Summary
Интерстициальный потока жидкости поднимается в твердых опухолях и могут модулировать опухолевой инвазии клеток. Здесь мы опишем технику применить интерстициальный потока жидкости в клетки встроены в матрицу, а затем измерить его воздействие на клетки вторжения. Этот метод может быть легко адаптирована для изучения других систем.
Abstract
Роста и прогрессирования наиболее солидных опухолей зависит от начальных преобразований раковые клетки и их реакции на строму связанных сигнализации в опухолевых микроокружения 1. Ранее исследования на опухоль микросреде была сосредоточена главным образом на стромальные опухоли взаимодействий 1-2. Тем не менее, опухоль микросреде также включает в себя различные биофизические силы, последствия которого остаются плохо. Эти силы биомеханического последствия роста опухоли, что приводит к изменениям в экспрессии генов, клеточного деления, дифференцировки и инвазии 3. Матрица плотности 4, жесткость 5-6, 6-7 и структуры, интерстициального давления жидкости 8, интерстициальный потока жидкости 8, все изменили в прогрессии рака.
Интерстициальный потока жидкости, в частности, выше в опухоли по сравнению с нормальными тканями 8-10. По оценкам интерстициальной жидкости этой скорости были измерены и признаны в диапазоне 0,1-3 мкм с -1, в зависимости от размера опухоли и дифференциации 9, 11. Это связано с повышенным давлением интерстициальной жидкости вызвано опухолью индуцированной ангиогенеза и повышенной проницаемостью сосудов 12. Интерстициальный потока жидкости было показано, что увеличение проникновение раковых клеток 13-14, сосудистые фибробластов и гладкомышечных клеток 15. Это вторжение может быть связано с аутологичной градиент хемотаксиса создали вокруг клетки в 3-D 16 или увеличение матрицы металлопротеиназы (ММП) выражение 15 секрецию хемокинов и молекул клеточной адгезии выражение 17. Тем не менее, механизм, посредством которого клетки чувствуют жидкости не очень хорошо понял. В дополнение к изменению поведения опухоли клетки, интерстициальные поток жидкости изменяет активность других клеток в опухоли микроокружения. Это связано с (а) вождение дифференциации фибробластов в опухоли содействия myofibrобласти 18, (б) транспортировки антигенов и других растворимых факторов, в лимфатические узлы 19, и (с) модуляции лимфатические эндотелиальные клетки морфогенеза 20.
Техники, представленные здесь накладывает интерстициальный потока жидкости на клетки в пробирке и количественно ее влияние на вторжение (рис. 1). Этот метод был опубликован в нескольких исследований для оценки воздействия жидкости на стромальные и вторжение раковых клеток 13-15, 17. При изменении состава матрицы, тип клеток и концентрации клеток, этот метод может быть применен к другим болезням и физиологических систем для изучения последствий внедрения потока на клеточных процессов, таких как вторжение, дифференцировке, пролиферации и экспрессии генов.
Protocol
1. Анализ Настройка
- Таяние небольшую аликвоту (<500 мкл) Матригель на льду при температуре 4 ° С (около 2 ч).
- Подготовить гель рецепт (см. например, объемы в таблице ниже): 10x PBS (1x в общем объеме), 1N гидроксида натрия (эквивалентно 0,023 объемы добавил коллагена, или в соответствии с рекомендациями коллагена производителя, в случае необходимости), Матригель и коллагена I типа в концентрации 1 мг / мл и 1,3 мг / мл соответственно (другие формулировки матрицы могут быть использованы в зависимости от типа клеток и эксперимент).
Пример рецепт геля
| Компоненты | Со концентрации | Конечная концентрация | Добавить объеме |
| 10х PBS | 10X | 1X | 0,090 мл |
| Стерильная вода | 0,346 мл | ||
| 1N NaOH | 0,008 мл | ||
| Матригель | 9,90 мг / мл | 1 мг / мл | 0,101 мл |
| Крыса хвостом типа я коллагена | 3,66 мг / мл | 1,3 мг / мл | 0,355 мл |
- Смешайте компоненты геля на лед в той же последовательности, как указано выше и инкубировать окончательное решение в течение 1 часа при температуре 4 ° C. По нашему опыту, 1 ч инкубации до посева клетки приводит к более равномерному геля из коллагена. Убедитесь в том, чтобы держать Матригель и коллагена на льду во все времена и работать как можно быстрее, чтобы предотвратить гелеобразование.
- Место 12 мм диаметром 8 мкм поры клеточной культуре вставляет в 12-луночного планшета использованием стерилизованные щипцы.
