Summary
أصبحت المظاهرة من الأشعة السينية على نطاق واسع زاوية صغيرة الداخلي (SWAXS) نثر دور فعال في دراسة الجزيئات البيولوجية. من خلال استخدام أدوات وأساليب إجراءات محددة زاوية والإعداد، والبيانات التجريبية من SWAXS يعرض توصيف الذرية ونانو النطاق الجزيئات.
Abstract
في هذه الورقة، ويتجلى الصغيرة وزاوية تشتت الأشعة السينية (SWAXS) تحليل الجزيئات من خلال التجريب. SWAXS هي تقنية حيث تنتشر مطاطيا من أشعة X-عينة غير متجانسة في نطاق نانومتر في زوايا صغيرة (0.1 عادة - 5 °) وزوايا واسعة (عادة> 5 °). هذه التقنية يوفر معلومات حول الشكل والحجم، وتوزيع الجزيئات والمسافات سمة من المواد المطلوبة جزئيا، أحجام المسام، ونسبة السطح إلى الحجم. زاوية صغيرة للأشعة السينية نثر (SAXS) قادرة على تقديم المعلومات الهيكلية للالجزيئات بين 1 و 200 نانومتر، بينما زاوية الأشعة السينية نثر (WAXS) يمكن حل أصغر براج التباعد بين العينات 0،33 0،49 نانومتر نانومتر واستنادا إلى محددة إعداد النظام وكاشف. يتم تحديد تباعد من القانون براج وتعتمد على الطول الموجي وزاوية الحادث.
في تجربة SWAXS، يمكن أن تكون صلبة الموادأو السائلة قد تحتوي على وصلبة، سائلة أو غازية المجالات (ما يسمى الجزيئات) من نفس المادة أو لآخر في أي مجموعة. تطبيقات واسعة جدا SWAXS وتشمل جميع أنواع الغرويات: المعادن والمواد المركبات والاسمنت والنفط، والبوليمرات والبلاستيك والبروتينات، والأطعمة، والأدوية. للعينات الصلبة، يقتصر سمك 5 ملم إلى حوالي.
وترد تفاصيل استخدام أداة SWAXS مختبر المستندة في هذه الورقة. مع البرمجيات المتاحة (على سبيل المثال، GNOM-ATSAS 2،3 حزمة من Svergun D. EMBL-هامبورغ والبرامج EasySWAXS) لنظام SWAXS، يمكن أن تتم تجربة لتحديد معايير معينة ذات أهمية بالنسبة للعينة معينة. مثال واحد من جزيء التجربة البيولوجية هو التحليل من 2٪ بالوزن الليزوزيم في مخزن مؤقت المياه القائمة مائي التي يمكن اختيار وإعدادها من خلال طرق عديدة. إعداد العينة يلي المبادئ التوجيهية الواردة أدناه في إعداد القسم عينة. من خلال التجريب SWAXS،معلمات هيكلية هامة من الليزوزيم، مثل نصف قطر الدوران، يمكن تحليلها.
Protocol
1. إعداد نموذج
- استخدام إبرة لإزالة بعض من العينة عينة من الحاوية. *
- استخدام إبرة لملء الشعرية (قطر 2.2 مم كحد أقصى) مع العينة. يجب ملء الشعرية بين 2 و 3 سم من أسفل.
- إغلاق الشعرية الشمع يذوب على طرفها.
- فك حامل العينة الفراغ من النظام.
- اتخاذ الشعرية بحلول نهاية تنصهر (الشمع النهاية) وإدراج نهاية الامم المتحدة تنصهر في حامل العينة.
- ضع حامل مرة أخرى إلى النظام والمسمار في مكانه.
* يمكن العينات الصلبة (بما في ذلك عينات مسحوق) وضعها مباشرة في حامل العينة (لا يلزم الشعرية)، في حين يجب أن توضع عينات السائل في الشعرية.
بدء من آلة SWAXS
2. إجراء بدء التشغيل المصدر الباردة
- إغلاق مصراع الكاميرا عن طريق دفع زر الغالق السلامة.
- تبديل الكهرباء الرئيسية"ON" عن طريق دفع الأخضر على الزر.
- تحقق في حالات الطوارئ "للإيقاف" الزر في وضع الموسعة.
- تبديل الكهرباء الرئيسية على طريق دفع على الزر الأخضر.
- تحقق من ضوء LED باللون الأخضر التعشيق، مشيرا جميع المتداخلة لا بأس بها.
- انتظر الشاشات التي تعمل باللمس ليتم تحميلها. بمجرد أن يتم تحميل، اضغط على "R6" في القائمة.
- بدوره على مفتاح الاستعداد للموقف "ON".
- بدوره الرئيسي للأشعة السينية لموقف "ON". يجب أن الأشعة السينية الضوء الأحمر يضيء.
