Summary
זרימת הנוזל ביניים הוא גבוה בגידולים מוצקים והוא יכול לווסת את הפלישה תאים סרטניים. כאן נתאר את הטכניקה ליישם זרימת הנוזל ביניים לתאים משוקע בתוך ולאחר מכן למדוד את השפעותיו על הפלישה התא. טכניקה זו ניתן להתאים בקלות ללמוד מערכות אחרות.
Abstract
צמיחה והתקדמות של גידולים מוצקים רוב תלויים השינוי הראשוני של תאים סרטניים ואת תגובתם stroma הקשורים איתות microenvironment הגידול 1. בעבר, מחקר על microenvironment הגידול התמקדו בעיקר גידולים סטרומה אינטראקציות 1-2. עם זאת, microenvironment הגידול כולל גם מגוון של כוחות Biophysical, אשר תופעות להישאר ממעטים להבין. כוחות אלה הם תוצאות ביומכניים של הגידול להוביל שינויים בביטוי גנים, חלוקת התא, התמיינות ופלישה 3. צפיפות מטריקס 4, נוקשות 5-6, והמבנה 6-7, לחץ נוזלים ביניים 8, ואת זרימת נוזל interstitial 8 משתנים במהלך כל התקדמות הסרטן.
זרימת הנוזל ביניים בפרט הוא גבוה יותר גידולים לעומת 8-10 רקמות נורמליות. נוזל מוערך ביניים FLמהירויות ow נמדדו ונמצא כי בטווח של 0.1-3 מיקרומטר s -1, תלוי בגודל הגידול והבחנה 9, 11. זאת בשל לחץ גבוה נוזל interstitial שנגרם על ידי הגידול אנגיוגנזה המושרית וחדירות כלי הדם מוגברת 12. זרימת הנוזל ביניים הוכח להגדיל את הפלישה של תאים סרטניים 13-14, fibroblasts כלי דם ותאי שריר חלק 15. פלישה זו עשויה לנבוע הדרגתיים chemotactic עצמיים שנוצרו סביב תאים 3-D 16 או עלה metalloproteinase מטריקס (MMP) הביטוי 15, הפרשת chemokine ו הידבקות התא מולקולות ביטוי 17. עם זאת, המנגנון שבאמצעותו התאים לחוש זרימת הנוזל אינה מובנת היטב. בנוסף שינוי התנהגות תאים סרטניים, זרימת נוזל interstitial מודולציה את הפעילות של תאים אחרים microenvironment הגידול. היא מזוהה עם בידול (א) נהיגה של fibroblasts לתוך הגידול, קידום myofibroblasts 18, (ב) ההובלה של אנטיגנים וגורמים מסיסים אחרים לבלוטות הלימפה 19, (ג) הלימפה ויסות תא האנדותל המורפוגנזה 20.
השיטה המוצגת כאן מטיל זרימת הנוזל ביניים על תאים במבחנה מכמת את השפעותיו על הפלישה (איור 1). שיטה זו פורסמו מחקרים רבים כדי למדוד את ההשפעות של זרימת הנוזל על סטרומה ופלישה סרטן תאים 13-15, 17. על ידי שינוי הרכב מטריקס, סוג התא, וריכוז התא, שיטה זו ניתן להחיל על מחלות אחרות ומערכות פיזיולוגיות כדי לחקור את ההשפעות של זרם ביניים על תהליכים תאיים כגון התפשטות הפלישה, בידול, ועל ביטוי גנים.
Protocol
1. Assay Set-up
- להפשיר aliquot קטן (<500 μl) של Matrigel על הקרח ב 4 ° C (כ 2 שעות).
- להכין מתכון ג'ל (ראו כרכים לדוגמה בטבלה להלן): PBS 10x (1x בהיקף כולל), סודיום הידרוקסיד 1N (שווה ערך ל 0.023 כרכים של קולגן נוסף, או לפי המלצות היצרן של קולגן, על פי הצורך), הקלד Matrigel ו קולגן I ל הריכוזים האחרונים של 1 מ"ג / מ"ל ו - 1.3 מ"ג / מ"ל בהתאמה (ניסוחים מטריקס אחרים עשויים לשמש תלוי בסוג התא הניסוי).