- Граф клеток и ресуспендируют в бессывороточной СМИ на 5 х 10 6 клеток / мл (общий объем не должен превышать 10% геля раствора).
- Добавить 100 мкл клеточной суspension до 900 мкл геля решение (конечная концентрация ячейки 5 х 10 5 клеток / мл) и тщательно перемешать с помощью пипетки мягко вверх и вниз.
- Добавить 150 мкл конечной смеси для каждой вставки и передачи 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора в течение 30 минут, пока гель полимеризуется.
- Использование сыворотки свободных средств массовой информации,
- Добавить 100 мкл в верхней части геля и 1200 мкл при вставке в статичном состоянии. Уровень жидкости внутри вставки и за ее пределами в скважину должны быть примерно равны, в результате чего минимальный перепад давления на геле и не интерстициальный потока.
- Добавить 100 мкл при вставке и 650 мкл выше гель для потока состоянии. Будьте осторожны, чтобы избежать воздушных пузырей под вставку, так как они мешают клеткам мигрировать через мембрану в этих местах. Перепад давления, порожденная этими объемами составляет около 1,3 см Н 2 О (или 1 мм рт.ст.).
- Место пластинки в 37° C, 5% СО 2 инкубатора в течение 24 часов.
2. Сотовые Окрашивание и подсчет
- Добавить 500 мкл 1X PBS в каждую лунку в новый 24-луночного планшета, это будет использоваться для мытья вставками.
- Удалите среду, оставшихся в верхней части потока transwells и определить объем. Рассчитать общий объем элюированных, вычитая оставшийся объем от общего объема первоначально добавил, 650 мкл (это будет использоваться для расчета расхода, см. ниже). Используйте ватные тампоны для удаления геля с вставками и протрите верхнюю поверхность мембраны для удаления, не вторглись в клетках. Поместите вставку в 24-луночного планшета содержащих 1X PBS в течение 15 секунд, чтобы вымыть вставками.
- Удалить PBS и добавьте 500 мкл 4% параформальдегид (PFA) под каждой вставки и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы исправить переселены клеткам.
- Снимите и промойте PFA раз с 500 мкл 1X PBS для удаления остатков фиксатора.
- Добавить 500 мкл оF 0.5% Тритон Х-100 решение под вставки и инкубировать 10 минут при комнатной температуре permeabilize клеток.
- Вырезать из мембран вставки помощью лезвия и место в 100 мкл 2 мкг / мл DAPI в растворе 1х PBS, будьте осторожны, чтобы разместить в нижней части мембраны вниз (переселился клетки вниз).
- Wrap пластины в алюминиевую фольгу и положите на шейкере со скоростью 150 оборотов в минуту в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Вымойте мембраны в 500 мкл 1X PBS на шейкере (повторяется 3 раза в течение 10 минут каждый), чтобы удалить свободный DAPI.
- Место мембран на стеклах с переселился клетки вверх, добавьте решение для монтажа и покровным стеклом.
3. Анализ данных
- Граф DAPI-окрашенных ядер на 5 случайно выбранных мест каждая мембрана (держаться подальше от края и 10X или 20X объектива).
- Вычислить среднее количество клеток и получения процентов вторжение, используя следующую формулу:
Процент вторжения = 100% х (в среднем клеток х мембраны площадь) / (площадь поверхности х микроскопе изображение числа клеток семенами)
Процентов вторжения могут быть нормализованы некоторые контроля состояния (как правило, статическое состояние), чтобы для сравнения независимых экспериментов. - Рассчитать среднюю скорость потока: разделить общую элюированных объема потока условие, инкубационный период (например, 24 часов).
- Рассчитаем среднюю скорость потока: разделите среднюю скорость потока по площади поперечного сечения геля / мембрана (в данном случае 60 мм 2).
4. Представитель Результаты
Для измерения опухолевой инвазии клеток в интерстициальной поток, мы выполнили наш 3-D поток вторжения методом с использованием MDA-MB-435S клетки метастатической меланомы. Эти клетки, ранее было показано, что вторжение в ответ на интерстициальный потока жидкости 13-14. Клетки были встроены в матрицу, состоящую из 1,3 мг / мл крысы тайл сухожилия коллагена типа I и 1 мг / мл Матригель базальной мембраны матрицы в конечной концентрации ячейки 5 х 10 5 клеток / мл. Две разные условия по сравнению: (1) средний поток интерстициальной = 0,1 мкм, с -1 (2) = статическое состояние не измеримой скоростью потока (рис. 1).
