Summary
Flusso di fluido interstiziale è elevata in tumori solidi e in grado di modulare l'invasione delle cellule tumorali. Qui si descrive una tecnica per applicare il flusso di fluido interstiziale alle cellule incorporati in una matrice e quindi misurare i suoi effetti sulla invasione cellulare. Questa tecnica può essere facilmente adattato per studiare altri sistemi.
Abstract
La crescita e la progressione della maggior parte dei tumori solidi dipendono dalla trasformazione iniziale delle cellule tumorali e la loro risposta a stroma segnalazione associata nel microambiente tumorale 1. In precedenza, la ricerca sul microambiente tumorale si è concentrata principalmente sui tumori stromali interazioni 1-2. Tuttavia, il microambiente tumorale include anche una varietà di forze biofisiche, i cui effetti sono scarsamente compreso. Queste forze sono le conseguenze biomeccaniche della crescita tumorale che portano a cambiamenti nell'espressione genica, la divisione cellulare, la differenziazione e l'invasione 3. Densità Matrix 4, rigidità 5-6, 6-7 e la struttura, la pressione del fluido interstiziale 8, e il flusso di fluido interstiziale 8 sono modificati durante la progressione del cancro.
Flusso di fluido interstiziale in particolare è maggiore nei tumori rispetto ai normali tessuti 8-10. La stima fl liquido interstizialevelocità ow stati misurato e trovato essere nell'intervallo di 0,1-3 um s -1, a seconda delle dimensioni del tumore e differenziazione 9, 11. Ciò è dovuto alla elevata pressione del fluido interstiziale causata da angiogenesi indotta da tumore e aumento della permeabilità vascolare 12. Flusso di fluido interstiziale ha dimostrato di aumentare l'invasione delle cellule tumorali 13-14 vascolari, fibroblasti e cellule muscolari lisce 15. Questa invasione può essere dovuto a gradienti chemiotattici autologhe create attorno cellule in 3-D 16 o maggiore di metalloproteinasi di matrice (MMP) espressione 15, secrezione di chemochine e l'adesione delle cellule espressione molecola di 17. Tuttavia, il meccanismo con cui le cellule rilevare il flusso di fluido non è ben compreso. Oltre a modificare il comportamento delle cellule tumorali, flusso di fluido interstiziale modula l'attività di altre cellule nel microambiente tumorale. E 'associato con (a) differenziazione dei fibroblasti di guida in tumore di promozione dei myofibroblasts 18, (b) trasporto di antigeni e di altri fattori solubili ai linfonodi 19, e (c) modulante morfogenesi delle cellule endoteliali linfatico 20.
La tecnica qui presentata impone flusso di liquido interstiziale su cellule in vitro e quantifica suoi effetti sulla invasione (Figura 1). Questo metodo è stato pubblicato in diversi studi per misurare gli effetti del flusso di fluido sulla stromali e invasione cellulare del cancro 13-15, 17. Variando la composizione della matrice, tipo di cellula, e la concentrazione cellulare, questo metodo può essere applicato ad altre malattie e sistemi fisiologici per studiare gli effetti del flusso interstiziale processi cellulari come l'invasione, la differenziazione, proliferazione, e l'espressione genica.
Protocol
1. Assay Set-up
- Scongelare una piccola aliquota (<500 pl) di Matrigel in ghiaccio a 4 ° C (circa 2 ore).
- Preparare la ricetta gel (veda che i volumi di esempio nella tabella sottostante): 10x PBS (1x in volume totale), idrossido di sodio 1N (equivalente a 0.023 volumi di collagene aggiunta, o le raccomandazioni del costruttore del collagene, se del caso), Matrigel e collagene di tipo I a concentrazione finale di 1 mg / ml e 1,3 mg / ml, rispettivamente (formulazioni di matrice possono essere utilizzati altri a seconda del tipo di cellula e esperimento).
Esempio di gel ricetta
| Componenti | Concentrazione magazzino | Concentrazione finale | Aggiungere il volume |
| 10X PBS | 10X | 1X | 0,090 ml |
| Acqua sterile | 0,346 ml | ||
| NaOH 1N | 0,008 ml | ||
| Matrigel | 9,90 mg / ml | 1 mg / ml | 0,101 ml |
| Rat tail collagene di tipo I | 3,66 mg / ml | 1,3 mg / ml | 0,355 ml |
- Miscelare componenti del gel su ghiaccio nella stessa sequenza come sopra e incubare soluzione finale per 1 ora a 4 ° C. Nella nostra esperienza, a 1 ora di incubazione prima della semina cellulare risultati in una gelificazione più uniforme del collagene. Assicurarsi di mantenere Matrigel e collagene su ghiaccio in ogni momento e di lavorare il più velocemente possibile per evitare la gelificazione.
- Inserire 12 mm di diametro 8 micron pori cultura inserisce in una cella di 12 pozzetti con pinze sterilizzate.
- Contare le cellule e risospendere in mezzi privi di siero a 5 x 10 6 cellule / ml (volume totale dovrebbe essere 10% della soluzione di gel).
