Summary
İnterstisyel sıvı akışı solid tümörler yüksek olan ve tümör hücre invazyonu modüle olabilir. Burada bir matris içinde gömülü hücrelere interstisyel sıvı akışı uygulayıp sonra hücre işgali üzerine etkilerini ölçmek için bir tekniği açıklar. Bu teknik, kolayca diğer sistemlerle çalışmaya adapte edilebilir.
Abstract
En katı tümörlerin büyümesini ve ilerlemesini kanser hücreleri ve stroma ilişkili tümör mikro 1 in sinyalleşme tepkilerini başlangıç dönüşümü bağlıdır. Daha önce, tümör mikro araştırma öncelikle tümör-stroma etkileşim 1-2 odaklanmıştır. Bununla birlikte, tümör mikro de etkiler iyi anlaşılamamıştır kalır biofiziksel kuvvetleri, çeşitli içerir. Bu güçler gen ekspresyonu değişiklikleri, hücre bölünmesi, farklılaşma ve işgali 3 yol tümör büyüme biyomekanik sonuçları. Matrix yoğunluğu 4, sertliği 5-6 ve 6-7 yapısı, interstisyel sıvı basıncı 8, ve interstisyel sıvı akış 8 Tüm kanser gelişimi süresince değiştirilir.
Özellikle interstisyel sıvı akışını, normal dokularda 8-10 göre tümörlerin daha yüksektir. Tahmini interstisyel sıvı flooo hızları ölçülür ve tümör büyüklüğü ve farklılaşmasını 9, 11 bağlı olarak, 0,1-3 um s -1 aralığında olduğu bulunmuştur. Bu tümör-uyarımlı anjiyojenaz ve artan vasküler permeabilite 12 kaynaklanır yükseltilmiş interstisyel sıvının basıncı kaynaklanmaktadır. Interstisyel sıvı akışı kanser hücreleri 13-14, vasküler düz kas fibroblast ve hücreler 15 istilası artırmak için gösterilmiştir. Bu işgali 3-D 16 hücre etrafında oluşturulmuş veya matriks metalloproteinaz (MMP) ifadesi 15, kemokin sekresyon ve hücre adezyon molekül 17 arttı otolog kemotaktik gradyanlar bağlı olabilir. Ancak, hücreler sıvı akış seziyorum hangi mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Tümör hücresi davranışı değiştiren ek olarak, interstisyel sıvı akışı tümör mikro diğer hücrelerin aktivitesini modüle. Bu tümör terfili myofibr içine fibroblastlann (a) sürüş farklılaşma ile ilişkilioblastlar 18, (b) antijenleri ve lenf düğümleri 19, ve (c) modüle lenfatik endotel hücre morfojenezini 20 diğer faktörlere çözünür taşıma.
Burada sunulan tekniği Vitro hücreleri üzerinde interstisyel sıvı akışı getirir ve invazyonu (Şekil 1) üzerindeki etkilerini rakamlarla. Bu yöntem, stromal ve kanser hücresi işgali 13-15, 17 sıvı akışı etkilerini ölçmek için birçok çalışma yayınlanmıştır. Matriks kompozisyonu, hücre tipi ve hücre konsantrasyonunu değiştirerek, bu yöntem bu işgali, farklılaşma, proliferasyon ve gen ekspresyonu gibi hücresel süreçleri interstisyel akımının etkilerini incelemek amacıyla, diğer hastalıklar ve fizyolojik sistemler uygulanabilir.
Protocol
1. Test Set-up
- 4 ° C (yaklaşık 2 saat) olarak buz üzerinde Matrigel küçük bir alikotu (<500 ul) çözünmesi.
- Jel tarifi (aşağıdaki tabloda örnek sayılarını görmek) hazırlayın: 10x PBS (toplam hacim 1x), 1N sodyum hidroksit (ekledi kollajen 0.023 hacimleri eşit veya kollajen üreticinin önerilerine uygun olarak), Matrigel ve kollajen tip I 1 mg / ml ve 1.3 mg / ml, sırasıyla (diğer matris formülasyonlarının hücre tipi ve deneye bağlı olarak kullanılabilir) son konsantrasyonları.