ג'ל למשל המתכון
| רכיבי | המניות ריכוז | ריכוז סופי | הוספת נפח |
| 10X PBS | 10X | 1X | .090 מ"ל |
| מים סטריליים | .346 מ"ל | ||
| 1N NaOH | .008 מ"ל | ||
| Matrigel | 9.90 מ"ג / מ"ל | 1 מ"ג / מ"ל | .101 מ"ל |
| זנב עכברוש סוג אני קולגן | 3.66 מ"ג / מ"ל | 1.3 מ"ג / מ"ל | .355 מ"ל |
- מערבבים את מרכיבי ג'ל על הקרח ברצף זהה מעל הפתרון הסופי דגירה של שעה 1 על 4 ° C. מניסיוננו, הדגירה 1 שעות לפני זריעת תוצאות תאים gelation אחיד יותר של קולגן. הקפד לשמור Matrigel ו קולגן על הקרח כל הזמן ולעבוד מהר ככל האפשר כדי למנוע gelation.
- מקום 12 מ"מ בקוטר 8 מיקרומטר הנקבוביות סלולריים תרבות מכניס לתוך צלחת של 12 גם באמצעות מלקחיים מעוקרות.
- ספירת תאים ו resuspend בסרום ללא מדיה ב 5 x 10 6 תאים / מ"ל (הנפח הכולל צריך להיות 10% של פתרון ג'ל).
- הוסף 100 μl של תאים suspension ל μl 900 הפתרון ג'ל (ריכוז התאים הסופי 5 x 10 5 תאים / מ"ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
- הוסף 150 μl של התערובת הסופית כדי להוסיף כל העברה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 30 דקות עד ג'ל polymerizes.
- שימוש בסרום ללא מדיה,
- הוסף 100 μl על גבי ג'ל ו 1200 μl תחת הכנס למצב הסטטי. רמות נוזל בתוך להוסיף ומחוצה היטב צריך להיות שווה בקירוב, וכתוצאה מכך ההבדל לחץ מינימלי על פני ג'ל ולא זרימת ביניים.
- הוסף 100 μl תחת הכנס ו 650 μl מעל ג'ל למצב את הזרימה. להיזהר כדי למנוע בועות אוויר מתחת הכנס, כפי שהם ימנעו תאים נודדים דרך הממברנה במקומות אלה. ההבדל הלחץ שנוצר על ידי כרכים אלה הוא כ 1.3 ס"מ H 2 O (או 1 מ"מ כספית).
- במקום צלחת 37מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך שעה 24.
2. תא מכתים והספירה נמשכת
- הוסף 500 μl של 1X PBS לכל גם לתוך צלחת חדשה 24 טוב, זה ישמש כדי לשטוף את מוסיף.
- הסר בינוני להישאר בחלק העליון של זרימת transwells ולקבוע את עוצמת הקול. חישוב נפח eluted הכולל על ידי הפחתת נפח הנותר מנפח הכולל הוסיף במקור, 650 μl (זה ישמש לחישוב שיעור הזרימה, ראה להלן). השתמש צמר גפן כדי להסיר את ג 'ל מ ו מוסיף את לנגב את המשטח העליון של קרום להסיר תאים שאינם שפלשו. מניחים את מכניסה לתוך צלחת 24-1X המכיל גם עבור PBS של 15 לשטוף מוסיף.
- הסר PBS ולהוסיף 500 μl של paraformaldehyde 4% (PFA) מתחת להוסיף כל דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים transmigrated.
- הסר את PFA ולשטוף פעם אחת עם 500 μl 1X PBS להסיר מקבע שיורית.
- הוסף 500 μl Oו 0.5% טריטון X-100 הפתרון מתחת מוסיף ו דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי permeabilize התאים.
- גזור ממברנות מתוך הכנס באמצעות סכין גילוח ומקום לתוך μl של 100 מיקרוגרם 2 / מ"ל DAPI בפתרון PBS 1X, נזהר למקם את החלק התחתון של הפנים כלפי מטה קרום (תאים transmigrated עם הפנים כלפי מטה).
