil forhindre celler i at vandre gennem membranen ved disse steder. Trykforskellen frembringes ved disse mængder er ca 1,3 cm H2O (eller 1 mm Hg).
- Anbring pladen i en 37° C, 5% CO2 inkubator i 24 timer.
2. Cellefarvning og tælle
- Tilsæt 500 pi 1X PBS per brønd i nye 24-brønds plade, og dette vil blive anvendt til at vaske indsatsene.
- Fjernelse af mediet forbliver i den øvre del af strømnings transwells og bestemme volumenet. Beregn den samlede elueret volumen ved at fratrække den resterende mængde fra det totale volumen oprindeligt tilføjede, 650 ul (dette vil blive brugt til strømningshastighedsområder beregninger, se nedenfor). Anvende vatpinde at fjerne gelen fra inserterne og tørre den øverste overflade af membranen for at fjerne ikke-invaderede celler. Placere skærene i 24-brønds plade indeholdende 1X PBS i 15 s for at vaske indsatse.
- Fjerne PBS, og der tilsættes 500 pi af 4% paraformaldehyd (PFA) under hver indsats, og der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur til at fastsætte de transmigrated celler.
- Fjerne PFA og skylles en gang med 500 pi 1X PBS for at fjerne resterende fiksativ.
- Tilsæt 500 pi of 0,5% Triton X-100-opløsning under indsatserne og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur for at permeabilisere cellerne.
- Skåret membraner ud af insertet ved anvendelse af et barberblad og anbringes i 100 pi 2 ug / ml DAPI i 1X PBS-opløsning, være omhyggelig med at placere undersiden af membranen vender nedad (transmigrated celler nedad).
- Wrap plade i aluminiumsfolie og sted på et rysteapparat ved 150 rpm i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask membraner i 500 pi 1X PBS på rysteapparat (repeat 3 gange i 10 minutter hver) for at fjerne frit DAPI.
- Placer membraner på objektglas med transmigrated celler opad, tilsæt monteringsløsning og dækglas.
3. Dataanalyse
- Grev DAPI-farvede kerner på 5 tilfældigt udvalgte steder for hver membran (holde sig væk fra kanterne og bruge en 10x eller 20x objektiv).
- Beregn den gennemsnitlige celletal og opnå den procentvise invasion ved hjælp af følgende formel:
Procent invasion = 100% x (gennemsnitlig celletal x membranoverfladeareal) / (areal af mikroskopet billede x antal celler podet)
Den procentiske invasion kan normaliseres til en vis kontrol tilstand (typisk statisk tilstand) for at muliggøre sammenligning mellem uafhængige forsøg. - Beregn den gennemsnitlige strømningshastighed: dividere den totale, eluerede volumen i strømmen tilstand ved inkubationstiden (fx, 24 timer).
- Beregn den gennemsnitlige strømningshastighed: opdele den gennemsnitlige strømningshastighed af tværsnitsarealet af gelen / membran (i dette tilfælde 60 mm 2).
4. Repræsentative resultater
At måle tumorcelleinvasion i interstitiel strømning, udførte vi vores 3-D flow invasion assay under anvendelse af MDA-MB-435S metastatisk melanom-celler. Disse celler er tidligere blevet vist at invadere som reaktion på interstitielt fluid strømning 13-14. Cellerne blev indlejret i en matrix bestående af 1,3 mg / ml rotte tail senecollagen type I og 1 mg / ml Matrigel basalmembranmatrix i en endelig cellekoncentration på 5 x 10 5 celler / ml. To forskellige betingelser blev sammenlignet: (1) gennemsnitlig interstitiel flow = 0,1 um s -1 og (2) under statiske betingelser = ingen målelig strømningshastighed (figur 1).
Efter 24 timer blev cellerne, der invaderede gennem porerne i membranen farvet med DAPI at lette celletælling. Figur 2 viser et repræsentativt billede af de invaderede celler. Under brightfield er kun membranens porer synlige. Ved hjælp af fluorescens blev DAPI-farvede kerner, der anvendes til celletælling og phalloidin farvede F-actin strukturer blev anvendt til at visualisere cellelegemet (valgfrit). Ved hjælp af en Students t-test under forudsætning af ens varianser, viste vi, at interstitielle flow øger MDA-MB-435S celle invasion af 2,3-gange over statiske forhold (p = 0,003) (Figur 3). Dette corroborates lignende fund (men med forskellige matrix forhold og derfor strømningshastigheder) ved hjælp af denne cellelinie 13-14.
