Summary
Interstitiell væskestrømmen er forhøyet i solide svulster og kan modulere tumor celle invasjon. Her beskriver vi en teknikk for å søke interstitiell væske strømme til celler innebygd i en matrise, og deretter måle dens virkninger på celle invasjon. Denne teknikken kan enkelt tilpasses til å studere andre systemer.
Abstract
Veksten og utviklingen av de fleste solide svulster avhenge første transformasjon av kreftceller og deres respons til stroma-assosiert signalering i svulsten mikromiljøet en. Tidligere har forskning på svulsten mikromiljøet fokusert primært på tumor-stromale interaksjoner 1-2. Omfatter imidlertid svulsten mikromiljøet også en rekke biofysiske krefter, og hvor virkningen er fortsatt dårlig forstått. Disse kreftene er biomekaniske konsekvenser av tumorvekst som fører til endringer i genuttrykket, celledeling, differensiering og invasjon tre. Matrix tetthet 4, stivhet 5-6, og struktur 6-7, interstitiell væske press 8, og interstitiell væske strømning 8 er alt endret under kreft progresjon.
Interstitiell væskestrømmen spesielt er høyere i svulster sammenliknet med normalt vev 8-10. Den estimerte interstitiell væske flow hastighetene ble målt og funnet å være i størrelsesorden 0,1 til 3 mikrometer s -1, avhengig tumor størrelse og differensiering 9, 11. Dette skyldes forhøyet interstitiell væske press forårsaket av tumor-indusert angiogenese og økt vaskulær permeabilitet 12. Interstitiell væskestrømmen er vist å øke invasjon av kreftceller 13-14, vaskulære fibroblaster og glatte muskelceller 15. Dette invasjon kan skyldes autologe kjemotaktisk gradienter skapt rundt cellene i 3-D 16 eller økt matrise metalloproteinase (MMP) uttrykk 15, chemokine sekret og celle adhesjonsmolekyl 17 uttrykk. Imidlertid er den mekanismen som cellene ane væskestrømmen ikke godt forstått. I tillegg til å endre tumor celle atferd, modulerer interstitiell strømning aktiviteten til andre celler i svulsten mikromiljøet. Det er forbundet med (a) kjøring differensiering av fibroblaster i tumor-fremme myofibroblasts 18, (b) transport av antigener og andre løselige faktorer til lymfeknuter 19, og (c) modulerende lymfatisk endotelcelle morphogenesis 20.
Teknikken som presenteres her pålegger interstitiell strømning på celler in vitro og kvantifiserer dens virkninger på invasjon (Figur 1). Denne metoden har blitt publisert i flere studier for å måle effekten av væskestrømmen på stromal og kreft celle invasjon 13-15, 17. Ved å endre matrisen sammensetning, celletype, og cellekonsentrasjonen, kan denne metoden brukes til andre sykdommer og fysiologiske systemer for å studere effekter av interstitiell flyt på cellulære prosesser som invasjon, differensiering, spredning, og genuttrykk.
Protocol
1. Assay Set-up
- Tine en liten delmengde (<500 mL) av Matrigel på isen ved 4 ° C (ca. 2 timer).
- Forbered gel oppskrift (se f.eks volumer i tabellen nedenfor): 10x PBS (1x i total volum), 1N natriumhydroksid (tilsvarende 0,023 mengder lagt kollagen, eller per kollagen produsentens anbefalinger, som passer), skriver Matrigel og kollagen jeg til endelige konsentrasjoner på 1 mg / ml og 1,3 mg / ml henholdsvis (andre matrix formuleringer kan benyttes avhengig av celletype og eksperiment).
Eksempel gel oppskrift
| Komponenter | Stock Konsentrasjon | Endelig konsentrasjon | Legg volum |
| 10X PBS | 10X | 1X | 0.090 ml |
| Sterilt vann | 0.346 ml | ||
| 1N NaOH | 0.008 ml | ||
| Matrigel | 9,90 mg / ml | 1 mg / ml | 0.101 ml |
| Rat hale type I kollagen | 3,66 mg / ml | 1,3 mg / ml | 0.355 ml |
- Bland komponenter av gel på isen i samme rekkefølge som ovenfor og inkuber endelig løsning for en time ved 4 ° C. I vår erfaring, en 1 time inkubasjon før celle såing fører til en mer ensartet gelation av kollagen. Sørg for å holde Matrigel og kollagen på is til alle tider og til å jobbe så fort som mulig for å forhindre gelation.
- Plasser 12 mm diameter 8 mikrometer pore cellekultur settes inn en 12-brønns plate med sterilisert tang.
- Telle celler og Resuspender i serum-frie medier på 5 x 10 6 celler / ml (totalt volum bør være 10% av gel løsning).