- גלישת הצלחת בנייר אלומיניום ומניחים על שאכר בסל"ד 150 במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הקרומים של 500 μl 1X PBS על שאכר (חוזר 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד) כדי להסיר DAPI חינם.
- ממברנות מקום על שקופיות זכוכית עם תאים transmigrated פונה כלפי מעלה, להוסיף פתרון גוברת תלוש כיסוי.
3. ניתוח נתונים
- ספירת DAPI מוכתם גרעינים על 5 מקומות שנבחרו באופן אקראי של קרום זה (להתרחק הקצוות ולהשתמש 10X או 20X עדשה אובייקטיבי).
- לחשב את מספר הסלולרי הממוצע ולקבל את הפלישה אחוזים על ידי שימוש בנוסחה הבאה:
הפלישה אחוזים = X 100% (תא הממוצע ספירת קרום x שטח הפנים) / (שטח הפנים של מספר התמונה X מיקרוסקופ של תאים seeded)
הפלישה אחוזים ניתן מנורמל למצב שליטה מסוימת (בדרך כלל מצב סטטי), כדי לאפשר השוואה בין ניסויים בלתי תלויים. - לחשב את שיעור הזרימה הממוצע: לחלק את נפח eluted סך במצב זרימת עד הדגירה (למשל 24 שעות).
- חשב את מהירות זרימת ממוצע: לחלק את קצב הזרימה הממוצע של שטח חתך של ג'ל / קרום (במקרה זה 60 מ"מ 2).
4. נציג תוצאות
כדי למדוד את הפלישה תאים סרטניים תחת זרם ביניים, ביצענו 3-D שלנו הפלישה זרימת assay באמצעות מד"א-MB-435S בתאי מלנומה גרורתית. תאים אלה בעבר הוכח לפלוש בתגובה זרימת הנוזל ביניים 13-14. התאים היו מוטבע מטריצה מורכבת של 1.3 מ"ג / מ"ל עכברוש טאיקולגן אני הגיד סוג I ו 1 מ"ג / מ"ל קרום Matrigel מטריקס במרתף בריכוז התא הסופי של 5 x 10 5 תאים למ"ל. שני תנאים שונים הושוו: (1) זרימת ביניים הממוצע = 0.1 מיקרומטר של -1 ו - (2) מצב סטטי = לא הספיקה מדידה (איור 1).
אחרי 24 שעות, התאים שפלשו דרך הנקבוביות של קרום הוכתמו DAPI כדי להקל על ספירת התאים. תרשים 2 מציג תמונה מייצגת של תאים שפלשו. תחת brightfield, רק את נקבוביות הממברנה גלויים. באמצעות הקרינה, גרעינים DAPI מוכתם שימשו ספירת התאים את phalloidin F-אקטין מבנים מוכתמים שימשו לדמיין גוף התא (לא חובה). באמצעות הסטודנטים של מבחן t בהנחה שונויות שוות, אנו הראו כי זרימת ביניים מגביר באופן משמעותי את מד"א-MB-435S הפלישה התא על ידי 2.3 על פי התנאים סטטיים (p = 0.003) (איור 3). זה בשיתוף פעולה נרחבTES ממצאים דומים (אך עם תנאים שונים מטריקס ולכן מהירויות הזרימה) באמצעות את שורות התאים 13-14.
באיור 1. סכמטי של 3-D זרימת נוזל interstitial assay הפלישה. ראשית להכין פתרון ג'ל באמצעות ריכוזים מתאימים ואמצעי אחסון. לאחר מכן להוסיף תאים לפתרון ג'ל ולהעביר מוסיף תרבית תאים. לבסוף להוסיף נפח מתאים של התקשורת למצב כל דגירה. זרימת הנוזל ביניים הוא מונע על ידי ראש לחץ נוזלים.
איור 2. Transmigrated מד"א-MB-435S על קרום התאים. תאים שפלשו נקבעו לאחר assay זרימת ביניים שלנו הפלישה נוזל ומוכתמים DAPI ו-Alexa פלואוריד 488 מצומדות phalloidin כדי להקל על ספירת התאים פלשו; תמונה) של קרום מתחת לשדה בהיר, ב ') DAPI STAגרעינים עומד לבחינה (בכחול); C) Alexa פלואוריד 488-phalloidin צבעונית F-אקטין (בירוק). סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר.
