Summary
小型和广角X-射线散射(SWAXS)过程的演示已经成为有助于在研究生物大分子。通过使用特定的角度的方法和准备的仪器和程序,从SWAXS的实验数据显示大分子的原子和纳米尺度的表征。
Abstract
在本文中,小型和广角X射线散射(SWAXS)分析大分子通过实验证明。 SWAXS是一种技术,其中X-射线被弹性散射在小角度(通常为0.1 - 5°)和宽角度(通常> 5°)nm的范围中的由非均匀样品。这种技术提供的信息有关的形状,尺寸和分布的大分子,部分有序材料,孔径大小,和表面对体积之比的特征距离。小角度X射线散射(SAXS)是能够提供在1和200nm之间的大分子结构信息,而可以解决广角X射线散射(WAXS)更小布喇0.33 nm和0.49 nm的间距之间的样品的基础上具体的系统设置和检测器。的间距从布拉格定律确定,是依赖于波长和入射角。
在一个SWAXS实验,材料可以是固体或液体,并可能含有固体,液体或气体的域(所谓的粒子)的同一个或另一个的材料中的任何组合。 SWAXS的应用是非常广泛的,包括所有的类型:金属,复合材料,水泥,油,聚合物,塑料,蛋白质,食品和药品的胶体。对于固体样品的厚度被限制为约5毫米。
实验室为基础的SWAXS仪器的使用本文中详细介绍。可用的软件( 例如 ,GNOM ATSAS 2.3包由D. Svergun的EMBL-的汉堡和EasySWAXS软件的)的SWAXS系统,可以进行的实验,以确定某些参数给定的样本。生物大分子实验的一个例子,是一种水基的水性缓冲液中,可以选择并通过许多方法制备的2%(重量)中溶菌酶的分析。样品制备遵循以下准则编制的示例部分。通过SWAXS实验,的溶菌酶的重要的结构参数, 例如 ,可以分析的回转半径。
Protocol
1。的样品的制备
- 使用一根针,以除去一些样品从样品容器。
- 使用的针,以填补在毛细管(最大直径为2.2毫米)用样品。的毛细管必须填写从底部2和3厘米之间。
- 关闭的毛细血管,熔蜡器在前端。
- 拧下从系统的真空样品架。
- 以毛细管融合的结束(蜡年底),将未熔的样品架。
- 持有人将到系统中,螺杆的地方。
*固体样品(包括粉末样品),可以直接放置在样品架(没有毛细必要),而液体样品必须被放置在一个毛细管。
启动SWAXS机
2。源冷启动程序
- 在推动安全快门按钮,关闭快门。
- 切换主电源按绿色按钮上的“ON”。
- 验证紧急“关闭”按钮,在延伸的位置。
- 按下绿色的按钮切换主电源。
- 确认的联锁LED灯是绿色,表示所有的互锁确定的。
- 等待在触摸屏上加载。它加载后,按“R6”菜单上的。
- 关闭待机键,“ON”的位置。
- 转动透视关键的“ON”位置。红色的X-射线灯应点亮。
- 等待读取待机的水平(30千伏及0.4毫安)的触摸屏。
- 将备安全的关键在“OFF”的位置。按下“启动循环”的按钮,在触摸屏的底部。
- 等待在触摸屏上读额定功率(50千伏和1 mA)。如果使用不同的功率电平,进入配置屏幕,在触摸屏上按“R4”,并输入所需的设置。
3。冷水机程序
- 打开电源SWITCH在温度控制面板上的“ON”位置。的控制灯和LED温度显示器会亮起。
- 打开电源开关至“ON”的位置上冷水机组。
- 等待,直到温度显示屏显示“OFF”。这是待机模式。