Figur 1. Skematisk af 3-D interstitiel fluidstrøm invasion assay. Første forberede gelopløsning ved hjælp af passende koncentrationer og mængder. Derpå tilsættes celler til gel-opløsning og overføres til cellekultur indsatse. Endelig tilføjer passende mængde af medier til hver tilstand og inkuber. Interstitiel fluid strømning styres af en fluid trykhoved.
Figur 2. Transmigrated MDA-MB-435S celler på membranen. Invaderet celler blev fikseret efter vor interstitiel fluid strømning invasion assay og farvet med DAPI og Alexa Fluor 488-konjugeret phalloidin at lette tælling af invaderet celler A) et billede af membranen under lyse område B) DAPI staINED kerner (blå), C) Alexa Fluor 488-phalloidin farvet F-actin (i grøn). Målestokken repræsenterer 50 um.
Figur 3. Forøget invasion af MDA-MB-435S-celler under strømning. Celleinvasion efter 24 timer signifikant forøget ved interstitiel flow (p = 0,003). Resultaterne er normaliseret til det gennemsnitlige statiske tilstand og Værdier repræsenterer middel ± SEM for 6 cellekultur skær.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet en metode til at kvantificere virkningen af interstitiel flow på tumorcelleinvasion, under anvendelse af celler indlejret i en 3-D matrix i en cellekultur insert. Dette og lignende metoder er blevet anvendt til at undersøge virkningen af interstitiel strømning på en række celletyper 13-15, 17. Vores fremgangsmåde delvist efterligner matrix mikromiljø tumoren ved hjælp af type I collagen og Matrigel, som indeholder proteiner, der findes i basalmembranen af epitelvæv og omgivende stroma 21-22. Dette system er forholdsvis nem at sætte op enkel og mere omkostningseffektive end de fleste mikrofluide anordninger, der anvendes til at studere interstitielt fluid strømning in vitro 23-24. Det kræver ikke pumper eller specialiserede udstyr og giver mulighed for flere betingelser, der skal testes samtidigt. Endvidere målinger sammenlignes med eksisterende Boyden kammer assays der almindeligvis anvendes til at teste invasion og migrationtion af kræftceller.
Ved at ændre den celletype og sammensætningen af matrixen, kan forskellige biologiske systemer udformes, såsom brystcancer 13, blodkar 15 og dendritisk celle handel 17. Ændre matrix egenskaber og sammensætning og modulere trykket hoved vil også ændre interstitielvæske strømningshastighed, hvilket giver mulighed for fleksibilitet i prøveparametre afhængige af biologiske system af interesse. Dette system kan også anvendes i co-kultur assays. 14, 17
Ud over at måle invasion, der er beskrevet i det interstitielle fluid-flow assay her kan udvides til at måle ændringer i andre celletyper adfærd, såsom proteinekspression, celleproliferation og forskelle i cellesignalering begivenheder. Cellerne kan let isoleres direkte fra gelen for RNA, DNA og protein ekstraktion og anvendes til efterfølgende molekylære biologiske assays, såsom PCR og westernBlot. Dette er et meget fleksibelt assay, der let kan indstilles til og indrettet til at undersøge virkningerne af interstitiel strømning på en række af cellulære processer i en række cellesystemer.
En af de største ulemper ved dette assay er, at strømningshastigheder er meget afhængige af matrix koncentration. Strømningshastighed stiger Matrigel koncentration aftager. Dette betyder, at en matrix, der udelukkende består af kollagen, der kan anvendes i undersøgelsen af stroma forbundne celler, vil have højere strømningshastigheder (> 1 um s-1) end en hovedsagelig består af Matrigel (<0,05 um s-1) for en given trykforskel. Hvis en bestemt strømningshastighed er påkrævet, kan man først udføre en indledende test til identifikation af matrixsammensætningen, der tilvejebringer den ønskede strømningshastighed. Tykkelsen af gelen kan også varieres for at justere strømningshastigheden. Assayet heller ikke mulighed for levende celler billeddannelse, hvor opførsel af individuelle celler end ændringer i deres hastighed og direktionalitet kan måles. I stedet dette assay tilvejebringer et slutpunkt måling af ændringer i invasion på tværs af en population af celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