- Aggiungere 100 ml di su cellularespensione a 900 microlitri di soluzione di gel (la concentrazione cellulare finale del 5 x 10 5 cellule / ml) e mescolare accuratamente pipettando delicatamente su e giù.
- Aggiungere 150 pl della miscela finale di ciascun inserto e trasferimento a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 30 minuti fino gel polimerizza.
- Utilizzo di mezzi privi di siero,
- Aggiungere 100 pl sulla superficie del gel e 1200 pl sotto l'inserto per la condizione statica. I livelli di fluido all'interno e all'esterno l'inserto nel pozzetto dovrebbe essere approssimativamente uguale, con conseguente differenza di pressione minima attraverso il gel e senza flusso interstiziale.
- Aggiungere 100 ul sotto l'inserto e 650 microlitri di sopra gel per la condizione FLOW. Fare attenzione ad evitare eventuali bolle d'aria sotto l'inserto, in quanto saranno impedire alle cellule di migrare attraverso la membrana in questi luoghi. La differenza di pressione generata da questi volumi è di circa 1,3 cm H 2 O (o 1 mm Hg).
- Mettere in una piastra di 37° C, 5% CO 2 incubatore per 24 ore.
2. Colorazione della cellula e di conteggio
- Aggiungere 500 microlitri di PBS 1X per bene nella nuova piastra da 24 pozzetti, questo verrà utilizzato per lavare gli inserti.
- Rimuovere il mezzo rimanente nella porzione superiore delle transwells flusso e determinare il volume. Calcolare il volume totale eluito sottraendo il volume rimanente del volume totale originariamente aggiunta, 650 pl (questo sarà utilizzato per i calcoli di portata, vedi sotto). Utilizzare tamponi di cotone per rimuovere il gel dalla gli inserti e per pulire la superficie superiore della membrana per rimuovere le cellule non-invaso. Posizionare gli inserti nella piastra da 24 pozzetti contenente 1X PBS per 15 s per lavare inserti.
- Rimuovere PBS e aggiungere 500 microlitri del 4% paraformaldeide (PFA) sotto ciascun inserto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per fissare le cellule trasmigrato.
- Rimuovere il PFA e risciacquare una volta con 500 microlitri di PBS 1X per rimuovere residui di fissativo.
- Aggiungere 500 ul of 0,5% Triton X-100 soluzione sotto gli inserti e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per permeabile alle cellule.
- Tagliare membrane fuori dell'inserto usando una lama di rasoio e posto in 100 microlitri di 2 ug / ml in soluzione DAPI 1X PBS, avendo cura di posizionare la parte inferiore della faccia membrana verso il basso (cellule trasmigrato faccia in giù).
- Avvolgerla in foglio di alluminio e posto su un agitatore a 150 rpm per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare le membrane in 500 microlitri di PBS 1X su Shaker (ripetere 3 volte per 10 minuti ciascuno) per rimuovere DAPI libero.
- Posizionare le membrane su vetrini con le cellule trasmigrato rivolti verso l'alto, aggiungere la soluzione di montaggio e coprioggetto.
3. Analisi dei dati
- Contare DAPI macchiato di nuclei su 5 posizioni scelte a caso di ogni membrana (stare lontano dai bordi e utilizzare un 10X o 20X lente dell'obiettivo).
- Calcolare il numero medio di cellule e ottenere l'invasione percentuale usando la seguente formula:
Percentuale invasione x = 100% (conteggio medio superficie cellulare x membrana superficiale) / (area superficiale del numero x immagine al microscopio di cellule seminate)
L'invasione percentuale può essere normalizzato a una condizione di controllo (tipicamente la condizione statica) per consentire un confronto tra esperimenti indipendenti. - Calcolare la portata media: dividere il volume totale eluito nella condizione di flusso del tempo di incubazione (ad esempio, 24 ore).
- Calcolare la velocità media di flusso: dividere la portata media della sezione trasversale del gel / membrana (in questo caso 60 mm 2).
4. Risultati rappresentativi
Per misurare l'invasione delle cellule tumorali in condizioni di flusso interstiziale, abbiamo effettuato il 3-D saggio di invasione flusso utilizzando MDA-MB-435s cellule di melanoma metastatico. Queste cellule sono state precedentemente dimostrato di invadere in risposta al flusso di fluido interstiziale 13-14. Le cellule sono state incorporate in una matrice composta di 1,3 mg / ml ratto tail tendine collagene di tipo I e 1 mg / ml di matrice basale Matrigel membrana ad una concentrazione cellulare finale di 5 x 10 5 cellule / ml. Due condizioni diverse sono stati confrontati: (1) flusso medio interstiziale = 0,1 micron s -1 e (2) = no condizione statica portata misurabile (Figura 1).