- انتظر الشاشات التي تعمل باللمس لقراءة مستويات الاستعداد (30 كيلو فولت و 0.4 أمبير).
- بدوره الرئيسي السلامة الاستعداد لموقف "OFF". اضغط على "دورة ابدأ" زر على الجزء السفلي من الشاشة التي تعمل باللمس.
- انتظر الشاشات التي تعمل باللمس لقراءة السلطة الاسمية (50 كيلو فولت أمبير و1). إذا هو المطلوب مستوى الطاقة المختلفة، أدخل الشاشة التكوين عن طريق الضغط على "R4" على الشاشة التي تعمل باللمس وإدخال الإعدادات المطلوبة.
3. المبرد الداخلي
- تحويل الطاقة السويسريTCH إلى الموضع "ON" على درجة حرارة لوحة التحكم. وهناك ضوء سيطرة وعرض درجة الحرارة LED تضيء.
- بدوره مفتاح الطاقة إلى وضع "ON" على التبريد.
- الانتظار حتى عرض درجة الحرارة يقرأ "OFF". هذا هو وضع الاستعداد.
- اضغط مع الاستمرار على زر ENTER (رمز العودة) لمدة 4 ثوانى أو حتى عرض درجة الحرارة درجة الحرارة يدل على وجود فعلي.
- لتغيير درجة الحرارة، والضغط على لأعلى أو لأسفل السهام. سيظهر قيمة مجموعة على الشاشة درجة الحرارة لنحو 8 ثانية قبل أن يعود إلى القيمة الفعلية.
- اضغط على زر إدخال مرة واحدة يتم عرض مجموعة قيمة المطلوب. وسوف تخزن هذه القيمة.
- الانتظار حتى تصل درجة الحرارة الفعلية قيمة مجموعة المطلوب.
ملاحظة: إذا في أي وقت الخطأ "E 01" يظهر على الشاشة درجة الحرارة، واتبع الإرشادات إيقاف مبرد، وإعادة ملء وحدة حمام بسكب المياه النقية في فيل دباباتل، ثم قم بإجراء الإجراء بدء التشغيل التبريد مرة أخرى.
4. اغلاق مبرد
- اضغط على "دخول" لحوالي 4 ثانية.
- بدوره مفتاح الطاقة إلى وضع "OFF".
5. تحول على فراغ
- ضمان يتم تأمين فراغ الباب في المكان.
- تحويل كهربائية 1 و 2 إلى المقابض المواقف "ON".
- الانتظار حتى فراغ قياس مستوى VAP5 يقرأ فراغ أقل من 1.5 ميليبار.
6. كاشف إعداد النظام
- لإعداد ضغط الغاز، تحقق من قياس الضغط الرئيسية للصمام تخفيض لا يقل عن 10 بار.
- فتح الصمام الرئيسي.
- فتح صمام الضغط ببطء التشغيل حتى يصل الضغط 8 بار في التشغيل قياس الضغط.
- فتح صمام الرئيسي الثاني
- لضبط تدفق الغاز، افتح صمام الضغط الرئيسية من خلال تحويل مقبض إلى الوضع العمودي على الغاز وحة التحكم.
- ضبط تدفقمعدل مع صمام الإبرة حتى يقرأ المقياس حوالي 8 بار.
- بدوره مفتاح الطاقة الرئيسي إلى وضع "ON". ينبغي ضوء LED تضيء.
- لضبط الجهد العالي، وتفعيل الجهد العالي من خلال تحويل المفتاح إلى موضع "ON". ينبغي ضوء LED تضيء.
- بدوره ببطء مفتاح التحكم الجهد حتى يتم التوصل حوالي 3.5kV على قياس. لا تتجاوز 4kV.
7. معايرة
- يتم تنفيذ الخطوات أعلاه التجريبية مع عينة من القمم المعروفة.
- يستخدم ASA 3.3 إلى الحصول على الرسم البياني للكثافة مقابل قناة مع 5 قمم.
- اذهب إلى القائمة خيارات → → أدخل القنوات وشدة المقابلة.
- انتقل إلى ASA3 "TPF" علامة التبويب الأولى.
- أعلى اليسار تغيير فلتر، 1 ملم النيكل (شعاع فلتر).
- توضيح موقف 32،000 (28000 مجموعة إلى 32،000، في جميع أنحاء المنطقة الحرجة 28،000) → انتقل إلى موقف، وجعل فراغ بالتأكيد هو أقل من 5 ميليبار، تأكد من كاشف هو الجرميةقرع بين 10K-1K.
- تشغيل لمدة 10 ثانية لنحو 52 تهمة لكل ثانية.
