Summary
ההפגנה של הליך הזווית הקטנה ורחבה רנטגן פיזור (SWAXS) הפכה לכלי במחקר של מקרומולקולות ביולוגיות. באמצעות השימוש במכשור והנהלים של שיטות זווית ספציפיות והכנה, נתוני הניסויים מSWAXS מציגים אפיון האטומי וננו בהיקף של מקרומולקולות.
Abstract
במאמר זה, ניתוח קטן וזווית רחב רנטגן פיזור (SWAXS) של מקרומולקולות מודגם באמצעות ניסוי וטעייה. SWAXS היא טכניקה שבה צילומי רנטגן פזורים elastically ידי מדגם הומוגניות בננומטר הטווח בזוויות קטנות (בדרך כלל 0.1-5 °) וזוויות רחבות (בדרך כלל> 5 מעלות). טכניקה זו מספקת מידע על הצורה, גודל, והפצה של מקרומולקולות, מרחקים אופייניים של חומרים שהוזמנו באופן חלקי, בגדלים נקבוביים, ויחס שטח לנפח. זווית קטן רנטגן פיזור (SAXS) הוא מסוגל לספק מידע מבני של מקרומולקולות בין 1 ל 200 ננומטר, ואילו זווית רחב רנטגן פיזור (WAXS) יכול לפתור מרווח ראג קטן עוד יותר של דגימות בין 0.33 ננומטר ו0.49 ננומטר המבוסס על התקנת מערכת ספציפית וגלאי. המרווח נקבע מהחוק של בראג והוא תלוי באורך הגל וזווית אירוע.
בניסוי SWAXS, החומרים יכולים להיות מוצקיםאו נוזל ועשוי להכיל תחומים מוצקים, נוזל או גז (חלקיקים שנקראו) של אותו או חומר בכל שילוב. יישומי SWAXS הם רחבים מאוד וכוללים קולואידים מכל הסוגים: מתכות, חומרים מרוכבים, המלט, נפט, פולימרים, פלסטיק, חלבונים, מזון, ותרופות. לדגימות מוצקות, העובי מוגבל לכ 5 מ"מ.
שימוש במכשיר SWAXS מעבדה מבוססת הוא מפורט במאמר זה. עם תוכנות זמינות (לדוגמה, 2.3 חבילה GNOM-ATSAS ידי ד Svergun EMBL-המבורג ותוכנת EasySWAXS) למערכת SWAXS, ניסוי ניתן לבצע כדי לקבוע פרמטרים מסוימים של ריבית עבור המדגם הנתון. דוגמה אחת של ניסוי מקרומולקולה ביולוגי היא הניתוח של Lysozyme wt% 2 בחיץ מימי על בסיס מים שניתן לבחור והכין בשיטות רבות. הכנת המדגם עוקבת אחר ההנחיות שלהלן בהכנת הקטע לדוגמא. באמצעות ניסויי SWAXS,פרמטרים מבניים חשובים של Lysozyme, למשל הרדיוס של הסתובבות, ניתן לנתח.
Protocol
1. הכנת הדוגמא
- השתמש במחט כדי להסיר חלק מהמדגם מיכל הדגימה. *
- השתמש במחט למלא את הנימים (קוטר מרבי של 2.2 מ"מ) במדגם. הנימים חייבות להיות מלאות בין 2 ל 3 סנטימטר מחלקו התחתון.
- סגור את הנימים ידי שעווה נמסה בקצו.
- הברג החוצה את בעל מדגם הוואקום מהמערכת.
- קח את הנימים עד הסוף התמזג (שעוות הסוף) והכנס את הקצה בלתי התמזג לתוך בעל המדגם.
- הנח את המחזיק חזרה לתוך המערכת והבורג במקום.
* דגימות מוצקות (כולל דגימות אבקה) יכולות להיות ממוקמות ישירות בבעל המדגם (אין צורך נימים), בעוד שיש להציב דגימות נוזלות בנימים.
Start-Up של מכונת SWAXS
2. נוהל הפעלת מקור קר
- סגור את התריס על ידי לחיצה על כפתור צמצם הבטיחות.
- כבה את החשמל הראשי"ON" על ידי לחיצה על כפתור ירוק.
- לאמת את כפתור החירום "הכיבוי" נמצא במצב המורחב.
- כבה את החשמל הראשי על ידי לחיצה על הכפתור הירוק.
- ודא הנורית משתלבת בצבע ירוקה, המציין כל משתלב בסדר.
- חכה למסך מגע כדי לטעון. ברגע שזה נטען, לחץ על "R6" בתפריט.
