Summary
Fluxo de fluido intersticial é elevada em tumores sólidos e pode modular a invasão de células tumorais. Descrevemos aqui uma técnica para aplicar o fluxo de fluido intersticial para as células embebidas numa matriz e, em seguida medir os seus efeitos sobre a invasão celular. Esta técnica pode ser facilmente adaptado para estudar outros sistemas.
Abstract
O crescimento ea progressão da maioria dos tumores sólidos dependem da transformação inicial das células cancerosas e da sua resposta ao estroma associado à sinalização no microambiente do tumor 1. Anteriormente, a investigação sobre o microambiente do tumor tem se concentrado principalmente em tumores estromais interações 1-2. No entanto, o microambiente do tumor também inclui uma variedade de forças biofísicas, cujos efeitos permanecem pouco compreendidas. Estas forças são conseqüências biomecânicas do crescimento do tumor que levam a mudanças na expressão gênica, a divisão celular, diferenciação e invasão 3. Matriz de densidade 4, rigidez 5-6, 6-7 e estrutura, a pressão do fluido intersticial 8, e fluxo de fluido intersticial 8 são todos alterada durante a progressão do cancro.
Fluxo de fluido intersticial em particular, é maior em tumores em comparação com 8-10 normais tecidos. O fl fluido intersticial estimadoow velocidades foram medidos e verificou-se ser na gama de 0,1-3 uM s -1, dependendo do tamanho do tumor e diferenciação 9, 11. Isto é devido à pressão do fluido intersticial elevada causada por induzida por tumor angiogénese e aumento da permeabilidade vascular 12. Fluxo de fluido intersticial foi mostrado para aumentar a invasão de células de cancro 13-14, fibroblastos vasculares e células de músculo liso 15. Esta invasão pode ser devido aos gradientes de quimiotáticas autólogas criados em torno de células em 3-D 16 ou aumentada metaloproteinase de matriz (MMP) expressão 15, a secreção de quimiocinas e células expressão da molécula de adesão 17. No entanto, o mecanismo pelo qual as células sentir o fluxo de fluido não é bem compreendida. Além de alterar o comportamento das células do tumor, o fluxo de fluido intersticial modula a actividade de outras células no microambiente do tumor. Ele está associado (a) diferenciação de condução de fibroblastos em tumor-promoção myofibroblasts 18, (b) transporte de antigénios e outros factores solúveis para linfonodos 19, e (c) modulando linfático morfogénese de células endoteliais 20.
A técnica aqui apresentada impõe fluxo de fluido intersticial em células in vitro e quantifica os seus efeitos sobre invasão (Figura 1). Este método tem sido publicado em vários estudos para medir os efeitos de fluxo de fluido sobre estroma e invasão de células do cancro 13-15, 17. Ao alterar a composição da matriz, tipo de célula, e concentração de células, este método pode ser aplicado a outras doenças e sistemas fisiológicos para estudar os efeitos de fluxo intersticial em processos celulares, tais como invasão, diferenciação, proliferação e expressão de genes.
Protocol
1. Ensaio Set-up
- Descongelar uma pequena alíquota (<uL 500) de Matrigel em gelo a 4 ° C (cerca de 2 h).
- Preparar receita gel (ver volumes exemplo na Tabela em baixo): PBS 10x (1x em volume total), hidróxido de sódio 1N (equivalente a 0,023 volumes de colagénio adicionado, ou segundo as recomendações do fabricante de colagénio, como apropriado), Matrigel e colagénio do tipo I para concentrações finais de 1 mg / ml e 1,3 mg / ml, respectivamente (formulações de matriz podem ser utilizados outros dependendo do tipo de célula e da experiência).
Receita gel exemplo
| Componentes | Concentração estoque | Concentração Final | Adicionar o volume |
| PBS 10X | 10X | 1X | 0,090 ml |
| Água estéril | 0,346 ml | ||
| NaOH 1N | 0,008 ml | ||
| Matrigel | 9,90 mg / ml | 1 mg / ml | 0,101 ml |
| Rat cauda colágeno tipo I | 3,66 mg / ml | 1,3 mg / ml | 0,355 ml |
- Misturar os componentes do gel em gelo na mesma sequência como acima e solução final incubar durante 1 hr a 4 ° C. Na nossa experiência, uma incubação de 1 hora antes da semeadura das células resultados em uma gelificação mais uniforme do colagénio. Certifique-se manter Matrigel e colágeno no gelo em todos os momentos e trabalhar o mais rápido possível para evitar gelificação.
- Coloque 12 mm de diâmetro 8 mM insere celulares poros cultura em uma placa de 12 poços usando uma pinça esterilizada.
- Contar as células e ressuspender em meio isento de soro a 5 x 10 6 células / ml (volume total deve ser de 10% da solução de gel).