Dopo 24 ore, le cellule che hanno invaso attraverso i pori della membrana sono stati colorati con DAPI per facilitare il conteggio delle cellule. La figura 2 mostra un'immagine rappresentativa delle cellule invase. In brightfield, solo i pori della membrana sono visibili. Utilizzando fluorescenza, l'DAPI macchiata nuclei sono stati utilizzati per la conta cellulare e le phalloidin macchiati F-actina strutture sono stati utilizzati per visualizzare il corpo cellulare (opzionale). Utilizzando un Student t-test assumendo varianze uguali, abbiamo dimostrato che il flusso interstiziale aumenta significativamente MDA-MB-435s invasione cella di 2,3 volte rispetto alle condizioni statiche (p = 0,003) (Figura 3). Questo corroborates risultati simili (ma con condizioni diverse matrice e quindi velocità di flusso) che utilizzano questa linea cellulare 13-14.
Figura 1. Schematica del 3-D interstiziale saggio di invasione flusso di fluido. Prima preparare la soluzione gel con concentrazioni appropriate e volumi. Poi aggiungere celle a soluzione di gel e trasferire inserti di coltura cellulare. Infine aggiungete il volume appropriato di media per ogni condizione e incubare. Flusso di fluido interstiziale è guidato da una testa di pressione del fluido.
Figura 2. Trasmigrato MDA-MB-435s celle di membrana. Le cellule hanno invaso sono state fissate dopo il nostro interstiziale saggio di invasione flusso del fluido e colorati con DAPI e Alexa Fluor 488-coniugato phalloidin per facilitare il conteggio delle cellule invase; A) Immagine della membrana in campo chiaro; B) DAPI STAnuclei ined (in blu); C) Alexa Fluor 488-phalloidin tinto F-actina (in verde). Barra della scala rappresenta 50 micron.
Figura 3. Maggiore invasione di MDA-MB-435s cellule sotto flusso. Invasione delle cellule dopo 24 ore significativamente migliorata dal flusso interstiziale (p = 0,003). I risultati sono normalizzati alla condizione statica media e valori rappresentano la media ± SEM di inserti di coltura cellulare 6.
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Discussion
Qui abbiamo descritto un metodo per quantificare l'effetto del flusso interstiziale invasione delle cellule tumorali, utilizzando cellule annegate in una matrice 3-D in un inserto di coltura cellulare. Questi metodi e simili sono stati usati per studiare l'effetto del flusso interstiziale su una varietà di tipi cellulari 13-15, 17. Il nostro approccio imita parzialmente il microambiente matrice del tumore mediante collagene di tipo I e Matrigel che contengono proteine che si trovano nella membrana basale di tessuto epiteliale e lo stroma circostante 21-22. Questo sistema è relativamente facile da configurare, semplice e più conveniente rispetto ai dispositivi più microfluidici che vengono utilizzati per studiare il flusso del fluido interstiziale in vitro 23-24. Non richiede pompe o attrezzature specializzate e consente più condizioni di essere testati simultaneamente. Inoltre, le misurazioni sono paragonabili a quelle di saggi esistenti camera di Boyden comunemente utilizzato per valutare invasione e migrazione di cellule tumorali.
Cambiando il tipo di cella e la composizione della matrice, diversi sistemi biologici possono essere modellato, come il cancro al seno 13, vasi sanguigni 15, e il traffico di cellule dendritiche 17. Alterare le proprietà della matrice e la composizione e la testa modulare la pressione cambia anche la velocità di flusso del fluido interstiziale, consentendo così flessibilità nei parametri del saggio dipendenti dal sistema biologico di interesse. Questo sistema può anche essere utilizzato in co-coltura saggi. 14, 17
Oltre a misurare l'invasione, il flusso del fluido interstiziale test qui descritto potrebbe essere esteso per misurare i cambiamenti nei comportamenti di altre cellule, come espressione della proteina, la proliferazione cellulare e le differenze negli eventi di segnalazione cellulare. Le cellule possono essere facilmente isolati direttamente da gel di RNA, DNA, e estrazione di proteine e utilizzato per successive analisi di biologia molecolare, come la PCR e occidentaleblot. Questo è un test molto flessibile che può essere installato facilmente e adattato per studiare gli effetti del flusso interstiziale su una serie di processi cellulari in un certo numero di sistemi cellulari.
Uno degli inconvenienti principali di questo saggio è il fatto che la velocità di flusso sono molto dipendenti concentrazione di matrice. Velocità di flusso aumenta la concentrazione Matrigel diminuisce. Ciò significa che una matrice costituito esclusivamente da collagene, che può essere utilizzato nello studio di stroma cellule associate, avrà velocità di flusso più alte (> 1 micron s -1) di un composto principalmente di Matrigel (<0,05 micron s -1) per un differenziale di pressione determinata. Se una velocità di flusso specifica è richiesta, si può eseguire un primo test iniziale per identificare la composizione della matrice che fornisce la velocità di flusso desiderata. Lo spessore del gel può anche essere variata per regolare la velocità del flusso. Il saggio inoltre non consente l'imaging cellule vive, dove il comportamento di uno singole celled cambiamenti nella loro velocità e direzionalità può essere misurata. Invece, questo test fornisce una misurazione di variazioni di endpoint invasione attraverso una popolazione di cellule.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
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