- Tilsett 100 mL av cellen suspension til 900 mL av gel løsning (endelig cellekonsentrasjonen 5 x 10 5 celler / ml) og blandes grundig ved pipettering forsiktig opp og ned.
- Tilsett 150 mL av den endelige blandingen til hver innsatsen og overføring til 37 ° C, 5% CO 2 inkubator for 30 minutter til gel polymerizes.
- Bruk av serum-frie medier,
- Tilsett 100 mL på toppen av gel og 1200 mL under innsatsen for statisk tilstand. De væskenivåene inne innsatsen og utenfor i brønnen skal være omtrent lik, noe som resulterer i minimalt trykkforskjellen over gelen og ingen interstitiell flyt.
- Tilsett 100 mL under innsatsen og 650 mL over gel for FLOW tilstand. Vær forsiktig for å unngå luftbobler under innsatsen, som de vil hindre cellene fra å migrere gjennom membranen ved disse stedene. Trykkforskjellen som genereres av disse volumene er ca 1,3 cm H 2 O (eller 1 mm Hg).
- Sett platen i en 37° C, 5% CO 2 inkubator for 24 timer.
2. Cellefarging og telling
- Legg til 500 mL av 1X PBS per brønn inn i nye 24-brønns plate, dette vil bli brukt til å vaske skivene.
- Fjern medium igjen i den øvre delen av strømningsforholdene transwells og bestemme volumet. Beregn total eluted volum ved å trekke det resterende volumet fra det totale volum opprinnelig lagt, 650 mL (dette vil bli brukt til Infusjonshastigheten beregninger, se nedenfor). Bruk bomullspinner for å fjerne gel fra innstikk og å tørke av overflaten av membranen for å fjerne ikke-invaderte celler. Plasser setter inn 24-brønnen plate inneholder 1X PBS for 15 s for å vaske innsatser.
- Fjern PBS og legge 500 mL 4% paraformaldehyde (PFA) under hver innsatsen og Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur på å løse de transmigrated cellene.
- Fjern PFA og skyll straks med 500 mL 1X PBS å fjerne rester av bindemiddel.
- Legg til 500 mL of 0,5% Triton X-100-løsning under innsatser og inkuber 10 minutter ved romtemperatur til permeabilize cellene.
- Skjær membraner ut av innsatsen ved hjelp av et barberblad og fyll i 100 mL av 2 mikrogram / ml DAPI i 1X PBS løsning, er forsiktig med å plassere undersiden av membranen ansiktet ned (transmigrated celler med bildesiden ned).
- Pakk plate i aluminiumsfolie og legg på en shaker med 150 rpm i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask membraner i 500 mL 1X PBS på shaker (gjenta 3 ganger i 10 minutter hver) for å fjerne fri DAPI.
- Plasser membraner på glassplater med transmigrated celler vendt opp, legge montering løsning og dekkglass.
3. Data Analysis
- Telle DAPI-beiset kjerner på 5 tilfeldig valgte steder av hver membran (holde seg borte fra kantene og bruke en 10X eller 20X objektiv).
- Beregn gjennomsnittlig celletall og få prosent invasjon ved hjelp av følgende formel:
Prosent invasjon = 100% x (gjennomsnittlig celletall x membran areal) / (arealet av mikroskop bilde x antall celler sådd)
Det prosent invasjonen kan normaliseres til en viss kontroll tilstand (vanligvis statisk tilstand) for å tillate sammenlikning mellom uavhengige eksperimenter. - Beregn den gjennomsnittlige vannmengde: dele det totale eluted volumet i gjennomstrømning av inkubasjonstid (f.eks 24 timer).
- Beregne gjennomsnittlig strømningshastighet: dele den gjennomsnittlige vannmengde med tverrsnittet av gel / membran (i dette tilfellet 60 mm 2).
4. Representative Resultater
For å måle svulst celle invasjonen i henhold interstitiell flyt, utførte vi vår 3-D flyt invasjonen analysen ved hjelp av MDA-MB-435s metastatisk melanom celler. Disse cellene har tidligere vist seg å invadere i respons til interstitiell væske strømme 13-14. Cellene ble innebygd i en matrise som består av 1,3 mg / ml rotte tail sene kollagen type I og 1 mg / ml Matrigel basalmembran matrise til et endelig cellekonsentrasjonen av 5 x 10 5 celler / ml. To ulike forhold ble sammenlignet: (1) gjennomsnittlig interstitiell flyt = 0,1 mikrometer s -1 og (2) statisk tilstand = ingen målbar flow rate (figur 1).