- סובב את המפתח למצב המתנה "ON".
- הפעל מפתח רנטגן למצב "ON". האור האדום רנטגן צריך להדליק אותו.
- חכה למסך מגע לקריאת רמות כוננות (30 קילו וולט ו 0.4 mA).
- הפעל מפתח בטיחות מתנה למצב "OFF". לחץ על הכפתור "התחל המחזור" בחלק תחתון של מסך מגע.
- חכה למסך מגע לקריאת כוח נומינלי (50 קילו וולט ו 1 אמפר). אם רמת כוח שונה היא רצויה, להיכנס למסך הגדרות על ידי לחיצה על "R4" על מסך מגע וכניסה את ההגדרות הרצויות.
3. נוהל Chiller
- הפעל את הכח swiTCH למצב "ON" בלוח הבקרה של הטמפרטורה. נורית בקרה ותצוגת טמפרטורת LED תוארנה.
- סובב את מתג ההפעלה למצב "ON" במצנן.
- חכה עד שתצוגת הטמפרטורה קוראה "OFF". זה מצב מתנה.
- לחץ לחיצה ארוכה על כפתור הכניסה (סמל שיבה) לשנייה על 4 או עד שתצוגת הטמפרטורה עולה טמפרטורה בפועל.
- כדי לשנות את הטמפרטורה, לחץ על חצים למעלה או למטה. ערך הקבוצה יוצג על צג הטמפרטורה לכ 8 שניות לפני שהוא יחזור לערך הממשי.
- לחץ על כפתור הכניסה פעם אחת את ערך הקבוצה הרצויה מוצג. זה יהיה לאחסן את הערך.
- חכה עד שהטמפרטורה מגיעה בפועל את ערך הקבוצה הרצויה.
הערה: אם בכל זמן השגיאה "דואר 01" מופיעה בתצוגת הטמפרטורה, בצע את הוראות Chiller כיבוי, מילוי יחידת האמבטיה על ידי שפיכת מים מטוהרים אל המכל filאני, ולאחר מכן לבצע את הליך אתחול ילר שוב.
4. כיבוי של Chiller
- לחץ על "זן" לכ 4 שניות.
- סובב את מתג ההפעלה למצב "OFF".
5. הפעלת השואב
- ודא את דלת הוואקום מאובטחת במקום.
- הפעל האבק 1 ו 2 ידיות לעמדות "ב".
- חכה עד שמד הוואקום VAP5 קורא ואקום רמה פחות מ -1.5 mbar.
6. הגדרת מערכת גלאי
- כדי להגדיר את לחץ הגז, לאמת את מד הלחץ הראשי של שסתום ההפחתה הוא לפחות 10 בר.
- פתח את הברז הראשי.
- לאט לאט לפתוח את שסתום לחץ הפעלת הלחץ מגיע עד 8 בר במד לחץ ההפעלה.
- פתח את הברז הראשי השני
- כדי להתאים את זרימת גז, פתח את שסתום הלחץ העיקרי על ידי סיבוב הידית למצב האנכי בלוח בקרת הגז.
- להתאים את הזרימהשיעור עם שסתום המחט עד המד קורא כ 8 בר.
- כבה את מתג ההפעלה הראשית למצב "ON". הנורית צריכה להדליק אותו.
- כדי להתאים את המתח הגבוה, להפעיל מתח הגבוה על ידי סיבוב המתג למצב "ON". הנורית צריכה להדליק אותו.
- לאט סובב את כפתור בקרת המתח עד כ 3.5kV הוא הגיע במד. אל תחרגו 4kV.
7. כיול
- שלבי הניסוי הנ"ל בצעו עם מדגם של פסגות ידועות.
- אס"א 3.3 משמש להשגת גרף של עוצמת לעומת ערוץ עם 5 פסגות.
- עבור לתפריט אפשרויות → → הזן ערוצים ובעוצמות מתאימות.
- עבור לASA3, כרטיסייה "TPF" ראשון.
- שינוי מסנן, חלק השמאלי העליון של 1 מ"מ ניקל (קרן מסנן).
- להגדיר את העמדה 32000 (טווח ל28000 32000, אזור קריטי סביב 28000) → ללכת לעמדה, לעשות ואקום בטוח הוא מתחת ל 5 mbar, ודא הגלאי הוא פלילידינג בין 1k-10K.
- הפעל למשך 10 שניות לכ 52 ספירות לשנייה.
- שנה את חלונות האנרגיה, (או למדוד את חלון האנרגיה עם המדגם בלבד, לא כולל מקרה המסנן). הגדר את הטווח הסופי עבור 10 שניות.
