Summary
間質液の流れが固形腫瘍で上昇し、腫瘍細胞の浸潤を調節することができる。ここでは、マトリックス中に埋め込まれた細胞に間質液の流れを適用し、細胞浸潤に及ぼす影響を測定する手法を説明します。このテクニックは簡単に他のシステムを研究するために適応させることができます。
Abstract
ほとんどの固形腫瘍の増殖と進行は、癌細胞と間質に関連した腫瘍微小環境1でシグナルへの応答の最初の変換に依存しています。以前に、腫瘍の微小環境の研究は主に腫瘍間質相互作用の1から2に焦点を当てている。しかし、腫瘍の微小環境にも影響をよくわかっていないまま生物物理学的勢力が多数含まれています。これらの力は、遺伝子発現の変化、細胞分裂、分化、浸潤3につながる腫瘍増殖の生体力学的な結果である。行列の密度4、剛性5-6、および構造6-7、間質液圧8、間質液の流れ8はすべての癌の進行中に変更されています。
特に間質液の流れが正常組織8-10に比べ腫瘍で高くなっています。推定間質液のFLフロー速度を測定し、腫瘍の大きさと分化9、11に応じて、0.1から3ミクロンs -1の範囲内であることがわかった。これは、腫瘍血管新生と血管透過性の増大12に起因する間質液圧の上昇によるものです。間質液の流れが癌細胞の浸潤13-14、血管の線維芽細胞と平滑筋細胞15を増加させることが示されている。この侵略は3-D 16でセルの周囲に作成またはマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の発現15、ケモカインの分泌と細胞接着分子の発現17日増加した自己走勾配に起因することがあります。しかし、細胞は流体の流れを感知するメカニズムはよく理解されていません。腫瘍細胞の挙動を変更することに加え、間質液の流れが腫瘍微小環境内の他の細胞の活性を調節する。それは（）腫瘍促進myofibrに線維芽細胞の分化を駆動するに関連付けられていますoblasts 18、（b）の抗原とリンパ節19、及び（c）変調リンパ内皮細胞の形態20に他の可溶性因子の輸送。
ここで紹介する手法は、in vitroでの細胞の間質液の流れを課し、浸潤（ 図1）に及ぼす影響を定量化します。このメソッドは、間質と癌細胞の浸潤13-15、17日に流体の流れの効果を測定するために、複数の研究では公開されています。マトリックス組成物、細胞型、細胞濃度を変えることによって、このメソッドは、他の病気や浸潤、分化、増殖、遺伝子発現などの細胞プロセスの間の流れの影響を研究する生理学的システムに適用することができます。
Protocol
1。アッセイセットアップ
- 4℃（約2時間）で氷の上でマトリゲルの小アリコート（<500μl）を解凍します。
- ゲルのレシピ（下の表に例のボリュームを参照してください）準備：10倍PBS（総量で1×）、1N水酸化ナトリウム（追加されたコラーゲンの0.023ボリュームと同等、またはコラーゲンの製造業者の推奨に従って、必要に応じて）、マトリゲルとコラーゲンにIを入力します。に1 mg / mlとそれぞれ1.3 mg / mlの最終濃度（他のマトリックス製剤は細胞の種類や実験に応じて使用されるかもしれません）。
例のゲルのレシピ
| コンポーネント | ストック濃度 | 最終濃度 | ボリュームを加える |
| 10×PBS | 10X | 1X | 0.090ミリリットル |
| 滅菌水 | 0.346ミリリットル | ||
| 1NのNaOH | 0.008ミリリットル | ||
| マトリゲル | 9.90 mg / mlの | 1 mg / mlの | 0.101ミリリットル |
| ラット尾I型コラーゲン | 3.66 mg / mlの | 1.3 mg / mlの | 0.355ミリリットル |
- 4℃で1時間上記のようにインキュベートし、最終的なソリューションと同じ順序で氷の上でゲルのコンポーネントを混在させる我々の経験では、コラーゲンのより均一なゲル化における細胞播種の結果の前に1時間インキュベーション。すべての回で氷の上でマトリゲルやコラーゲンを維持するとゲル化を防ぐためにできるだけ速く動作することを確認してください。
- 滅菌ピンセットを用いて12ウェルプレートに配置する12ミリメートルの直径8μmの孔の細胞培養挿入します。
- 5×10 6細胞/ ml（総ボリュームはゲル溶液の10％でなければなりません）で無血清培地で細胞を再懸濁しをカウントします。
- 細胞のSUの100μlを加えゲル溶液900μL（最終細胞濃度5×10 5細胞/ ml）にspensionと上下に穏やかにピペッティングにより混和します。
