Summary
وارتقى الخلالي تدفق السوائل في الأورام الصلبة، ويمكن أن تعدل ورم غزو الخلية. نحن هنا وصفا لأسلوب لتطبيق الخلالي تدفق السوائل إلى الخلايا جزءا لا يتجزأ من مصفوفة ومن ثم قياس آثارها على غزو الخلية. ويمكن تكييف هذه التقنية بسهولة لدراسة النظم الأخرى.
Abstract
نمو وتطور الأورام الصلبة معظم تعتمد على التحول الأولي للخلايا السرطانية واستجابتها لسدى المرتبطة يشير في المكروية ورم 1. سابقا، وركز البحث على المكروية ورم في المقام الأول على الورم اللحمية التفاعلات 1-2. ومع ذلك، فإن المكروية ورم تتضمن أيضا مجموعة متنوعة من القوى الطبيعية الحيوية، وآثارها لا تزال غير مفهومة تماما. هذه القوى هي عواقب النشاط الحيوي لنمو الورم التي تؤدي إلى تغيرات في التعبير الجيني، وانقسام الخلايا، والتمايز وغزو 3. يتم تغيير جميع المصفوفة كثافة 4، صلابة 5-6، وهيكل 6-7، ضغط السائل الخلالي 8، وتدفق السوائل الخلالية 8 أثناء تقدم السرطان.
الخلالي تدفق السوائل على وجه الخصوص هو أعلى في الأورام بالمقارنة مع الأنسجة الطبيعية 8-10. ويقدر فلوريدا السائل الخلاليوتم قياس السرعات آه وجدت لتكون في حدود 0،1-3 ميكرومتر ق -1، اعتمادا على حجم الورم والتمايز 9 و 11. هذا يرجع إلى ارتفاع ضغط السائل الخلالي الناجم عن الورم الناجم عن الأوعية الدموية وزيادة نفاذية الأوعية الدموية 12. وقد تبين الخلالي تدفق السوائل لزيادة غزو الخلايا السرطانية 13-14، الليفية الوعائية وخلايا العضلات الملساء 15. هذا قد يكون عائدا لغزو التدرجات الكيميائي ذاتي خلقت حول الخلايا في D-3 16 أو زيادة مصفوفة الفلزي (MMP) التعبير 15، إفراز chemokine والتعبير جزيء التصاق الخلية 17. ومع ذلك، لم يتم الآلية التي تستشعر الخلايا تدفق السوائل مفهومة جيدا. بالإضافة إلى تغيير سلوك الخلية السرطانية، الخلالي تدفق السوائل ينظم نشاط الخلايا الأخرى في المكروية ورم. ويرتبط هذا مع التمايز القيادة (أ) من الخلايا الليفية إلى الأورام وmyofibrأقاليم 18، (ب) نقل من مولدات المضادات، وعوامل أخرى قابلة للذوبان إلى الغدد الليمفاوية 19، و (ج) تحوير التشكل الليمفاوية الخلية البطانية 20.
هذه التقنية المقدمة هنا يفرض الخلالي تدفق السوائل في الخلايا في المختبر، والكمي آثاره على غزو (الشكل 1). وقد تم نشر هذه الطريقة في دراسات متعددة لقياس الآثار المترتبة على تدفق السوائل في انسجة وخلية السرطان غزو 13-15، 17. من خلال تغيير التركيبة مصفوفة، نوع من الخلايا، وتركيز خلية، يمكن تطبيق هذه الطريقة على غيرها من الأمراض، ونظم الفسيولوجية لدراسة الآثار المترتبة على تدفق فراغي في العمليات الخلوية مثل غزو الانتشار، والتفريق، والتعبير الجيني.
Protocol
1. فحص مجموعة المتابعة
- ذوبان الجليد 1 قسامة صغيرة (<500 ميكرولتر) من Matrigel على الجليد في 4 درجات مئوية (حوالي 2 ساعة).
- اكتب Matrigel والكولاجين PBS 10X (1X في الحجم الكلي)، 1N هيدروكسيد الصوديوم (أي ما يعادل 0.023 وحدات التخزين من الكولاجين وأضاف، أو في توصيات الشركة المصنعة الكولاجين، وحسب مقتضى الحال)، وأنا على: إعداد وصفة هلام (انظر مجلدات سبيل المثال في الجدول أدناه) نهائي تركيزات 1 مل / ملغ و 1،3 ملغ / مل على التوالي (ويمكن استخدام مستحضرات مصفوفة أخرى اعتمادا على نوع من الخلايا والتجربة).
