Summary
L'écoulement du fluide interstitiel est élevée dans les tumeurs solides et peut moduler l'invasion des cellules tumorales. Nous décrivons ici une technique d'appliquer l'écoulement du fluide interstitiel aux cellules noyées dans une matrice, puis de mesurer ses effets sur l'invasion des cellules. Cette technique peut être facilement adapté pour étudier d'autres systèmes.
Abstract
La croissance et la progression de la plupart des tumeurs solides dépendra de la transformation initiale des cellules cancéreuses et leur réponse aux stroma associé à la signalisation dans le microenvironnement de la tumeur 1. Auparavant, la recherche sur le microenvironnement de la tumeur s'est principalement concentrée sur la tumeur du stroma interactions 1-2. Toutefois, le microenvironnement tumoral comprend également une variété de forces, dont les effets biophysiques encore mal compris. Ces forces sont les conséquences biomécaniques de croissance de la tumeur qui entraînent des changements dans l'expression des gènes, la division cellulaire, la différenciation et l'invasion 3. La densité de la matrice 4, la raideur 5-6, et la structure 6-7, la pression du fluide interstitiel 8, et l'écoulement du fluide interstitiel 8 sont tous modifiés lors de la progression du cancer.
L'écoulement du fluide interstitiel en particulier est plus élevé dans les tumeurs par rapport à la normale 8-10 tissus. Le fl fluide interstitiel estiméevitesses oe ont été mesurés et jugés dans la gamme de 0,1-3 um s -1, en fonction de la taille tumorale et la différenciation 9, 11. Cela est dû à la pression du fluide interstitiel élevée causée par une tumeur induite par l'angiogenèse et la perméabilité vasculaire accrue 12. L'écoulement du fluide interstitiel a été montré pour augmenter l'invasion des cellules cancéreuses 13-14, les fibroblastes et les cellules musculaires vasculaires lisses 15. Cette invasion peut être due à des gradients chimiotactiques autologues créés autour des cellules en 3-D 16 ou augmenté métalloprotéinases matricielles (MMP) l'expression 15, la sécrétion de chimiokines et de l'expression des molécules d'adhésion cellulaire 17. Cependant, le mécanisme par lequel les cellules détectent l'écoulement du fluide n'est pas bien comprise. En plus de modifier le comportement des cellules tumorales, l'écoulement du fluide interstitiel module l'activité d'autres cellules dans le microenvironnement tumoral. Il est associé à la différenciation de conduite (a) des fibroblastes en promotion de tumeurs myofibroblasts 18, (b) le transport des antigènes solubles et d'autres facteurs de ganglions lymphatiques 19, et (c) moduler la morphogenèse des cellules endothéliales lymphatique 20.
La technique présentée ici impose l'écoulement du fluide interstitiel sur des cellules in vitro et quantifie les effets sur l'invasion (figure 1). Cette méthode a été publié dans de nombreuses études pour mesurer les effets de l'écoulement du fluide sur stroma et l'invasion des cellules cancéreuses 13-15, 17. En changeant la composition de la matrice, le type de cellule, et la concentration cellulaire, cette méthode peut être appliquée à d'autres maladies et des systèmes physiologiques d'étudier les effets de l'écoulement interstitiel sur les processus cellulaires tels que l'invasion, la différenciation, la prolifération et l'expression des gènes.
Protocol
1. Essai Set-up
- Décongeler une aliquote de petite taille (<500 pi) de Matrigel sur la glace à 4 ° C (environ 2 h).
- Préparez la recette du gel (voir les volumes, par exemple dans le tableau ci-dessous): 10x PBS (1x dans le volume total), l'hydroxyde de sodium 1N (équivalent à 0,023 volumes de collagène ajoutée, ou par les recommandations du fabricant du collagène, le cas échéant), le Matrigel et du collagène de type I à des concentrations finales de 1 mg / ml et 1,3 mg / ml, respectivement (formulations de la matrice d'autres peuvent être utilisés en fonction du type de cellule et de l'expérience).
Recette gel Exemple
| Composants | Concentration d'images | Concentration finale | Ajouter le volume |
| PBS 10X | 10X | 1X | 0,090 ml |
| L'eau stérile | 0,346 ml | ||
| NaOH 1N | 0,008 ml | ||
| Matrigel | 9,90 mg / ml | 1 mg / ml | 0,101 ml |
| La queue de type I de rat collagène | 3,66 mg / ml | 1,3 mg / ml | 0,355 ml |
- Mélanger les composants du gel sur la glace dans la même séquence que ci-dessus et incuber la solution finale pendant 1 h à 4 ° C. Dans notre expérience, une incubation de 1 h avant l'ensemencement des résultats de cellules dans une gélification plus uniforme du collagène. Assurez-vous de garder Matrigel et du collagène sur la glace en tout temps et à travailler aussi vite que possible pour empêcher la gélification.
- Placer les 12 mm de diamètre 8 um pores inserts de culture cellulaire dans une plaque de 12 puits en utilisant des pinces stérilisées.
- Compter les cellules et remettre en suspension dans un milieu sans sérum à 5 x 10 6 cellules / ml (devraient être volume total de 10% de la solution de gel).