Örnek jel tarifi
| Bileşenleri | Stok Konsantrasyon | Nihai konsantrasyon | Hacmi ekle |
| 10X PBS | 10X | 1X | 0.090 ml |
| Steril su | 0.346 ml | ||
| 1N NaOH | 0.008 ml | ||
| Matrigel | 9,90 mg / ml | 1 mg / ml | 0.101 ml |
| Sıçan kuyruk tip I kollajen | 3,66 mg / ml | 1.3 mg / ml | 0.355 ml |
- 4 ° C'de 1 saat inkübe yukarıdaki gibi ve nihai çözelti, aynı sırayla buz üzerinde jel bileşenlerinin karıştırın Deneyimlerimize göre, kollajen daha düzgün bir jelleşme hücre ekim sonuçları öncesinde 1 saat inkübasyon. Her zaman buz üzerinde Matrigel ve kollajen tutmak ve jelleşme önlemek için mümkün olduğunca hızlı biçimde çalışmaya emin olun.
- Steril forseps kullanarak 12-iyi plakasına Sıra 12 mm çapında 8 mikron gözenek hücre kültürü ekler.
- 5 x 10 6 hücre / ml (toplam hacim jeli çözeltisi% 10 olmalıdır) azından serumsuz ortam içinde hücreleri ve sayma Pastör pipetiyle.
- Hücre su 100 ul eklejel solüsyonu 900 ul (son hücre konsantrasyonu 5 x 10 5 hücre / ml) spension ve yukarı ve aşağı yavaşça pipet ile iyice karıştırın.
- Jeli polimerize kadar 30 dakika boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübatöründe için her bir ekleme ve transfer etmek Nihai karışımın 150 ul ekleyin.
- Serumsuz ortam kullanılması,
- STATİK durum için takın altından jel ve 1200 ul üstüne 100 ul ekleyin. Iyi ekleme ve dış içindeki sıvı seviyeleri jel ve hiçbir interstisyel akışı üzerinde minimal basınç farkı ile sonuçlanan, yaklaşık eşit olmalıdır.
- AKIŞ durum için jel üzerinde ekleme ve 650 ul altında 100 ul ekleyin. Onlar bu noktalarda zarını geçerek göç hücreleri önleyecek şekilde, insert altında hava kabarcığı olmamasına dikkat ediniz. Bu birimler tarafından üretilen basınç farkı yaklaşık 1.3 cm H2O (ya da 1 mm Hg) 'dir.
- 37 koyun plaka° C, 24 saat süreyle% 5 CO2 inkübatöründe.
2. Hücre Boyama ve Sayma
- 500 ul PBS 1X başına kuyuya yeni bir 24-kuyulu plakalı Add; Bu uçlar yıkamak için kullanılacaktır.
- Akış transwells üst kısmı içinde kalan orta kaldırmak ve hacim belirler. Başlangıçta, 650 ul (bu aşağıya bakın, akış hızı hesaplamaları için kullanılacak) eklenen toplam hacmin dışında kalan hacmi çıkarılarak toplam Yıkanan hacmini hesaplayın. Uçlar gelen jel kaldırmak ve non-istila hücreleri çıkarmak için membran üst yüzeyi temizlemek için pamuklu kullanabilir. Ekler yıkamak için 15 sn 1X PBS içeren 24 sıra plaka içine ekler yerleştirin.
- PBS kaldırmak ve nakledildi hücreleri düzeltmek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her ekleme ve inkübe altında 4% paraformaldehid (PFA) ile 500 ul ilave edin.
- PFA çıkarın ve kalan sabitleştirici kaldırmak için 500 ul 1X PBS ile bir kez yıkayın.
- 500 ul o eklehücrelerinin geçirgenliği, oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe uçlar ve altından f% 0.5 Triton X-100 çözeltisi.
- Aşağı membran yüzün alt yerleştirmek için dikkatli olmak, 2 mikrogram / 1X PBS solüsyonu ml DAPI 100 ul içine bir jilet ve yer kullanarak ucun zarları Kes (hücreler nakledildi yüz aşağı).