مثال جل وصفة
| مكونات | الأسهم تركيز | نهائي تركيز | إضافة حجم |
| 10X PBS | 10X | 1X | 0.090 مل |
| معقمة للمياه | 0.346 مل | ||
| 1N هيدروكسيد الصوديوم | 0.008 مل | ||
| Matrigel | 9.90 ملغ / مل | 1 ملغ / مل | 0.101 مل |
| جرذ الكولاجين ذيل النوع الأول | 3.66 ملغ / مل | 1.3 ملغ / مل | 0.355 مل |
- تخلط مكونات الجل على الجليد في نفس تسلسل على النحو الوارد أعلاه، والحل النهائي من الحضانة لمدة 1 ساعة على درجة مئوية 4 في تجربتنا، وحضانة ساعة 1 قبل نتائج بذر خلية في دبق أكثر تجانسا من الكولاجين. تأكد من أن تبقي Matrigel والكولاجين على الجليد في جميع الأوقات، والعمل في أسرع وقت ممكن لمنع دبق.
- مكان قطرها 12 ملم 8 ميكرون المسام إدراج ثقافة خلية في لوحة 12-جيدا باستخدام ملقط معقم.
- عد الخلايا وresuspend في مصل الدم خالية من وسائل الاعلام في 5 × 10 6 خلية / مل (الحجم الكلي يجب أن يكون 10٪ من حل جل).
- أضف 100 ميكروليتر من سو خليةspension إلى 900 ميكروليتر من محلول هلام (نهائي تركيز خلية 5 × 10 5 خلية / مل) ومزيج دقيق من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا.
- إضافة 150 ميكرولتر من خليط نهائي على كل إدراج ونقل إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 30 دقيقة حتى هلام polymerizes.
- استخدام مصل الدم خالية من وسائل الاعلام،
- أضف 100 ميكروليتر على أعلى من هلام وميكرولتر 1200 تحت إدراج لحالة ثابتة. ينبغي على مستويات السوائل داخل وخارج إدراج في البئر تكون متساوية تقريبا، مما أدى إلى اختلاف الضغط عبر الحد الأدنى من الجل وعدم تدفق خلالي.
- أضف 100 ميكروليتر تحت إدراج وميكرولتر 650 فوق هلام لحالة التدفق. نتوخى الحذر لتفادي أي فقاعات هواء تحت إدراج، لأنها سوف تمنع الخلايا السرطانية من الهجرة من خلال الغشاء في هذه المواقع. الفرق الضغوط التي تولدها هذه الكميات ما يقرب من 1.3 سم H 2 O (أو 1 ملم زئبق).
- لوحة في مكان 37درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 24 ساعة.
2. خلية تلطيخ والفرز
- إضافة 500 ميكروليتر من PBS 1X لكل بئر جديدة في لوحة 24-جيدا، وسوف تستخدم هذه لغسل إدراج.
- إزالة المتوسطة المتبقية في الجزء العلوي من transwells تدفق وتحديد وحدة التخزين. حساب حجم مزال مجموع بطرح حجم ما تبقى من حجم التداول الكلي واضاف في الأصل، و 650 ميكروليتر (وسوف تستخدم هذه الحسابات لمعدل التدفق، انظر أدناه). استخدم قطعة قطن لإزالة هلام من إدراج ومسح السطح العلوي للغشاء لإزالة الخلايا غير غزا. وضع تدرج في لوحة تحتوي على 24 جيد 1X برنامج تلفزيوني لمدة 15 ثانية لغسل إدراج.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ (منهاج العمل) تحت كل إدراج والحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتحديد الخلايا transmigrated.
- إزالة الآفات وشطف مرة واحدة مع 500 ميكرولتر 1X برنامج تلفزيوني لإزالة مثبت المتبقية.
- إضافة 500 س ميكرولترو 0.5٪ تريتون X-100 حل تحت إدراج واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة إلى permeabilize الخلايا.
- قطع الأغشية من إدراج باستخدام شفرة حلاقة ومكان إلى 100 ميكروليتر من 2 ميكروغرام / مل دابي في حل PBS 1X، والحرص على أن تضع الجانب السفلي من وجه غشاء أسفل (خلايا transmigrated مواجهة).