- מצא את המיקום של הקורה העיקרי (233 ערוצים לדוגמה).
- עבור רץ אחר, לשנות לסנן שוב כדי טונגסטן 2 מ"מ (רוחב, אלומת פקק) ולהתחיל מ30,000.
- מצא את מיקומו של כל הפסגות האחרות של הדגימות.
- השתמש בתוכנת ImageJ מאקרו לכייל SAXS - לעשות מעברים מעוצמת לעומת ערוץ לעצמה לעומת q (או ריווח ד) (איור 1).
- השתמש בתוכנת ImageJ מאקרו לכייל WAXS - לעשות מעברים מעוצמת לעומת ערוץ לעצמה לעומת q (או ריווח ד) (איור 2).
8. נוהל תוכנה
- השתמש בתוכנת אס"א 3.3, כדי לאסוף את נתוני חיים: נתונים חיים → TPF כרטיסיית → שמור את הקובץ.
- לEasySWAXS, לחץ על כרטיסיית הגדרות ההתקן.
- הזן את "", למבדה, וערכי D, כמו גם את מרכז הכובד.
- בחר collimation פוינט.
- בחר את סוג חלקיקים כדורי (אלא אם כן הוא ידוע כמוט של חלקיקים בצורה שטוחות).
- לחץ על לשונית Guinier-המגרש. 2 גרף q לעומת אני אופיע.
- גרור את הקווים האנכיים שיקיף קטע של מדרון כ יניארי.
- בתחתית המסך, ערך R יוצג. לצד זה יש דרישת אימות.
- תמשיך לגרור את הקווים האנכיים ביחד קרוב עד ערך האימות הוא בין 1 ו 2. זה סובייקטיבי. ערך R, או הרדיוס של הסתובבות, שהושג הוא הערכה בלבד.
9. נוהל כיבוי מקור
- ודא את הבטיחות ותריסים מהירים סגורים.
- סובב את המפתח למצב המתנה "ON".
- חכה למסך מגע לקריאת רמות כוננות.
- העיתונות R5 על touchscreen.
- הפחת הנוכחי ל 0 א
- הפחת את המתח ל 0 א
- סובב את מפתח ה-X למצב "OFF".
- כבה את הכח "OFF" הראשי על ידי לחיצת כפתור מהאדום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SAXS וWAXS לגמרי יכולים לספק מידע מבני של המדגם באמצעות הפרמטרים הבאים: הרדיוס של הסתובבות, גודל חלקיקים וצורה, גורם מבנה פתרון, משטח פנימי ספציפי וגודל נקבובי, סוג סריג וממד, וצפיפות אלקטרונים 1. SAXS וWAXS יכולים להיות מיושמים גם לחקר דינמיקת חלבון 2.
המידע המבני של ניסויי SWAXS מתקבל על ידי השוואת הספקטרום זוהה בניסוי ובתוצאות החישוב של המערכת. התוצאות חישוביים חושבו בתוכנה עם פוטנציאל סביר יעיל V eff (r) התפתח ממודלי מכניקה סטטיסטיים, כגון תאורית אורנשטיין-Zernike (OZ) האינטגרלית המשוואה (דוגמה לניתוח כזה ניתן לראות ממס. 3) .
כחלק משיטות לניתוח הנתונים, המודלים לעצמה המוחלטת SWAXS אני (ש) יצטרך להיות מפותחים בתוכנה עבור מחקר, שבו עוצמת הפיזור, אני (ש), היא פונקציה של העברת התנע במרחב הדדי, פיזור וקטור q = חטא 4π (θ / 2) / λ. q הוא כמות סקלרי אשר מחוברת לזווית הפיזור, θ, ואורך הגל של הקרינה, λ. q נמצא בטווח של 0.03-0.6 Å -1 בניסוי SAXS טיפוסי עם מרחק נבחר מדגם לגלאי. גודלו של האזור נחקר במרחב אמיתי קשור לq ידי r = 2π / ש, וטמון בטווח של 4 11-2000. WAXS, מצד השני, יכול לפתור את המרווח גדול יותר מ -3.3 א. אני (ש) תלוי בתכונות האטומיות ואת המיקום של מרכזי הפיזור האטומיים. בניסוי SWAXS, תחילה בעצמה לעומת הערוץ הנמדדת חייבת להיות מכוילת לעצמה לעומת q או הריווח ד (איור 1 ו דוגמה לניתוח SAXS של Lysozyme בחיץ 2 wt% מים מבוסס מימי מוצגת באיור 3. הערך עבור רדיוס של הסתובבות מתקבל ומוצג באיור 3 משווה יפה לערך הצפוי של כ 1.44 ננומטר 5. עוד דוגמאות כיצד ליישם SAXS למקרומולקולות ביולוגיות ניתן למצוא משופטים. 6-13. דוגמה לניתוח WAXS של יפוזום פוזרה בתמיסה מימית מוצגת באיור 4. הפסגות באופן שווה במרווחים יורדות עם הגדלת q, משאילות יפוזום במדגם התמיסה המימי על בסיס המים למבנה lamellar. עם כל lamellae, יש ירידה בפיזור שיתרחש. 