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 150 rpm'de bir çalkalayıcı içinde alüminyum folyo ve yerinde sargı plakası.
- Çalkalayıcı üzerinde 500 ul 1X PBS ücretsiz DAPI kaldırmak için (her 10 dakika için 3 defa tekrar) membran yıkayın.
- Yukarı bakacak şekilde nakledildi hücreleri ile cam lamlara Yeri membranlar, montaj çözümü ve kapak kayma ekleyin.
3. Veri Analizi
- Her membran 5 rastgele seçilmiş yerleri (uzak kenarlarından kalmak ve 10X veya 20X objektif lens kullanın) DAPI lekeli çekirdekleri sayın.
- Ortalama hücre sayısı hesaplayın ve aşağıdaki formül kullanılarak yüzde işgali edinin:
Yüzde işgali =% 100 x (ortalama hücre sayısı x membran yüzey alanı) / (hücre numaralı seribaşı mikroskop görüntüsü x sayısının yüzey alanı)
Yüzde işgali, bağımsız deneyler arasında karşılaştırma için izin vermek için bazı kontrol koşulu (genellikle statik koşul) normalize edilebilir. - Inkübasyon süresi (örneğin, 24 saat) tarafından akış durumda toplam Yıkanan hacmi bölmek: ortalama debisi hesaplayın.
- Ortalama akış hızı hesaplayınız: jel / membran (bu durumda, 60 mm 2) kesit alanı tarafından ortalama akış hızı böler.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Interstisyel akışı altında tümör hücre invazyonu ölçmek için, MDA-MB-435S metastatik melanom hücreleri kullanarak, bizim 3 boyutlu akış işgali test yapmış. Bu hücreler daha önce interstisyel sıvı akışı 13-14 yanıt olarak işgal etmek için gösterilmiştir. Hücrelerinde 1.3 mg / ml sıçan tai oluşan bir matris içine gömülül tendonu kollajen tip I ve 5 x 10 5 hücre / ml 'lik nihai bir konsantrasyon hücre 1 mg / ml Matrigel bazal membran matris. İki farklı koşulları karşılaştırıldı: (1) ortalama interstisyel akım = 0,1 mikron s -1 ve (2) statik koşul = ölçülebilir akış hızı (Şekil 1).
24 saat sonra, membran gözenekler yoluyla istila hücreleri hücre sayımı kolaylaştırmak için DAPI ile boyanmıştır. Şekil 2 istila hücreleri temsili bir görüntüsü gösterilmektedir. Aydınlık altında, membran sadece gözenekler görülebilir. Floresans kullanarak, boyalı DAPI-çekirdekler ve hücre sayımı Phalloidin lekeli F-aktin yapılar için kullanılmıştır hücre gövdesi (isteğe bağlı) canlandırmak için kullanıldı. Eşit değişkenlerle varsayarak bir Student t-testi kullanılarak, bu interstisyel akımı anlamlı (Şekil 3) (p = 0.003), statik koşullar üzerinde 2.3 kat MDA-MB-435S hücre invazyonu artırır gösterdi. Bu corroboraBu hücre hattı 13-14 kullanarak benzer bulgular (ama farklı matris koşulları ve bu nedenle akım hızları ile) da görülüyor.
Şekil 1. 3-D interstisyel sıvı akışı işgali tahlil şematik. İlk uygun konsantrasyonları ve hacimleri kullanılarak jel solüsyon hazırlanır. Daha sonra jel çözüm hücre eklemek ve hücre kültürü ekler transfer. Son olarak her bir durum için ortam uygun hacim kazandırmak ve inkübe edin. İnterstisyel sıvı akışının bir sıvı basıncı baş tarafından tahrik edilir.
Şekil 2,. Membran üzerindeki MDA-MB-435S hücreleri nakledildi. Parlak bir alan altında membran A) Resim;; işgal hücreleri istila hücrelerinin sayımı kolaylaştırmak için DAPI ve Alexa Fluor ile interstisyel sıvı akışı işgali tahlil ve lekeli 488-konjuge Phalloidin sonra tespit edildi B) DAPI stained çekirdeklerin (mavi); C) Alexa Fluor 488-Phalloidin lekeli F-aktin (yeşil). Ölçek çubuğu 50 um temsil eder.