- لوحة غلاف في رقائق الألومنيوم ومكان على شاكر عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الأغشية في 500 برنامج تلفزيوني 1X ميكرولتر على شاكر (اكرر 3 مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما) لإزالة دابي الحرة.
- الأغشية مكان على شرائح الزجاج مع خلايا transmigrated مواجهة، إضافة حل التركيب وانزلاق الغطاء.
3. تحليل البيانات
- عد دابي الملطخة النوى في 5 مواقع مختارة عشوائيا من كل غشاء (البقاء بعيدا عن حواف واستخدام 10X أو 20X عدسة الهدف).
- حساب متوسط عدد خلايا والحصول على الغزو في المئة عن طريق استخدام الصيغة التالية:
غزو في المئة = X 100٪ (متوسط غشاء الخلية X العد مساحة) / (المساحة السطحية للx عدد مجهر صورة المصنف الخلايا)
ويمكن تطبيع الغزو في المئة إلى بعض حالة التحكم (عادة حالة ثابتة) للسماح للمقارنة بين تجارب مستقلة. - حساب معدل تدفق متوسط: تقسيم إجمالي حجم مزال في حالة تدفق في الوقت حضانة (على سبيل المثال، 24 ساعة).
- حساب سرعة تدفق متوسط: تقسيم معدل تدفق متوسط من منطقة مستعرضة من هلام / غشاء (في هذه الحالة 60 ملم 2).
4. ممثل النتائج
لقياس ورم غزو الخلية تحت تدفق خلالي، أجرينا لدينا غزو تدفق 3-D فحص باستخدام MDA-MB-435S خلايا سرطان الجلد المنتشر. وقد سبق هذه الخلايا أظهرت لغزو استجابة لتدفق السائل الخلالي 13-14. كانت جزءا لا يتجزأ من الخلايا في مصفوفة تتكون من 1.3 ملغ / مل تاي الفئرانل نوع وتر الكولاجين أنا و 1 ملغ / مل الغشاء القاعدي مصفوفة Matrigel بتركيز خلية النهائي من 5 خلايا س 5 10 / مل. وتمت مقارنة اثنين من ظروف مختلفة: (1) تدفق الخلالي متوسط = 0.1 ميكرون ق -1 و (2) حالة ثابتة لا = معدل التدفق للقياس (الشكل 1).
بعد 24 ساعة، تم صبغ الخلايا التي غزت من خلال مسام الغشاء مع دابي لتسهيل عملية فرز الخلية. ويبين الشكل 2 صورة ممثل غزت الخلايا. تحت brightfield، فقط مسام غشاء مرئية. واستخدمت باستخدام مضان، استخدمت نوى دابي الملطخة لفرز الخلايا والهياكل phalloidin الملون F-الأكتين لتصور جسم الخلية (اختياري). وطالب باستخدام اختبار t افتراض الفروق على قدم المساواة، وأظهرت لنا أن تدفق الخلالي يزيد بشكل كبير MDA-MB-435S غزو من قبل خلية 2.3 أضعاف خلال الظروف ثابت (P = 0.003) (الشكل 3). هذا corroboraالاحصائيين نتائج مماثلة (ولكن مع الظروف مصفوفة مختلفة، وبالتالي تدفق سرعات) باستخدام هذا الخط خلية 13-14.
الشكل 1. تخطيطي ل3-D فحص السائل الخلالي غزو تدفق. تعد أول حل الجل باستخدام تركيزات مناسبة ومجلدات. ثم تضاف إلى الخلايا حل هلام ونقل إلى إدراج ثقافة الخلية. إضافة أخيرا حجم مناسب من وسائل الإعلام إلى كل حالة واحتضان. والدافع الخلالي تدفق السوائل التي يقوم بها رئيس ضغط السائل.
Transmigrated الشكل 2. MDA-MB-435S الخلايا على غشاء. تم إصلاح الخلايا غزا بعد فحص لدينا السائل الخلالي غزو تدفق والملون مع فلور دابي واليكسا 488-مترافق phalloidin لتسهيل عد الخلايا غزت؛ صورة) من الغشاء تحت حقل مشرق ب) دابي ستاINED نوى (باللون الأزرق) ج) اليكسا فلور 488-F-phalloidin الملون الأكتين (باللون الأخضر). شريط الحجم يمثل 50 ميكرون.