Etter 24 timers, ble cellene som invaderte gjennom porene i membranen farget med DAPI å lette celle teller. Figur 2 viser et representativt bilde av de invaderte cellene. Under lysfelt, bare porene i membranen er synlige. Ved hjelp av fluorescens, ble DAPI-beiset kjerner brukes til celle telling og de phalloidin farget F-aktin strukturer ble brukt til å visualisere cellen kroppen (valgfritt). Ved hjelp av en Student t-test forutsatt lik varians, viste vi at interstitiell flyt signifikant øker MDA-MB-435s celle invasjon med 2,3 ganger over statisk forhold (p = 0,003) (figur 3). Dette corroborates lignende funn (men med ulike matrix forhold og derfor flyt hastigheter) som bruker denne cellelinje 13-14.
Figur 1. Skjematisk av 3-D interstitiell strømning invasjon analysen. Først forberede gel løsning med passende konsentrasjoner og volumer. Deretter legger celler til gel løsning og overføre til cellekultur innsatser. Til slutt legger passende volum av media til hver tilstand og inkuber. Interstitiell væskestrømmen er drevet av en væsketrykk hode.
Figur 2. Transmigrated MDA-MB-435s celler på membranen. Invadert cellene ble fikset etter vår interstitiell strømning invasjon analysen og beiset med DAPI og Alexa Fluor 488-konjugert phalloidin å lette telling av invaderte celler; A) Bilde av membranen i sterkt felt, B) DAPI staSAKES kjerner (i blått), C) Alexa Fluor 488-phalloidin beiset F-aktin (i grønt). Scale linjen representerer 50 mikrometer.
Figur 3. Økt invasjon av MDA-MB-435s celler under flyt. Cell invasjon etter 24 timers betydelig forbedret av interstitiell flow (p = 0,003). Resultatene er normalisert til gjennomsnittlig statisk tilstand og verdier representerer gjennomsnitt ± SEM av 6 cellekultur innsatser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet en metodikk for å kvantifisere effekten av interstitiell flyt på tumor celle invasjon, ved hjelp av celler innebygd i en 3-D matrise inne i en celle kultur innsatsen. Dette og lignende metoder har blitt brukt til å studere effekten av interstitiell flyt på en rekke celletyper 13-15, 17. Vår tilnærming etterligner delvis matrisen mikromiljøet av svulsten ved hjelp av type I kollagen og Matrigel som inneholder proteiner som finnes i basalmembran av epitelvev og de omliggende stroma 21-22. Dette systemet er relativt enkelt å sette opp, grei, og mer kostnadseffektiv enn de fleste microfluidic enheter som brukes til å studere interstitiell væskestrømmen in vitro 23-24. Det krever ikke pumper eller spesialiserte utstyr og tillater flere vilkår som må testes samtidig. Videre målingene er sammenlignbare med de av eksisterende Boyden kammerkor analyser vanligvis brukes til å teste invasjon og migrasjonsjon av kreftceller.
Ved å endre celle type og sammensetning av matrisen, kan forskjellige biologiske systemer kan modelleres, for eksempel brystkreft 13, blodkar 15, og dendrittiske celle trafficking 17. Å endre matrix egenskaper og sammensetning og modulerende trykket hodet vil også endre interstitialvæsken strømningshastighet, og dermed gir for fleksibilitet i analyseparametere avhengige av biologiske system av interesse. Dette systemet kan også brukes i co-kultur analyser. 14, 17
I tillegg til å måle invasjon, beskrev interstitiell strømning analysen her kan utvides til å måle endringer i andre celle atferd som protein uttrykk, celleproliferasjon og forskjeller i cellesignalisering hendelser. Cellene kan lett bli isolert direkte fra gel for RNA, DNA og proteiner utvinning og brukes for etterfølgende molekylærbiologiske analyser, for eksempel PCR og vestreklatt. Dette er en svært fleksibel metode som enkelt kan settes opp og tilpasses for å undersøke effektene av interstitiell flyt på en rekke cellulære prosesser i en rekke celle-systemer.
En av de viktigste ulempene med denne analysen er det faktum at flyten hastigheter er svært avhengig av matrix konsentrasjon. Strømningshastighet øker som Matrigel konsentrasjonen avtar. Dette betyr at en matrise bestående utelukkende av kollagen, som kan brukes i studiet av stroma tilknyttede celler, vil ha høyere flyt hastigheter (> 1 mikrometer s -1) enn en bestående hovedsakelig av Matrigel (<0,05 mikrometer s -1) for en gitt differansetrykk. Hvis en bestemt strømningshastighet er nødvendig, kan man først utføre en innledende test for å identifisere matrise sammensetning som gir den ønskede strømningshastighet. Tykkelsen på gel kan også varieres for å justere strømningshastighet. Analysen også ikke tillater levende celle bildebehandling, der oppførselen til individuelle celler end endringer i hastighet og retningen kan måles. I stedet gir denne analysen et endepunkt måling av endringer i invasjonen på tvers av en populasjon av celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