- Adicionar 100 ul de su célulaspension a 900 ml de solução-gel (concentração celular final de 5 x 10 5 células / ml) e misture bem por pipetagem suavemente para cima e para baixo.
- Adicionar 150 ul da mistura final para cada inserção e transferência para uma 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 30 minutos até gel polimeriza.
- Usando meios isentos de soro,
- Adicionar 100 uL no topo do gel e 1200 uL sob o inserto para a condição estática. Os níveis de fluido no interior do inserto e fora do poço deve ser aproximadamente igual, resultando em diferença de pressão mínima através do gel e sem fluxo intersticial.
- Adicionar 100 ul sob a inserção e 650 uL acima gel para a condição de fluxo. Tenha cuidado para evitar bolhas de ar abaixo da inserção, como eles vão evitar que as células migrem através da membrana a esses locais. A diferença de pressão gerado por estes volumes é de aproximadamente 1,3 centímetros de H2O (ou 1 mm Hg).
- Coloque em uma placa de 37° C, 5% de CO 2 incubadora durante 24 horas.
2. Células coradas e Contagem
- Adicionar 500 ul de PBS 1X por poço em placas de 24 poços novo, o que irá ser usada para lavar as inserções.
- Remover o meio restante na porção superior dos transwells de fluxo e determinar o volume. Calcular o volume total de fluido, subtraindo o volume remanescente a partir do volume total originalmente adicionado, 650 uL (isto será usado para os cálculos de taxa de fluxo, ver abaixo). Use cotonetes para remover o gel a partir dos insertos e para limpar a superfície superior da membrana para remover as células não-invadidas. Colocar as inserções na placa de 24 poços contendo 1X PBS durante 15 s para lavar inserções.
- Remover PBS e adicionar 500 uL de paraformaldeído a 4% (PFA) por baixo de cada inserto e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente, para fixar as células transmigradas.
- Remover o PFA e enxaguar uma vez com 500 ul 1X PBS para remover fixador residual.
- Adicionar 500 o ulf 0,5% de Triton X-100 solução sob as inserções e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente para permeabilizar as células.
- Cortar as membranas para fora da inserção usando uma lâmina de barbear e coloque em 100 uL de 2 ug / ml em 1X DAPI solução de PBS, tendo o cuidado de a colocar o lado de baixo da face da membrana para baixo (células transmigradas viradas para baixo).
- Placa de envoltório em folha de alumínio e local num agitador a 150 rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente.
- Lave as membranas em 500 uL de PBS 1X em agitador (repetição 3 vezes durante 10 minutos cada) para remover DAPI livre.
- Membranas Coloque as lâminas de vidro com células transmigradas voltadas para cima, adicione solução de montagem e lamínula.
3. Análise de Dados
- Conte DAPI manchado de núcleos em 5 locais selecionados aleatoriamente de cada membrana (ficar longe das bordas e use um 10x ou 20x lente objetiva).
- Calcula-se a contagem média de células e obter a invasão por cento usando a seguinte fórmula:
Invasão por cento x = 100% (média contagem de células x área de superfície de membrana) / (área de superfície do número x microscópio imagem de células semeadas)
A invasão por cento pode ser normalizado a uma condição de controlo (geralmente a condição estática) para permitir a comparação entre experiências independentes. - Calcular a taxa de fluxo médio: dividir o volume total eluído na condição de fluxo pelo tempo de incubação (por exemplo, 24 hr).
- Calcula-se a velocidade de fluxo médio: dividir a taxa de fluxo médio pela área da secção transversal do gel / membrana (neste caso 60 milímetros 2).
4. Os resultados representativos
Para medir a invasão de células tumorais sob fluxo intersticial, foi realizada a nossa 3-D ensaio de invasão de fluxo, utilizando MDA-MB-435S células de melanoma metastático. Estas células têm sido anteriormente demonstrado que invadem em resposta ao fluxo de fluido intersticial 13-14. As células foram incorporados em uma matriz composta de 1,3 mg / rato ml tail colagénio do tipo I e do tendão de 1 mg / ml Matrigel matriz da membrana basal, a uma concentração celular final de 5 x 10 5 células / ml. Duas condições diferentes foram comparados: (1) o fluxo intersticial média = 0,1 uM s -1 e (2) condição estática = não caudal mensurável (Figura 1).
