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Bioengineering

小型和广角X-射线散射研究生物大分子的解决方案

doi: 10.3791/4160 Published: January 8, 2013

Summary

小型和广角X-射线散射(SWAXS)过程的演示已经成为有助于在研究生物大分子。通过使用特定的角度的方法和准备的仪器和程序,从SWAXS的实验数据显示大分子的原子和纳米尺度的表征。

Abstract

在本文中,小型和广角X射线散射(SWAXS)分析大分子通过实验证明。 SWAXS是一种技术,其中X-射线被弹性散射在小角度(通常为0.1 - 5°)和宽角度(通常> 5°)nm的范围中的由非均匀样品。这种技术提供的信息有关的形状,尺寸和分布的大分子,部分有序材料,孔径大小,和表面对体积之比的特征距离。小角度X射线散射(SAXS)是能够提供在1和200nm之间的大分子结构信息,而可以解决广角X射线散射(WAXS)更小布喇0.33 nm和0.49 nm的间距之间的样品的基础上具体的系统设置和检测器。的间距从布拉格定律确定,是依赖于波长和入射角。

在一个SWAXS实验,材料可以是固体或液体,并可能含有固体,液体或气体的域(所谓的粒子)的同一个或另一个的材料中的任何组合。 SWAXS的应用是非常广泛的,包括所有的类型:金属,复合材料,水泥,油,聚合物,塑料,蛋白质,食品和药品的胶体。对于固体样品的厚度被限制为约5毫米。

实验室为基础的SWAXS仪器的使用本文中详细介绍。可用的软件( 例如 ,GNOM ATSAS 2.3包由D. Svergun的EMBL-的汉堡和EasySWAXS软件的)的SWAXS系统,可以进行的实验,以确定某些参数给定的样本。生物大分子实验的一个例子,是一种水基的水性缓冲液中,可以选择并通过许多方法制备的2%(重量)中溶菌酶的分析。样品制备遵循以下准则编制的示例部分。通过SWAXS实验,的溶菌酶的重要的结构参数, 例如 ,可以分析的回转半径。

Protocol

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1。的样品的制备

  1. 使用一根针,以除去一些样品从样品容器。
  2. 使用的针,以填补在毛细管(最大直径为2.2毫米)用样品。的毛细管必须填写从底部2和3厘米之间。
  3. 关闭的毛细血管,熔蜡器在前端。
  4. 拧下从系统的真空样品架。
  5. 以毛细管融合的结束(蜡年底),将未熔的样品架。
  6. 持有人将到系统中,螺杆的地方。

*固体样品(包括粉末样品),可以直接放置在样品架(没有毛细必要),而液体样品必须被放置在一个毛细管。

启动SWAXS机

2。源冷启动程序

  1. 在推动安全快门按钮,关闭快门。
  2. 切换主电源按绿色按钮上的“ON”。
  3. 验证紧急“关闭”按钮,在延伸的位置。
  4. 按下绿色的按钮切换主电源。
  5. 确认的联锁LED灯是绿色,表示所有的互锁确定的。
  6. 等待在触摸屏上加载。它加载后,按“R6”菜单上的。
  7. 关闭待机键,“ON”的位置。
  8. 转动透视关键的“ON”位置。红色的X-射线灯应点亮。
  9. 等待读取待机的水平(30千伏及0.4毫安)的触摸屏。
  10. 将备安全的关键在“OFF”的位置。按下“启动循环”的按钮,在触摸屏的底部。
  11. 等待在触摸屏上读额定功率(50千伏和1 mA)。如果使用不同的功率电平,进入配置屏幕,在触摸屏上按“R4”,并输入所需的设置。

3。冷水机程序

  1. 打开电源SWITCH在温度控制面板上的“ON”位置。的控制灯和LED温度显示器会亮起。
  2. 打开电源开关至“ON”的位置上冷水机组。
  3. 等待,直到温度显示屏显示“OFF”。这是待机模式。
  4. 按下并按住ENTER按钮(返回符号)约4秒或直到显示的温度指示的实际温度。
  5. 要改变温度,按向上或向下的箭头。将会显示在温度显示为约8秒的设定值之前,它会返回到的实际值。
  6. 一旦所需的设定值显示,按ENTER键。这将存储该值。
  7. 等待,直到实际温度达到所需的设定值。