После того, как 24 часа в сутки, клетки, которые вторглись через поры мембраны окрашивали DAPI для облегчения подсчета клеток. На рисунке 2 показан представитель образ вторглись клеток. В светлом, только поры мембраны видны. Использование флуоресценции, DAPI-окрашенных ядер были использованы для подсчета клеток и фаллоидином окрашенных F-актин структуры используются для визуализации тела клетки (опционально). Использование Стьюдента тест предполагая равные дисперсии, мы показали, что интерстициальный поток значительно увеличивает MDA-MB-435S клетки вторжение в 2,3 раза по сравнению статических условиях (р = 0,003) (рис. 3). Это corroboraТЭС аналогичные результаты (но с разными условиями матрицы и, следовательно, скорость потока) с использованием этой клеточной линии 13-14.
Рисунок 1. Схема 3-D интерстициальный анализа потока жидкости вторжения. Первое решение подготовить гель с использованием соответствующих концентраций и объемов. Затем добавить клеток гель решение и передать вставки культуре клеток. Наконец, добавьте соответствующий объем средства массовой информации для каждого состояния и инкубировать. Интерстициальный потока жидкости обусловлена жидкости напор.
Рисунок 2. Переселился MDA-MB-435S клетки на мембране. Вторглись в клетках были зафиксированы после нашего внедрения анализа потока жидкости вторжения и окрашенных DAPI и Alexa Fluor 488-сопряженных фаллоидином для облегчения подсчета вторглись клеток) Изображение мембраны при ярком поле, б) DAPI станцииINED ядер (в синем), C) Alexa Fluor 488 фаллоидином окрашенных F-актин (зеленого цвета). Шкала бар составляет 50 мкм.
Рисунок 3. Увеличение вторжения MDA-MB-435S клеток в потоке. Сотовые вторжения после 24 часов значительно усиливается поток интерстициальной (р = 0,003). Результаты приведены к среднему статического состояния и значения представляют среднее ± SEM из 6 вставок культуре клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали методику количественной оценки эффекта внедрения потока на инвазии опухоли клетки, используя встроенный клетки в 3-D матрица в течение вставки культуре клеток. Этот и подобные методы были использованы для изучения влияния внедрения потока на различные типы клеток, 13-15, 17. Наш подход частично имитирует матрицы микроокружения опухоли с помощью типа я коллагена и Матригель, которые содержат белки в базальной мембране эпителиальных тканей и окружающей строме 21-22. Эта система относительно проста в установке, простой, и более рентабельным, чем большинство микрофлюидных устройств, которые используются для изучения интерстициальной жидкости в пробирке 23-24. Она не требует насосов или специализированного оборудования и позволяет несколько условий, которые будут протестированы одновременно. Кроме того, измерения сопоставимы с существующей камерой анализов Бойден обычно используется для проверки вторжения и миграцииТион раковых клеток.
При изменении типа клеток и состава матрицы, различные биологические системы могут быть смоделированы, таких как рак молочной железы 13, кровеносные сосуды 15, и дендритные клетки торговли 17. Изменение матрицы свойств и состава и модуляции голову давление повлечет за собой изменение скорости потока интерстициальной жидкости, что позволяет обеспечить гибкость в анализе параметров зависит от биологической системы интересов. Эта система также может быть использован совместно культуры анализов. 14, 17
В дополнение к измерению вторжения, интерстициальный анализа потока жидкости, описанные здесь могут быть расширены для измерения изменений в поведении других клеток, таких как экспрессия белков, пролиферации клеток и различия в клеточной сигнализации событий. Клетки могут быть легко изолирован прямо из геля для РНК, ДНК и белков добычи и используется для последующей молекулярной биологии анализы, такие как ПЦР и западныхпятно. Это очень гибкий анализ, который можно легко настроить и адаптировать для изучения влияния внедрения потока на ряде клеточных процессов в ряде клеточных системах.
Одним из основных недостатков данного анализа заключается в том, что скорость течения очень зависит от концентрации матрицы. Скорость потока увеличивается Матригель концентрация уменьшается. Это означает, что матрица, состоящая исключительно из коллагена, который может быть использован при изучении клеток стромы связанные, будут иметь более высокие скорости потока (> 1 мкм с -1) одного состоящие в основном из Матригель (<0,05 мкм с -1) для данного перепада давления. Если конкретная скорость потока не требуется, можно сначала выполнить начальный тест для определения состава матрицы, что обеспечивает требуемую скорость потока. Толщина геля может быть изменен для регулировки скорости потока. Анализ также не позволяет живых клеток, в которых поведение отдельных клетокг изменения в скорости и направленность могут быть измерены. Вместо этого, препарат обеспечивает конечную точку измерения изменений вторжения через популяцию клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