- ゲルが重合されるまで30分間、37℃、5％CO 2インキュベーターにそれぞれ挿入し、転送に最終混合物を150μlのを追加します。
- 無血清培地を使用して、
- ゲルの上に100μlと静止状態のインサート下の1200を添加する。井の中の挿入および外側内の流体のレベルは、ゲル間の最小限の圧力差としない間流れの中で、その結果、ほぼ等しくなければなりません。
- FLOW条件のゲル上での挿入、650μlの下に100μlを添加します。彼らはこれらの場所では膜を通って移行するから細胞を防ぐことができますように、インサートの下に気泡を避けるように注意してください。これらのボリュームによって生成された圧力差は約1.3 CM H 2 O（または1ミリメートルHg）である。
- 37にプレートを置きます°C、24時間、5％CO 2インキュベーター。
2。細胞は、染色と計数
- 500の1X PBSを添加ウェルあたりに新しい24ウェルプレートを追加し、これはインサートを洗うために使用されます。
- フローのトランスウェルの上部に残っている培地を除去し、ボリュームを決定します。もともとは、650μlを（これは下記を参照してください、流量の計算に使用されます）追加された合計ボリュームから、残りのボリュームを差し引くことにより、総溶出体積を計算します。インサートからゲルを削除するには、非浸潤細胞を除去するために膜の最表面を拭くために綿棒を使用しています。インサートを洗うために15秒間の1X PBSを含む24ウェルプレートへの挿入を配置します。
- PBSを除去し、各インサートの下に4％パラホルムアルデヒド（PFA）500μlを追加して、転生細胞を固定し、室温で30分間インキュベートします。
- PFAを削除し、残留固定を削除するには、500μlの1X PBSで一回すすいでください。
- 500μlのoを追加するfを0.5％トリトンX-100に挿入下に解決し、細胞を透過処理するために室温で10分間インキュベートします。
- （転生細胞が下向き）膜面の下側を下に置くように注意して、1X PBS溶液中で2μg/ mlのDAPIの100μl中にカミソリの刃と場所を使用して、インサートの膜を切り取ります。
- 室温で30分間150rpmでシェーカー上にアルミ箔と場所のプレートをラップします。
- 無料のDAPIを削除するには、シェーカー（リピート10分ごとに3回）に500μlの1X PBSで膜を洗浄します。
- 上向きに転生細胞を用いたスライドガラスの上に置き膜は、マウントソリューションとカバースリップを追加します。
3。データ解析
- 各膜の5ランダムに選択された場所（端から離れて滞在し、10倍または20倍の対物レンズを使用）にDAPIで染色した核をカウントします。
- 平均細胞数を計算し、以下の式を使用して、パーセントの浸潤を取得します。
パーセント侵略= 100％×（平均細胞数xの膜面積）/（細胞播種の顕微鏡画像のx番号の表面積）
パーセントの浸潤は独立した実験間の比較を可能にするためにいくつかの制御条件（通常は静的な状態）に正規化することができます。 - 平均流速を計算します。インキュベーション時間（例えば24時間）することによって、フロー状態の総溶出ボリュームを分割します。
- 平均流速を計算します。ゲル/メンブレン（このケースでは60ミリメートル2）の断面積で平均流量を分割します。
4。代表的な結果
間流の下で腫瘍細胞の浸潤を測定するために、我々は、MDA-MB-435S転移性悪性黒色腫細胞を用いた我々の3次元流れの浸潤アッセイを行った。これらの細胞は、以前に間質液の流れ13から14に対応して侵入することが示されている。細胞は、1.3 mg / mlのラット太極拳からなるマトリックスに埋め込まれていたlの腱のコラーゲンI型および5×10 5細胞/ mlの最終細胞濃度が1 mg / mlのマトリゲル基底膜マトリックス。二つの異なる条件を比較した：（1）平均的な間隙流量= 0.1μmのs -1の（2）静的状態= noを測定可能な流量（ 図1）。
24時間後、膜の孔を通って侵入した細胞は、細胞計数を容易にするためにDAPIで染色した。 図2は、浸潤細胞の代表的なイメージを示しています。視野の下で、膜の孔のみが表示されています。蛍光を使用して、DAPI染色した核が細胞計数のために使用されたとファロイジン染色されたF-アクチンの構造は、細胞体（オプション）を可視化するために使用された。等分散を仮定し、スチューデントのt検定を用いて、我々はその間隙流れが大幅に静的な条件で2.3倍でMDA-MB-435S細胞浸潤（P = 0.003）（ 図3）が増加した。このcorroboraこの細胞株13から14を使用して同様の所見を（ただし、別の行列の条件、したがって、流速を含む）tesの。