注意:如果在任何时候出现错误“E 01”显示的温度显示,按照冷水机组停机指令,填充浇注罐过滤的纯净水洗澡单位l,然后执行冷水机组一次启动程序。

4。关闭冷水机组

  1. 按“输入”键约4秒。
  2. 打开电源开关到“OFF”的位置。

5。打开真空

  1. 确保真空门被固定就位。
  2. 真空1和2旋钮转到“ON”位置。
  3. 等待,直到VAP5真空表的读数小于1.5毫巴的真空度。

6。检测器的系统设置

  1. 要设置的气体压力,验证主压力表的减压阀是在至少10巴。
  2. 打开主阀。
  3. 慢慢地打开,直到压力达到工作压力阀的工作压力表的8栏。
  4. 打开第二个主阀
  5. 调整气体的流动,打开主配压阀,气体控制面板上通过转动旋钮到垂直位置。
  6. 调整流量针型阀,直到压力表读数率约8巴。
  7. 打开主电源开关至“ON”的位置。 LED灯应点亮。
  8. 要调整高电压,高电压激活的开关旋转到“ON”的位置。 LED灯应点亮。
  9. 慢慢转动约3.5KV电压控制旋钮,直至达到压力表上。不要超过4KV。

7。校准

  1. 以上的实验步骤进行与样品的已知峰。
  2. ASA 3.3用于获得图5峰的强度与通道。
  3. 进入功能表→“选项”→输入通道和相应的强度。
  4. ,转到ASA3,“TPF”选项卡。
  5. 更改过滤器,左上方1毫米镍(束过滤器)。
  6. 设置位置32,000(28,000至32,000范围内,大约28000名的临界区)→位置,确保真空度低于5毫巴,确保检测是原因丁1K-10K之间。
  7. 运行,持续10秒,每秒约52计数。
  8. 更改能源窗,(或只与样品,不包括过滤器的情况下测量的能量窗)。将最后的奔跑,持续10秒。
  9. 查找的位置的主光束(例如信道233)。
  10. 对于其他的运行,更改过滤器再次到2毫米钨(W,梁挡块),从30000开始。
  11. 查找其他所有的样品峰的位置。
  12. 使用ImageJ的宏的软件校准SAXS -从强度与信道转换的强度与q(下或d间距)( 图1)。
  13. 使用ImageJ的宏软件校准WAXS - ,从强度与信道转换的强度与q(下或d间距)( 图2)。

8。软件程序

  1. 使用该软件ASA 3.3,收集实时数据,实时数据“→”和TPF选项卡→“保存文件。
  2. 对于EasySWAXS,点击“设备设置”选项卡。
  3. 输入的“a”,λ,和d的值,以及重心。
  4. 选择点瞄准。
  5. 选择球状粒子类型(除非它是公知的是扁平状颗粒的杆)。
  6. 按一下的吉尼尔情节“选项卡上。的I和Q 2的图形将被显示出来。
  7. 拖动垂直线包围的部分近似直线的斜率。
  8. 在屏幕的底部,R值会被显示。这是一个验证的要求。
  9. 继续拖动垂直线更接近在一起,直到验证值是1和2之间。这是主观的。的R值,或回转半径,是一个估计。

9。来源关机程序

  1. 验证的安全性和快速的快门关闭。
  2. 关闭待机键,“ON”的位置。
  3. 等待所述触摸屏来读取备用水平。
  4. 按R5的touchscreen。
  5. 降低电流到0 A.
  6. 的电压降低到0 A。
  7. 转动透视键的“OFF”位置。
  8. 通过按下红色的关闭按钮,切换主电源“OFF”。

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Representative Results

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小角X射线散射和WAXS完全可以提供结构信息的样品通过以下参数:回转,颗粒的大小和形状,解决方案的结构因子,具体的内表面和孔径大小,晶格的类型和尺寸,和电子密度1的半径。也可应用于小角X射线散射和WAXS研究蛋白质动力学2。

的结构信息SWAXS实验得到的实验检测到的光谱和该系统的计算结果进行比较。的计算结果,计算在一个合理的有效电位之间 Veff相关(r)从统计力学模型,如奥恩斯坦-泽尼克(OZ)积分方程理论(这样的分析的一个例子,可以看出,从参考文献3开发的软件与) 。