- 按下并按住ENTER按钮(返回符号)约4秒或直到显示的温度指示的实际温度。
- 要改变温度,按向上或向下的箭头。将会显示在温度显示为约8秒的设定值之前,它会返回到的实际值。
- 一旦所需的设定值显示,按ENTER键。这将存储该值。
- 等待,直到实际温度达到所需的设定值。
注意:如果在任何时候出现错误“E 01”显示的温度显示,按照冷水机组停机指令,填充浇注罐过滤的纯净水洗澡单位l,然后执行冷水机组一次启动程序。
4。关闭冷水机组
- 按“输入”键约4秒。
- 打开电源开关到“OFF”的位置。
5。打开真空
- 确保真空门被固定就位。
- 真空1和2旋钮转到“ON”位置。
- 等待,直到VAP5真空表的读数小于1.5毫巴的真空度。
6。检测器的系统设置
- 要设置的气体压力,验证主压力表的减压阀是在至少10巴。
- 打开主阀。
- 慢慢地打开,直到压力达到工作压力阀的工作压力表的8栏。
- 打开第二个主阀
- 调整气体的流动,打开主配压阀,气体控制面板上通过转动旋钮到垂直位置。
- 调整流量针型阀,直到压力表读数率约8巴。
- 打开主电源开关至“ON”的位置。 LED灯应点亮。
- 要调整高电压,高电压激活的开关旋转到“ON”的位置。 LED灯应点亮。
- 慢慢转动约3.5KV电压控制旋钮,直至达到压力表上。不要超过4KV。
7。校准
- 以上的实验步骤进行与样品的已知峰。
- ASA 3.3用于获得图5峰的强度与通道。
- 进入功能表→“选项”→输入通道和相应的强度。
- ,转到ASA3,“TPF”选项卡。
- 更改过滤器,左上方1毫米镍(束过滤器)。
- 设置位置32,000(28,000至32,000范围内,大约28000名的临界区)→位置,确保真空度低于5毫巴,确保检测是原因丁1K-10K之间。
- 运行,持续10秒,每秒约52计数。
- 更改能源窗,(或只与样品,不包括过滤器的情况下测量的能量窗)。将最后的奔跑,持续10秒。
- 查找的位置的主光束(例如信道233)。
- 对于其他的运行,更改过滤器再次到2毫米钨(W,梁挡块),从30000开始。
- 查找其他所有的样品峰的位置。
- 使用ImageJ的宏的软件校准SAXS -从强度与信道转换的强度与q(下或d间距)( 图1)。
- 使用ImageJ的宏软件校准WAXS - ,从强度与信道转换的强度与q(下或d间距)( 图2)。
8。软件程序
- 使用该软件ASA 3.3,收集实时数据,实时数据“→”和TPF选项卡→“保存文件。
- 对于EasySWAXS,点击“设备设置”选项卡。
- 输入的“a”,λ,和d的值,以及重心。
- 选择点瞄准。
- 选择球状粒子类型(除非它是公知的是扁平状颗粒的杆)。
- 按一下的吉尼尔情节“选项卡上。的I和Q 2的图形将被显示出来。
- 拖动垂直线包围的部分近似直线的斜率。
- 在屏幕的底部,R值会被显示。这是一个验证的要求。
- 继续拖动垂直线更接近在一起,直到验证值是1和2之间。这是主观的。的R值,或回转半径,是一个估计。
9。来源关机程序
- 验证的安全性和快速的快门关闭。
- 关闭待机键,“ON”的位置。
- 等待所述触摸屏来读取备用水平。
- 按R5的touchscreen。
- 降低电流到0 A.