- تغيير النوافذ الطاقة، (أو قياس النافذة في مجال الطاقة مع العينة فقط، وليس بما في ذلك حالة تصفية). تعيين المدى النهائي لمدة 10 ثانية.
- العثور على الموقع من الحزم الأساسية (233 قناة على سبيل المثال).
- لأشواط أخرى، تغيير مرة أخرى لتصفية التنغستن مم 2 (W، شعاع سدادة) وتبدأ من 30،000.
- العثور على مكان كل قمم أخرى من العينات.
- استخدام البرمجيات يماغيج الكلي لمعايرة SAXS - جعل الانتقال من قناة لكثافة مقابل مقابل شدة ف (د تباعد أو) (الشكل 1).
- استخدام البرمجيات يماغيج الكلي لمعايرة WAXS - جعل الانتقال من قناة لكثافة مقابل مقابل شدة ف (د تباعد أو) (الشكل 2).
8. برامج الداخلي
- استخدام البرنامج ASA 3.3، لجمع بيانات حية: البيانات المباشرة → → TPF علامة التبويب حفظ الملف.
- لEasySWAXS، انقر على علامة التبويب إعدادات الجهاز.
- أدخل "أ"، لامدا، والقيم د، فضلا عن مركز الثقل.
- حدد الموازاة نقطة.
- حدد نوع الجسيمات الكروية (إلا اذا كان من المعروف أن قضيب من الجسيمات على شكل مسطح).
- انقر فوق علامة التبويب Guinier-القطعة. سوف يتم عرض I س 2 مقابل الرسم البياني.
- اسحب خطوط عمودية لتطويق جزء من المنحدر الخطي تقريبا.
- في الجزء السفلي من الشاشة، سيتم عرض قيمة R. بجانب هذا هناك حاجة التحقق من الصحة.
- مواصلة لسحب خطوط عمودية أقرب معا حتى قيمة التحقق من صحة ما بين 1 و 2. هذا هو ذاتي. قيمة R، أو الشعاع من الدوران، وحصل هو تقدير.
9. المصدر إيقاف الإجراءات
- التأكد من سلامة ويتم إغلاق مصاريع بسرعة.
- بدوره على مفتاح الاستعداد للموقف "ON".
- انتظر الشاشة التي تعمل باللمس لقراءة مستويات الاستعداد.
- الصحافة R5 على رouchscreen.
- تقليل الحالي إلى 0 A.
- تقليل الجهد إلى 0 A.
- بدوره على مفتاح X السينية لموقف "OFF".
- تبديل السلطة الرئيسية "OFF" عن طريق دفع زر إيقاف الحمراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SAXS وWAXS يمكن أن توفر المعلومات الهيكلية تماما من العينة من خلال المعايير التالية: نصف قطر الدوران حجم الجسيمات، والشكل، عامل بناء الحل، السطح الداخلي محددة وحجم المسام، والبعد نوع شعرية، والإلكترون كثافة 1. ويمكن أيضا SAXS WAXS تطبيقها على دراسة ديناميات البروتين 2.
يتم الحصول على المعلومات الهيكلية للتجارب SWAXS بمقارنة الأطياف الكشف تجريبيا ونتائج الحسابية للنظام. تم حساب النتائج الحسابية في البرنامج مع إمكانية معقولة فعالة V EFF (ص) وضعت نماذج من الميكانيكا الإحصائية، مثل أورنستين-Zernike (OZ) نظرية المعادلة لا يتجزأ (يمكن رؤية مثال على مثل هذا التحليل من المرجع 3) .
كجزء من أساليب تحليل البيانات، ونماذج لشدة المطلق SWAXS I (ف) سوف تحتاج إلى أن توضع في برنامج للدراسة، حيث كثافة نثر، I (س)، هي وظيفة من نقل الزخم في الفضاء المتبادل، الموجه نثر س = الخطيئة 4π (θ / 2) / λ. س الكمية العددية هي التي ترتبط زاوية نثر، θ، والطول الموجي للλ، والإشعاع. س تقع في نطاق 0،03 حتي 0،6 Å -1 في تجربة نموذجية مع SAXS مسافة العينة إلى كاشف المحدد. ويرتبط حجم المنطقة التحقيق في الفضاء الحقيقي لس س ص بواسطة = / 2π، وتقع في نطاق 11-2000 Å 4. WAXS، من ناحية أخرى، يمكن حل تباعد أكبر من 3.3 Å. الأول (س) يعتمد على ميزات الذرية، وموقف مراكز نثر الذرية. في التجربة SWAXS، لا بد أولا من معايرة قياس كثافة مقابل قناة لكثافة مقابل س أو تباعد د (الشكل 1 و ويرد مثال على تحليل SAXS من الليزوزيم في 2٪ بالوزن المياه العازلة على أساس مائي في الشكل 3. قيمة نصف قطر الدوران من الحصول على ومبين في الشكل 3 يقارن طيف إلى القيمة المتوقع تحصيلها من حوالي 1،44 نانومتر 5. ويمكن الاطلاع على المزيد من الأمثلة على كيفية تطبيق SAXS إلى الجزيئات البيولوجية من الحكام. 6-13. فرقت مثال على تحليل WAXS من الحويصلية في محلول مائي هو مبين في الشكل 4. القمم متباعدة بالتساوي مع خفض س زيادة، يقرض الحويصلية في المياه القائمة على عينة محلول مائي إلى بنية رقائقية. مع كل صفاحات، هناك انخفاض في نثر التي سوف تحدث. 