作为数据分析方法,模型的一部分 为SWAXS绝对强度I(Q) 将需要开发在软件中进行研究,其中的散射光的强度,I(q)的 是一个函数,在倒易空间的动量传递,散射矢量q =4π罪(θ/ 2)/λ,q是一个标量,这是连接到的散射角,θ,和辐射的波长,λ。 q在于在0.03的范围内- 0.6埃-1与一个选定的样品到检测器的距离在一个典型的SAXS实验。调查在实际空间中的区域的大小由r =2π/ Q q有关,并且在于在11-2000埃4的范围内。 WAXS上,另一方面,可以解决间距大于3.3。I(q)的依赖于原子的功能和位置的原子散射中心。 ,首先在SWAXS实验测得的强度与信道必须被校准,以强度与q或晶面间距 d( 图1

2%(重量)的水基的水性缓冲液中的溶菌酶的SAXS分析的一个例子在图3中所示。获得和在图3所示的回转半径的值很好地约1.44纳米5的预期值进行比较。更多的例子可以找到如何申请SAXS对生物大分子的文献。6-13。 WAXS的分析的一个例子,该脂质体分散在水溶液中,在图4中示出。等距峰减小而增加q,借给层状结构的脂质体中的水基溶液样品水溶液。与每个片层中,是在将发生的散射减少。

图1
图1SAXS校准使用ImageJ的,宏软件。使用的样本是硬脂酸银与d间距48.68Å。位于主光束在信道367和五个主要的峰(或晶格参数的样本)位于539,717,896,1075,和1253的信道,分别。

图2
图2的 WAXS -激光功率校测ImageJ的宏软件。使用的样本是帕拉 - 溴苯甲酸粉。 130,484,555,613,657,和902的通道,分别位于六个主要的峰(或晶格参数的样本)。

图3
图3。背景,减去的小角X射线散射的原始数据的溶菌酶(2%(重量))。 EasySWAXS的吉尼尔情节,软件可以利用非常的Q

图4
图4A中示出图4。扣除背景WAXS的原始数据的脂质体分散在一种水基水溶液。脂质体的结构示意图(1D层状),其亲水的头部和疏水尾部,其磷脂膜堆,其电子密度函数如图4B所示, 点击此处查看大图

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Discussion

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比较程序的SWAXS系统的允许众多变量来确定实验分析。从分析中获得的参数,这些参数可以被用于不同的目的,根据样品和实验设置。 SAXS提供纳米尺度的对象的大小和形状有关下列内容的信息,而WAXS重点上的原子和微观尺度的结构( 分子晶格,晶胞尺寸对称性)。更具体地,在稀溶液中的颗粒,小角X射线散射可以研究回转,粒子大小和形状的半径;用于高密度的样品,小角X射线散射可能研究的解决方案的结构因子;随机多孔/ 2移相系统,小角X射线散射可以研究具体的内表面和孔的尺寸;和液体结晶样品,的WAXS可能研究晶格尺寸和单元结构。然而,限制的SWAXS是广泛的分布的粒子尺寸或分散度将严重downgr的腺的实验结果。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

我们想感谢曼弗雷德Kriechbaum Hecus XRS和在奥地利格拉茨的奥地利科学院生物物理研究所和纳米系统研究。 LL和XW部分由美国能源部支持下,NERI-C号DE-FG07-07ID14889奖,美国核管理委员会,根据奖励编号:NRC-38-08-950。部分由美国能源部也支持SWAXS仪器,在裁决号DE-NE0000325。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera Hecus XRS and IBN,
Graz, Austria
GNOM ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
  2. Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
  3. Maranas, J. K. The effect of environment on local dynamics of macromolecules. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).
  4. Lysozyme in Water [Internet]. Available from: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/lysozyme/10_analysis2.html (2008-2012).
  5. Stribeck, N. X-Ray Scattering of Soft Matter. Springer. Heidelberg. (2007).
  6. Mertens, H. D., Svergun, D. I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. J. Struct. Biol. 172, (1), 128 (2010).
  7. Svergun, D. I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. Biol. Chem. 391, (7), 737 (2010).
  8. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
  9. Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27, (5-8), 1377-1381 (2007).
  10. Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures. Journal of Colloid and Interface Science. 357, (1), 88-94 (2011).
  11. Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution. Macromolecules. 27, (21), 6046-6054 (1994).
  12. Mittelbach, R., Glatter, O. Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles. Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).
小型和广角X-射线散射研究生物大分子的解决方案
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Cite this Article

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).More

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).

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