図1 3-D間質液の流れ浸潤アッセイの模式図。最初に適切な濃度とボリュームを使用してゲル溶液を準備します。その後ゲル溶液にセルを追加し、細胞培養インサートに転送されます。最後に、各条件にメディアの適切な量を追加し、インキュベートします。間質液の流れが流体圧力ヘッドによって駆動されます。
図2膜上のMDA-MB-435S細胞を転生。細胞が浸潤細胞のカウントを容易にするためにDAPIおよびAlexa Fluor 488標識ファロイジンで私たちの間質液の流れ浸潤アッセイで染色した後に修正された侵略、明視野下の膜の）写真は、B）DAPI STAINED核（青）、C）のAlexa Fluor®488ファロイジン（緑色）F-アクチン染色した。スケールバーは50μmを表す。
図3は、フローの下でMDA-MB-435S細胞の浸潤を増加しました。 24時間後の細胞の浸潤が有意に間流れた（p = 0.003）によって強化されています。結果は、平均的な静的な状態に正規化され、値は6セルカルチャーインサートの平均±SEMを表しています。
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Discussion
ここでは、細胞培養インサート内の3-Dマトリックス中に埋め込まれた細胞を用いて、腫瘍細胞の浸潤の間の流れの影響を定量化する方法を説明してきました。これと同様の方法は、細胞の種類13-15、17のさまざまな格子フローの効果を調べるために使用されている。我々のアプローチは、部分的にI型コラーゲンおよび上皮組織と周囲の間質21から22の基底膜に見られる蛋白質を含むマトリゲルを使用することによって腫瘍の行列微小環境を模倣しています。このシステムは、in vitroで 23から24 の間質液の流れを研究するために使用されているほとんどのマイクロ流体デバイスをより効果的な、単純な、そしてより多くのコストアップを設定することは比較的簡単です。それは、ポンプや特殊な機器を必要とし、同時にテストする、複数の条件を可能にすることはありません。さらに、測定は一般的に侵入し、マイグレーをテストするために使用される既存のBoydenチャンバーアッセイのものと同等である癌細胞のる。
細胞型とマトリックスの組成を変化させることにより、異なる生物学的システムは、乳がん13、血管15と、樹状細胞の人身売買17として、モデル化することができます。マトリックスのプロパティと組成とを調節する圧力ヘッドを変更すると、またその結果、興味ある生物学的システムに依存するアッセイパラメータを柔軟に行うことができ、間質液の流速を変更します。このシステムは、共培養アッセイにも使用することができます14、17
侵入を測定することに加えて、ここで説明する間質液の流れアッセイは、そのようなタンパク質の発現、細胞増殖と細胞シグナル伝達イベントの違いのような他の細胞の挙動の変化を測定するために拡張することができます。細胞は容易にRNA、DNAのゲル、及びタンパク質抽出から直接単離し、そのようなPCRとウェスタンとして、その後の分子生物学的アッセイに使用することができますブロット。これは簡単に設定するとセルのシステムの数の細胞のプロセスの範囲に間隙流れの影響を調査するために適合させることができる、柔軟性の高いアッセイである。
このアッセイの主な欠点の一つは流速がマトリックス濃度の非常に依存しているという事実である。マトリゲル濃度が減少するにつれて流速が増加します。のためにこれは（<0.05μmでs -1）の間質に関連する細胞の研究に使用することができるコラーゲンのみから成るマトリックスは、マトリゲルの主になる一つのより高い流速（>1μm以下の-1）を持っていることを意味します与えられた圧力差。特定の流速が必要な場合は、最初に希望する流速を提供マトリックス組成物を識別するための最初のテストを実行することができます。ゲルの厚さは、流速を調整するために変化させることができます。アッセイはまた、個々の細胞の挙動生細胞イメージングのために許可されていません彼らのスピードと方向のdの変化を測定することができます。代わりに、このアッセイは、細胞集団全体の侵略の変化をエンドポイントの測定を提供します。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
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