איור 1. כיול SAXS עם תוכנת ImageJ מאקרו. המדגם הוא stearate כסף עם ריווח ד 48.68 א. הקרן העיקרית נמצאת בערוץ 367 והחמישה השיאים העיקריים (או פרמטרי סריג של המדגם) נמצאים ב539, 717, 896, 1075, 1253 וערוצים, בהתאמה. 
איור 2. WAXS-Callibration עם תוכנת ImageJ מאקרו. המדגם הוא אבקת חומצת Benzoic Para-Bromo. השש הפסגות המרכזיות (או פרמטרי סריג של המדגם) נמצאות ב130, 484, 555, 613, 657, 902 וערוצים, בהתאמה. 
איור 3. רקע נגרע SAXS-נתונים גולמיים של Lysozyme (2 wt%). Guinier-העלילה מתוכנת EasySWAXS יכולה לנצל את ש נמוך מאוד 
האיור 4. רקע נגרע WAXS-נתונים גולמיים של יפוזום פוזרו בתמיסה מימית על בסיס מים מוצג בתרשים 4 א. התרשימים סכמטי של מבנה יפוזום (lamellar 1D), ראשו הידרופילי והזנב הידרופובי, מחסנית קרום פוספוליפידים, ופונקצית צפיפות האלקטרונים שלו מוצגים באיור 4 ב. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך ההשוואתי של מערכת SWAXS מאפשר למשתנים רבים שייקבעו מניתוח ניסיוני. הפרמטרים שהשיגו מהניתוח יכולים לשמש למטרות שונות על פי המדגם וההתקנה ניסיונית. SAXS מספק מידע על גודל ננו בהיקף ובצורה של האובייקט, ואילו WAXS מתמקד במבנה האטומי ומייקרו בקנה מידה (סריג, למשל סימטריה מולקולרית יחידת תא ממד). באופן ספציפי יותר, לחלקיקים בפתרונות לדלל, SAXS יכול ללמוד הרדיוס של הסתובבות, גודל חלקיקים, וצורה; לדגימות צפיפות גבוהה, SAXS יכול ללמוד את גורם המבנה של הפתרון; למערכות שלב אקראיות נקבוביות / 2, SAXS יכול ללמוד משטח פנימי ספציפי וגודל נקבובי; ולדגימות גבישים נוזליות, WAXS יכול ללמוד ממדי סריג ומבנה התא היחיד. עם זאת, הגבלה של SWAXS היא שמגוון רחב של התפלגות של גדלי חלקיקים או polydispersity יהיה קשה downgrade את תוצאות הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לד"ר מנפרד Kriechbaum של XRS HECUS והמכון לביופיזיקה ומחקר נאנומערכות באקדמיה האוסטרית למדעים בגראץ, אוסטריה. LL וXW נתמכו בחלקו על ידי משרד אנרגיה של ארה"ב, פרס נרי-C מס 'DE-FG07-07ID14889, וועדה לפיקוח גרעיני בארה"ב תחת, תחת פרס המספר NRC-38-08-950. מכשיר SWAXS גם נתמך בחלקו על ידי משרד אנרגיה של ארה"ב, תחת פרס מס 'DE-NE0000325.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera | Hecus XRS and IBN, Graz, Austria |
||
| GNOM | ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg |
References
- Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
- Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
- Maranas, J. K. The effect of environment on local dynamics of macromolecules. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).
- Lysozyme in Water [Internet]. , Available from: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/lysozyme/10_analysis2.html (2008-2012).
- Stribeck, N. X-Ray Scattering of Soft Matter. , Springer. Heidelberg. (2007).
- Mertens, H. D., Svergun, D. I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. J. Struct. Biol. 172 (1), 128 (2010).
- Svergun, D. I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. Biol. Chem. 391 (7), 737 (2010).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
- Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27 (5-8), 1377-1381 (2007).
- Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures. Journal of Colloid and Interface Science. 357 (1), 88-94 (2011).
- Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution. Macromolecules. 27 (21), 6046-6054 (1994).
- Mittelbach, R., Glatter, O. Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles. Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).