Após 24 horas, as células que invadiram através dos poros da membrana foram coradas com DAPI para facilitar a contagem das células. A Figura 2 mostra uma imagem representativa das células invadidas. Sob brightfield, apenas os poros da membrana são visíveis. Usando de fluorescência, os núcleos DAPI manchado foram utilizados para a contagem de célula e os faloidina coradas F-actina estruturas foram utilizados para visualizar o corpo da célula (opcional). Usando um teste t de Student-assumindo variâncias iguais, mostrámos que o fluxo intersticial aumenta significativamente MDA-MB-435S invasão de células de 2,3 vezes em relação a condições estáticas (p = 0,003) (Figura 3). Esta corroboraçãotes resultados semelhantes (mas com as condições da matriz diferentes e, portanto, velocidades de fluxo), utilizando esta linha de células de 13-14.
Figura 1. Esquemático do intersticial ensaio de fluido 3-D invasão de fluxo. Primeiro preparar solução de gel utilizando concentrações apropriadas e volumes. Em seguida, adicionar as células a solução de gel e transferir para inserções de cultura de células. Finalmente adicionar volume adequado de meios de comunicação para cada condição e incubar. Fluxo de fluido intersticial é accionado por uma cabeça de pressão de fluido.
Figura 2. Transmigradas MDA-MB-435S células em membrana. Células invadidas foram fixados após a nossa intersticial ensaio de invasão do fluxo do fluido e corados com DAPI e Alexa Fluor 488-conjugados faloidina para facilitar a contagem de células invadidas; A Picture) da membrana em campo claro; B) DAPI stanúcleos INED (em azul); C) Alexa Fluor 488-faloidina manchado F-actina (em verde). Barra de escala representa 50 um.
Figura 3. Da invasão de MDA-MB-435S células sob fluxo. Invasão celular após 24 hr significativamente melhorada pelo fluxo intersticial (p = 0,003). Os resultados são normalizados para a condição média estático e os valores representam a média ± SEM de 6 inserções de cultura de células.
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Discussion
Aqui temos descrito um método para quantificar o efeito do fluxo intersticial na invasão de células de tumor, utilizando células embebidas numa matriz de 3-D dentro de uma inserção de cultura de célula. Isto e métodos semelhantes têm sido utilizados para estudar o efeito de fluxo intersticial em uma variedade de tipos de células 13-15, 17. A nossa abordagem parcialmente imita o microambiente matriz do tumor usando colagénio tipo I e Matrigel que contêm proteínas encontradas na membrana basal de tecido epitelial e do estroma circundante 21-22. Este sistema é relativamente fácil de configurar, fácil e mais rentável do que a maioria dos dispositivos microfluídicos que são usados para estudar o fluxo de fluido intersticial in vitro 23-24. Ele não requerem bombas ou equipamentos especializados e permite a várias condições a serem testadas simultaneamente. Além disso, as medições são comparáveis às dos ensaios de câmara existente Boyden comumente utilizado para testar invasão e migraçãoção das células cancerosas.
Ao alterar o tipo de célula e da composição da matriz, diferentes sistemas biológicos podem ser modelados, tais como o cancro da mama 13, os vasos sanguíneos 15, e tráfico de células dendríticas 17. Alterando as propriedades da matriz e da composição e da cabeça da pressão modulando também irá alterar a velocidade de fluxo de fluido intersticial, permitindo assim a flexibilidade nos parâmetros de ensaio dependente do sistema biológico de interesse. Este sistema pode também ser utilizado em ensaios de co-cultura. 14, 17
Além de medir a invasão, o ensaio de fluxo de fluido intersticial descrito aqui pode ser expandido para medir as alterações no comportamento de células, tais como a expressão da proteína, a proliferação celular e as diferenças de eventos de sinalização celular. As células podem ser facilmente isolados directamente a partir do gel para o RNA, DNA, e extracção da proteína e usado para ensaios subsequentes de biologia molecular, tais como PCR e ocidentalapagar. Este é um ensaio altamente flexível que pode ser facilmente configurado e adaptado para investigar os efeitos de fluxo intersticial sobre uma série de processos celulares, em um número de sistemas de células.
Uma das principais desvantagens deste ensaio é o facto de que as velocidades de fluxo são muito dependentes da concentração de matriz. Velocidade de fluxo aumenta à medida que a concentração de Matrigel diminui. Isto significa que uma matriz constituída exclusivamente por colagénio, que pode ser usado no estudo de células do estroma associadas, terá maiores velocidades de fluxo (> 1 mícron s -1) do que uma que consiste principalmente de Matrigel (menos de 0,05 uM s -1) para um diferencial de pressão determinada. Se uma velocidade de fluxo específico é necessário, pode-se primeiro realizar um teste inicial para identificar a composição da matriz que proporciona a velocidade de fluxo desejada. A espessura do gel pode também ser variada para ajustar a velocidade de fluxo. O ensaio também não permite imagens de células vivas, onde o comportamento de células individuais umd alterações na sua velocidade e direccionalidade pode ser medido. Em vez disso, este ensaio proporciona uma medição de ponto de extremidade de alterações na invasão através de uma população de células.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
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