- Ajouter 100 ul de cellules suspension à 900 pi de solution de gel (concentration cellulaire finale de 5 x 10 5 cellules / ml) et bien mélanger par pipetage doucement de haut en bas.
- Ajouter 150 ul du mélange final à chaque insertion et le transfert à un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant 30 minutes jusqu'à ce que gel polymérise.
- Utilisation de milieux sans sérum,
- Ajouter 100 pi au-dessus du gel et 1200 pi sous l'insert pour l'état statique. Les niveaux de liquide à l'intérieur de l'insert et à l'extérieur dans le puits doit être approximativement égale, résultant en la différence de pression minimale dans le gel et aucun flux interstitiel.
- Ajouter 100 pi sous l'insert et 650 pi au-dessus de gel pour la condition de flux. Soyez prudent pour éviter les bulles d'air sous l'insert, car ils empêchent les cellules de migrer à travers la membrane à ces endroits. La différence de pression générée par ces volumes est d'environ 1,3 cm H 2 O (ou 1 mm Hg).
- Placer la plaque dans un 37° C, 5% de CO 2 incubateur pendant 24 heures.
2. Cellule de coloration et de comptage
- Ajouter 500 ul de PBS 1X par puits dans de nouvelles de 24 puits de plaque, ce qui sera utilisée pour laver les inserts.
- Retirer le milieu restant dans la partie supérieure des transwells écoulement et déterminer le volume. Calculer le volume total éluée en soustrayant le volume restant du volume total initialement ajouté, 650 pi (il sera utilisé pour les calculs de débit, voir ci-dessous). Utilisez des cotons-tiges pour enlever le gel des inserts et d'essuyer la surface supérieure de la membrane pour éliminer les cellules non-envahis. Placez les inserts dans la plaque de 24 puits contenant du PBS 1X pendant 15 s pour laver inserts.
- Retirez du PBS et ajouter 500 ul de paraformaldéhyde à 4% (PFA) en dessous de chaque insert et incuber pendant 30 minutes à température ambiante pour fixer les cellules transmigré.
- Retirez la PFA et rincer une fois avec 500 pl 1X PBS pour éliminer fixateur résiduel.
- Ajouter 500 ul of 0,5% Triton X-100 solution sous les inserts et les incuber pendant 10 minutes à température ambiante pour perméabiliser les cellules.
- Couper les membranes de l'insert à l'aide d'une lame de rasoir et le placer dans 100 pi de 2 ug / ml dans du PBS 1X DAPI solution, en prenant soin de placer la partie inférieure du visage membrane vers le bas (cellules transmigré face vers le bas).
- Entourer la plaque dans de l'aluminium et le placer sur un agitateur à 150 tours par minute pendant 30 minutes à température ambiante.
- Laver les membranes dans 500 ul de PBS 1X sur agitateur (répéter 3 fois pendant 10 minutes chaque) pour enlever DAPI libre.
- Membranes placer sur des lames de verre avec des cellules transmigré vers le haut, ajouter la solution de montage et de lamelle.
3. Analyse des données
- Comptez DAPI-noyaux colorés sur 5 sites choisis au hasard de chaque membrane (rester à l'écart des bords et utilisez un 10X ou 20X objectif).
- Calculer la moyenne et le nombre de cellules obtenir l'invasion pour cent en utilisant la formule suivante:
Invasions = x pour cent à 100% (moyenne numération cellulaire x surface membranaire) / (surface de l'image de microscope nombre x de cellules ensemencées)
L'invasion pour cent peut être normalisée à une condition de contrôle (généralement à l'état statique) pour permettre la comparaison entre les expériences indépendantes. - Calculer le débit moyen: diviser le volume total éluée dans la condition d'écoulement par le temps d'incubation (par exemple, 24 h).
- Calculer la vitesse d'écoulement moyenne: diviser le débit moyen par l'aire de section transversale du gel / membrane (dans ce cas à 60 mm 2).
4. Les résultats représentatifs
Pour mesurer l'invasion des cellules tumorales sous flux interstitiel, nous avons effectué notre test 3-D invasion de flux en utilisant MDA-MB-435S cellules de mélanome métastatique. Ces cellules ont déjà été montré à envahir en réponse à l'écoulement du fluide interstitiel 13-14. Les cellules ont été noyées dans une matrice composée de 1,3 mg / ml de rat taiType de l collagène de tendon I et 1 mg / ml de Matrigel matrice de la membrane sous-sol à une concentration cellulaire finale de 5 x 10 5 cellules / ml. Deux conditions différentes ont été comparées: (1) débit moyen interstitielle = 0,1 um s -1 et (2) condition statique = pas de débit mesurable (figure 1).