Şekil 3. Akışı altında MDA-MB-435S hücreleri istilası yükseltildi. 24 saat sonra Hücre işgali belirgin interstisyel akışı (p = 0.003) ile güçlendirilmiştir. Sonuçlar ortalama statik durumu normalize ve değerleri 6 hücre kültürü ekler ortalama ± SEM temsil edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bir hücre kültürü içinde bir uç 3-D matriks içine gömülü hücreleri kullanılarak, tümör hücresi istilası, interstisyel akımının etkisiyle hesaplamak için bir yöntem de tarif etmiştik. Bu ve benzeri yöntemler hücre tipleri 13-15, 17, çeşitli üzerine interstisyel akış etkisini araştırmak için kullanılmıştır. Bizim yaklaşım kısmen türünü kullanarak tümörün matris mikro taklit Ben epitel doku ve çevresindeki stromada 21-22 bazal membran bulunan proteinler, kolajen ve Matrigel. Bu sistem nispeten için set-up kolay anlaşılır ve daha düşük maliyetli in vitro 23-24 interstisyel sıvı akışını incelemek için kullanılan en mikroakışkan cihazlara göre daha etkilidir. Bu pompa veya özel bir ekipman gerektirir ve eş zamanlı olarak test edilmesini sağlayan koşullar için birden fazla değildir. Ayrıca, ölçümler sık istila ve migrasyonu test etmek için kullanılan mevcut Boyden çemberinin tahlillerin kıyaslanabilirkanser hücrelerinin TION.
Hücre tipi ve matris yapısı değiştirilerek, farklı biyolojik sistemler gibi meme kanseri 13, kan damarlarının 15 ve dendritik hücre ticareti 17 olarak, örnek alınabilir. Matriks özellikleri ve bileşimi ve oransal basınç yükü değiştirilmesi de böylece ilgi biyolojik sistemine bağlı test parametreleri esneklik sağlayan, interstisyel sıvı akış hızı değişecektir. Bu sistem eş-kültürü deneyler de kullanılabilir. 14, 17
Istilası ölçüm ek olarak, interstisyel sıvı akışı deneyi gibi ekspresyon, hücre çoğalması ve hücre sinyalleşme olayları farklılıklar gibi diğer hücre davranışları değişiklikleri ölçmek üzere genişletilebilir burada açıklanan. Hücrelerin kolaylıkla RNA, jel DNA, ve protein ekstraksiyon doğrudan izole edilmiş ve örneğin PCR ve batı üzere sonraki moleküler biyoloji deneyleri için kullanılabilirlerkurulayın. Bu kolayca kurmak ve hücre sistemleri bir dizi hücresel işlemlerin bir dizi interstisyel akış etkileri araştırmak için adapte edilebilen oldukça esnek bir testtir.
Bu testin ana dezavantajı biri akım hızları matris konsantrasyon çok bağımlı olmasıdır. Matrigel konsantrasyonu azaldıkça akış hızı arttırır. Bu stroma ilişkili hücrelerinin çalışmada kullanılan kollajen sadece bir matris içeren, biri için Matrigel (<0.05 um s -1) ile esas olarak daha yüksektir oluşan akım hızları (> 1 um s -1) olması anlamına gelir Verilen bir basınç farkı. Belirli bir akış hızı gerekli ise, tek bir birinci istenen akış hızı sağlar matris bileşimi tanımlamak için bir başlangıç testi gerçekleştirebilir. Jel kalınlığı da akış hızı ayarlamak için değiştirilebilir. Assay zamanda tek tek hücrelerin davranış, bir canlı hücre görüntüleme için izin vermezonların hızı ve yönü d değişiklikleri ölçülebilir. Bunun yerine, bu deney bir hücre nüfusun genelinde işgali değişim bir son nokta ölçümü sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