איור 3. הגדלת הפלישה של מד"א-MB-435S תאים תחת הזרם. הפלישה התא לאחר 24 שעות משופרת באופן משמעותי על ידי זרימת ביניים (p = 0.003). התוצאות מנורמל למצב סטטי הממוצע וערכים מייצגים ממוצע ± SEM של 6 מוסיף תרבית תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים מתודולוגיה לכימות ההשפעה של זרימת ביניים על הפלישה תאים סרטניים, תוך שימוש בתאי משוקע בתוך 3-D בתוך להוסיף תרבית תאים. שיטות אלה דומים שימשו כדי ללמוד את ההשפעה של זרימת ביניים על מגוון רחב של סוגי תאים 13-15, 17. הגישה שלנו מחקה באופן חלקי microenvironment מטריצה של הגידול על ידי שימוש בסוג אני קולגן Matrigel אשר מכילים חלבונים המצויים בתוך קרום במרתף של רקמת אפיתל stroma סביב 21-22. מערכת זו קל יחסית ההגדרה, פשוט, ויותר חסכוני יותר התקנים microfluidic ביותר המשמשים ללמוד זרימת הנוזל ביניים במבחנה 23-24. היא אינה דורשת ציוד או משאבות מיוחדות ומאפשר מספר תנאים להיבחן בו זמנית. יתר על כן, המדידות דומים לאלה הקיימים מבחני בוידן קאמרית נפוץ לבדוק הפלישה רשות ההגירהtion של תאים סרטניים.
על ידי שינוי סוג תא הרכב מטריקס, מערכות ביולוגיות שונות יכול להיות המודל, כגון סרטן השד 13, 15 כלי דם, וסחר תאים דנדריטים 17. לשנות את המאפיינים מטריקס והרכב וכן ויסות לחץ הראש יהיה גם לשנות את מהירות זרימת הנוזל ביניים, ובכך מאפשר גמישות בפרמטרים assay תלוי במערכת הביולוגית של עניין. מערכת זו יכולה לשמש גם שיתוף תרבות מבחני. 14, 17
בנוסף למדידת הפלישה, assay ביניים זרימת הנוזל המתואר כאן יכול להיות מורחבת כדי למדוד שינויים התנהגויות תאים אחרים כמו ביטוי חלבון, התפשטות תאים ו הבדלים אירועים התא איתות. התאים יכולים בקלות להיות מבודד ישירות ג'ל על RNA, DNA, והפקת חלבון המשמש הבאים מבחני ביולוגיה מולקולרית, כגון PCR ומערבלמחוק. זהו assay גמישה שניתן להגדיר בקלות את ומותאמת כדי לחקור את ההשפעות של זרם ביניים על מגוון תהליכים תאיים במספר מערכות התא.
אחד החסרונות העיקריים של assay זה היא העובדה כי מהירויות הזרימה הם תלויים מאוד של ריכוז מטריקס. מהירות זרימת עולה ככל הריכוז Matrigel יורדת. משמעות הדבר היא כי המטריצה המורכבת אך ורק של קולגן, אשר ניתן להשתמש בהם במחקר של תאים הקשורים stroma, תהיה מהירויות זרימה גבוהות יותר (> 1 מיקרומטר של -1) מ 1 המורכב בעיקר Matrigel (<0.05 מיקרומטר s -1) עבור ההפרש בלחץ נתון. אם מהירות זרימת ספציפי נדרש, ניתן לבצע בדיקה 1 הראשונית לזהות את הרכב מטריקס, המספקת מהירות זרימת הרצוי. עובי של ג'ל יכול גם להיות מגוונים כדי להתאים את מהירות הזרימה. Assay גם אינו מאפשר הדמיה תא חי, שם את ההתנהגות של תאים בודדיםשינויים פ המהירות שלהם כיווניות ניתן למדוד. במקום זאת, assay זה מספק מדידת נקודת הסיום של שינויים הפלישה ברחבי אוכלוסייה של תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