الشكل 1. معايرة SAXS مع يماغيج الكلي البرمجيات. العينة المستخدمة هي ستيرات الفضة مع تباعد د Å 48،68. يقع شعاع الأولية في قناة 367 و تقع القمم الخمس الكبرى (أو المعلمات شعرية من العينة) في 539، 717، 896، 1075، وقنوات 1253، على التوالي. 
الشكل 2. وWAXS-Callibration مع البرنامج يماغيج الكلي. العينة المستخدمة هي شبه برومو مسحوق حمض البنزويك. وتقع القمم الست الكبرى (أو المعلمات شعرية من العينة) في 484، 130، 555، 613، 657، وقنوات 902، على التوالي. 
الشكل 3. الخلفية طرح SAXS الخام البيانات من الليزوزيم (2٪ وزن). يمكن للGuinier-مؤامرة من البرامج EasySWAXS الاستفادة من س منخفضة جدا 
ويظهر الشكل 4. الخلفية طرح WAXS الخام البيانات من الحويصلية الموزعة في المحلول المائي مائي مقرها في الشكل 4A. وتظهر الرسوم البيانية التخطيطي لهيكل الحويصلية (صفاحي 1D)، رأسه ماء والذيل مسعور، مكدس في غشاء فوسفورية، وظيفتها كثافة الإلكترونات في الشكل 4B. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الإجراء النسبية لمنظومة SWAXS يسمح للمتغيرات عديدة يتم تحديدها من تحليل التجارب. يمكن استخدام المعلمات التي تم تحقيقها من التحليل لأغراض مختلفة وفقا للعينة التجريبية والإعداد. SAXS يوفر معلومات حول نانو النطاق حجم وشكل الكائن، في حين WAXS يركز على التركيب الذري والجزئي النطاق (مثل خلية شعرية الجزيئية وحدة، التماثل البعد). وبشكل أكثر تحديدا، على الجزيئات في الحلول المخففة، يمكن دراسة SAXS نصف قطرها، حجم الجسيمات التفاف الشكل و؛ لعينات عالية الكثافة، قد SAXS دراسة عامل بناء من الحل؛ لأنظمة عشوائية المرحلة التي يسهل اختراقها / 2، SAXS دراسة يمكن السطح الداخلي محددة وحجم المسام، والبلورية للعينات السائل، قد WAXS دراسة أبعاد شعرية وهيكل الخلية وحدة. ومع ذلك، وجود قيود على SWAXS هو أن مجموعة واسعة من توزيع أحجام الجسيمات أو التشتت المتعدد سوف downgr بشدةندى النتائج التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتور مانفريد Kriechbaum من XRS Hecus ومعهد الفيزياء الحيوية والأبحاث النانو في الأكاديمية النمساوية للعلوم في غراتس، النمسا. وقدم الدعم وLL XW في جزء من وزارة الطاقة في الولايات المتحدة، في إطار NERI-C جائزة رقم DE-FG07-07ID14889، والولايات المتحدة النووية هيئة تنظيم، في إطار جائزة رقم NRC-38-08-950. كما يدعم الصك SWAXS في جزء من وزارة الطاقة في الولايات المتحدة، في إطار جائزة رقم DE-NE0000325.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera | Hecus XRS and IBN, Graz, Austria |
||
| GNOM | ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg |
References
- Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
- Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
- Maranas, J. K. The effect of environment on local dynamics of macromolecules. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).
- Lysozyme in Water [Internet]. , Available from: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/lysozyme/10_analysis2.html (2008-2012).
- Stribeck, N. X-Ray Scattering of Soft Matter. , Springer. Heidelberg. (2007).
- Mertens, H. D., Svergun, D. I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. J. Struct. Biol. 172 (1), 128 (2010).
- Svergun, D. I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. Biol. Chem. 391 (7), 737 (2010).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
- Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27 (5-8), 1377-1381 (2007).
- Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures. Journal of Colloid and Interface Science. 357 (1), 88-94 (2011).
- Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution. Macromolecules. 27 (21), 6046-6054 (1994).
- Mittelbach, R., Glatter, O. Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles. Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).