زيادة الرقم 3. غزو MDA-MB-435S الخلايا تحت تدفق. غزو الخلية بعد 24 ساعة تعزز إلى حد كبير من قبل تدفق الخلالي (P = 0.003). تم تطبيع النتائج إلى حالة ثابت متوسط والقيم يعني ± SEM تمثل من 6 إدراج ثقافة الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا وقد وصفت لدينا منهجية لقياس تأثير تدفق الخلالي على غزو الخلايا السرطانية، وذلك باستخدام الخلايا جزءا لا يتجزأ من مصفوفة 3-D داخل خلية إدراج الثقافة. وقد استخدمت هذه الأساليب ومماثلة لدراسة تأثير تدفق الخلالي على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا 13-15، 17. نهجنا يقلد جزئيا المكروية مصفوفة من الورم باستخدام النوع الأول من الكولاجين وMatrigel التي تحتوي على البروتينات الموجودة في الغشاء القاعدي من الأنسجة الظهارية وستروما المحيطة 21-22. هذا النظام هو من السهل نسبيا لإنشاء، واضحة، وأكثر فعالية من حيث التكلفة من معظم الأجهزة ميكروفلويديك التي تستخدم لدراسة الخلالي تدفق السوائل في المختبر 23-24. أنها لا تتطلب مضخات أو المعدات المتخصصة ويسمح لعدة شروط منها لفحصها في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، والقياسات هي مماثلة لتلك القائمة من المقايسات غرفة بويدن يشيع استخدامها لاختبار الغزو وmigraنشوئها من الخلايا السرطانية.
عن طريق تغيير نوع من الخلايا وتكوين مصفوفة، ويمكن لنظم البيولوجية المختلفة أن تكون على غرار، مثل سرطان الثدي 13، الأوعية الدموية 15 عاما، والاتجار شجيري الخلية 17. وسوف تغيير خصائص المصفوفة وتكوينها وتحوير رئيس الضغط أيضا تغيير تدفق السائل الخلالي السرعة، مما يسمح للمرونة في معايير الفحص تعتمد على النظام البيولوجي للاهتمام. ويمكن أيضا أن هذا النظام يمكن استخدامها في المشاركة في ثقافة المقايسات. 14 و 17
بالإضافة إلى قياس غزو، وصفت تدفق السائل الخلالي فحص هنا يمكن توسيع لقياس التغيرات في السلوكيات خلية أخرى مثل بروتين تعبير، تكاثر الخلايا والاختلافات في أحداث الخلية إشارات. ويمكن بسهولة أن تعزل الخلايا مباشرة من الجل لRNA، DNA، واستخراج البروتين وتستخدم لاحقا فحوصات البيولوجيا الجزيئية، مثل PCR والغربيةوصمة عار. وهذا هو فحص درجة عالية من المرونة التي يمكن أن توضع بسهولة وتكييفها للتحقيق في الآثار المترتبة على تدفق الخلالي على مجموعة من العمليات الخلوية في عدد من النظم الخلية.
واحدة من العوائق الرئيسية لهذا الفحص هو حقيقة أن سرعات تدفق للغاية تعتمد على التركيز المصفوفة. يزيد من سرعة تدفق وتركيز Matrigel النقصان. وهذا يعني أن مصفوفة تتكون فقط من الكولاجين، والتي يمكن استخدامها في دراسة الخلايا المرتبطة بها سدى، وسيكون أعلى سرعات تدفق (> 1 ميكرومتر ق -1) من واحد تتكون أساسا من Matrigel (<0.05 ميكرون ق -1) لل فارق ضغط معين. إذا كنت بحاجة لسرعة تدفق محددة، يمكن للمرء أولا إجراء اختبار أولي لتحديد تكوين المصفوفة التي توفر سرعة تدفق المرجوة. ويمكن أيضا أن سمك هلام تكون متنوعة لضبط سرعة تدفق. الفحص أيضا لا يسمح للتصوير الخلية الحية، حيث سلوك الخلايا الفردية 1ويمكن قياس التغيرات في د السرعة والاتجاه. بدلا من ذلك، وهذا الفحص يوفر نقطة النهاية قياس التغيرات في غزو عبر مجموعة من السكان من الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