Après 24 h, les cellules qui ont envahi à travers les pores de la membrane ont été colorées avec du DAPI pour faciliter le comptage des cellules. La figure 2 montre une image représentative des cellules envahies. Sous fond clair, que les pores de la membrane sont visibles. Utilisation de la fluorescence, les noyaux au DAPI teinté ont été utilisés pour le comptage des cellules et les phalloïdine colorés F-actine structures ont été utilisés pour visualiser le corps de la cellule (en option). L'utilisation d'un de test t de Student en supposant des variances égales, nous avons montré que l'écoulement interstitiel augmente significativement l'invasion des cellules MDA-MB-435S de 2,3 fois par rapport à des conditions statiques (p = 0,003) (figure 3). Cette corroboraTes résultats similaires (mais avec des conditions différentes de la matrice et par conséquent la vitesse d'écoulement) en utilisant cette ligne 13-14 cellule.
Figure 1. Schéma de la 3-D dosage de liquide interstitiel invasion de flux. D'abord préparer la solution de gel en utilisant des concentrations appropriées et des volumes. Puis ajouter des cellules à la solution de gel et transfert à inserts de culture cellulaire. Enfin, ajoutez un volume approprié des médias pour chaque condition et incuber. L'écoulement de fluide interstitiel est entraîné par une tête de pression de fluide.
Figure 2. Transmigré MDA-MB-435S cellules sur la membrane. Cellules envahies ont été fixés après notre test de fluide interstitiel invasion débit et colorées avec du DAPI et Alexa Fluor 488-conjugué phalloïdine pour faciliter le comptage des cellules envahies; une image) de la membrane sous champ lumineux; B) DAPI stanoyaux Ined (en bleu); C) Alexa Fluor 488-phalloïdine teinté F-actine (en vert). La barre d'échelle représente 50 um.
Figure 3. Augmentation invasion de cellules MDA-MB-435S cellules sous écoulement. L'invasion cellulaire après 24 h significativement renforcée par écoulement interstitiel (p = 0,003). Les résultats sont normalisés à l'état statique moyenne et les valeurs représentent la moyenne ± SEM de 6 inserts de culture cellulaire.
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Discussion
Ici, nous avons décrit une méthodologie pour quantifier l'effet de l'écoulement interstitiel sur l'invasion des cellules tumorales, en utilisant des cellules noyées dans une matrice 3-D au sein d'un insert de culture cellulaire. Méthodes et d'autres semblables ont été utilisés pour étudier l'effet de l'écoulement interstitiel sur une variété de types de cellules 13-15, 17. Notre approche reproduit partiellement le microenvironnement de la tumeur matrice en utilisant collagène de type I et de Matrigel qui contiennent des protéines trouvées dans la membrane basale du tissu épithélial et le stroma environnant 21-22. Ce système est relativement facile à mettre en place, simple et plus rentable que la plupart des dispositifs microfluidiques qui sont utilisées pour étudier l'écoulement du fluide interstitiel in vitro 23-24. Il ne nécessite pas de pompes ou d'équipements spécialisés et permet de multiples conditions pour être testés simultanément. En outre, les mesures sont comparables à ceux des tests existants chambre de Boyden couramment utilisé pour tester l'invasion et la migrationtion des cellules cancéreuses.
En changeant le type de cellule et la composition de la matrice, les différents systèmes biologiques peut être modélisée, tels que le cancer du sein 13, 15 vaisseaux sanguins, et le trafic de cellules dendritiques 17. Modification des propriétés de la matrice et de la composition et la modulation de tête, la pression sera également modifier la vitesse d'écoulement du fluide interstitiel, ce qui permet une certaine souplesse dans les paramètres de dosage à charge sur le système biologique d'intérêt. Ce système peut également être utilisé dans des essais de co-culture. 14, 17
En plus de mesurer l'invasion, le dosage d'écoulement du fluide interstitiel décrit ici pourrait être élargi pour mesurer les changements dans les comportements d'autres cellules telles que l'expression des protéines, la prolifération cellulaire et différences entre les événements de signalisation cellulaire. Les cellules peuvent facilement être isolé directement à partir du gel de l'ARN, d'ADN, et l'extraction des protéines et utilisée pour les tests de biologie moléculaire, telles que la PCR et de l'ouesteffacer. Il s'agit d'un dosage très flexible qui peut être facilement mis en place et adapté pour étudier les effets de flux interstitiel sur une gamme de processus cellulaires dans un certain nombre de systèmes cellulaires.
Un des principaux inconvénients de ce test est le fait que les vitesses d'écoulement sont très dépendants de la concentration de la matrice. La vitesse d'écoulement augmente à mesure que la concentration diminue Matrigel. Cela signifie que une matrice constituée uniquement de collagène, qui peut être utilisée dans l'étude des cellules du stroma sont associés, aura des vitesses d'écoulement plus élevée (> 1 s -1 um) d'un composé essentiellement de Matrigel (moins de 0,05 pm s -1) de un différentiel de pression donnée. Si une vitesse d'écoulement spécifique est nécessaire, on peut d'abord effectuer un premier test pour identifier la composition de matrice qui fournit la vitesse d'écoulement souhaitée. L'épaisseur du gel peut également être modifiée pour ajuster la vitesse d'écoulement. Le test ne permet pas non plus pour l'imagerie des cellules vivantes, où le comportement de cellules individuelles unechangements d dans leur vitesse et de la directivité peut être mesurée. Au lieu de cela, ce test donne une mesure des variations de point de terminaison invasion à travers une population de cellules.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
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