- 的电压降低到0 A。
- 转动透视键的“OFF”位置。
- 通过按下红色的关闭按钮,切换主电源“OFF”。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
小角X射线散射和WAXS完全可以提供结构信息的样品通过以下参数:回转,颗粒的大小和形状,解决方案的结构因子,具体的内表面和孔径大小,晶格的类型和尺寸,和电子密度1的半径。也可应用于小角X射线散射和WAXS研究蛋白质动力学2。
的结构信息SWAXS实验得到的实验检测到的光谱和该系统的计算结果进行比较。的计算结果,计算在一个合理的有效电位之间 Veff相关(r)从统计力学模型,如奥恩斯坦-泽尼克(OZ)积分方程理论(这样的分析的一个例子,可以看出,从参考文献3开发的软件与) 。
作为数据分析方法,模型的一部分 为SWAXS绝对强度I(Q) 将需要开发在软件中进行研究,其中的散射光的强度,I(q)的 是一个函数,在倒易空间的动量传递,散射矢量q =4π罪(θ/ 2)/λ,q是一个标量,这是连接到的散射角,θ,和辐射的波长,λ。 q在于在0.03的范围内- 0.6埃-1与一个选定的样品到检测器的距离在一个典型的SAXS实验。调查在实际空间中的区域的大小由r =2π/ Q 为 q有关,并且在于在11-2000埃4的范围内。 WAXS上,另一方面,可以解决间距大于3.3。I(q)的依赖于原子的功能和位置的原子散射中心。 ,首先在SWAXS实验测得的强度与信道必须被校准,以强度与q或晶面间距 d( 图1和 2%(重量)的水基的水性缓冲液中的溶菌酶的SAXS分析的一个例子在图3中所示。获得和在图3所示的回转半径的值很好地约1.44纳米5的预期值进行比较。更多的例子可以找到如何申请SAXS对生物大分子的文献。6-13。 WAXS的分析的一个例子,该脂质体分散在水溶液中,在图4中示出。等距峰减小而增加q,借给层状结构的脂质体中的水基溶液样品水溶液。与每个片层中,是在将发生的散射减少。
图1SAXS校准使用ImageJ的,宏软件。使用的样本是硬脂酸银与d间距48.68Å。位于主光束在信道367和五个主要的峰(或晶格参数的样本)位于539,717,896,1075,和1253的信道,分别。
图2的 WAXS -激光功率校测ImageJ的宏软件。使用的样本是帕拉 - 溴苯甲酸粉。 130,484,555,613,657,和902的通道,分别位于六个主要的峰(或晶格参数的样本)。
图3。背景,减去的小角X射线散射的原始数据的溶菌酶(2%(重量))。 EasySWAXS的吉尼尔情节,软件可以利用非常低的Q
在图4A中示出图4。扣除背景WAXS的原始数据的脂质体分散在一种水基水溶液。脂质体的结构示意图(1D层状),其亲水的头部和疏水尾部,其磷脂膜堆,其电子密度函数如图4B所示, 点击此处查看大图 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
比较程序的SWAXS系统的允许众多变量来确定实验分析。从分析中获得的参数,这些参数可以被用于不同的目的,根据样品和实验设置。 SAXS提供纳米尺度的对象的大小和形状有关下列内容的信息,而WAXS重点上的原子和微观尺度的结构( 如分子晶格,晶胞尺寸对称性)。更具体地,在稀溶液中的颗粒,小角X射线散射可以研究回转,粒子大小和形状的半径;用于高密度的样品,小角X射线散射可能研究的解决方案的结构因子;随机多孔/ 2移相系统,小角X射线散射可以研究具体的内表面和孔的尺寸;和液体结晶样品,的WAXS可能研究晶格尺寸和单元结构。然而,限制的SWAXS是广泛的分布的粒子尺寸或分散度将严重downgr的腺的实验结果。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们想感谢曼弗雷德Kriechbaum Hecus XRS和在奥地利格拉茨的奥地利科学院生物物理研究所和纳米系统研究。 LL和XW部分由美国能源部支持下,NERI-C号DE-FG07-07ID14889奖,美国核管理委员会,根据奖励编号:NRC-38-08-950。部分由美国能源部也支持SWAXS仪器,在裁决号DE-NE0000325。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera | Hecus XRS and IBN, Graz, Austria |
||
GNOM | ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg |
References
- Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
- Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
- Maranas, J. K. The effect of environment on local dynamics of macromolecules. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).
- Lysozyme in Water [Internet]. , Available from: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/lysozyme/10_analysis2.html (2008-2012).
- Stribeck, N. X-Ray Scattering of Soft Matter. , Springer. Heidelberg. (2007).
- Mertens, H. D., Svergun, D. I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. J. Struct. Biol. 172 (1), 128 (2010).
- Svergun, D. I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. Biol. Chem. 391 (7), 737 (2010).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
- Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27 (5-8), 1377-1381 (2007).
- Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures. Journal of Colloid and Interface Science. 357 (1), 88-94 (2011).
- Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution. Macromolecules. 27 (21), 6046-6054 (1994).
- Mittelbach, R., Glatter, O. Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles. Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).