Summary
Demonstrationen af de små og vidvinkel røntgenspredning (SWAXS) procedure er blevet et middel i studiet af biologiske makromolekyler. Gennem brug af instrumentering og procedurer af specifikke vinkler metoder og forberedelse, viser de eksperimentelle data fra SWAXS den atomare og nano-skala karakterisering af makromolekyler.
Abstract
I dette papir, er lille og Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analyse af makromolekyler demonstreret gennem eksperimenter. SWAXS er en teknik, hvor røntgenstråler elastisk spredt af en inhomogen stikprøve i nm-området ved små vinkler (typisk 0,1 - 5 °) og brede vinkler (typisk> 5 °). Denne teknik giver oplysninger om form, størrelse og distribution af makromolekyler, karakteristiske afstande delvist bestilt materialer, porestørrelser og overflade-til-volumen-forhold. Small Angle X-ray scattering (SAXS) kan levere strukturel information af makromolekyler mellem 1 og 200 nm, mens Vidvinkel røntgenspredning (WAXS) kan løse endnu mindre Bragg afstand mellem prøver mellem 0,33 nm og 0,49 nm baseret på specifik systemopsætning og detektor. Afstanden bestemmes ud fra Braggs lov og er afhængig af bølgelængden og indfaldsvinklen.
I et SWAXS eksperiment, kan materialerne være fasteeller flydende og kan indeholde faste, flydende eller gasformige domæner (såkaldte partikler) af det samme eller et andet materiale i enhver kombination. SWAXS ansøgninger er meget bred og omfatter kolloider af alle typer: metaller, kompositmaterialer, cement, olie, polymerer, plast, proteiner, fødevarer og farmaceutiske produkter. For faste prøver er tykkelsen begrænset til cirka 5 mm.
Brug af en lab-baserede SWAXS instrument er nærmere beskrevet i dette dokument. Med den tilgængelige software (f.eks Gnom-ATSAS 2,3 pakke ved D. Svergun EMBL-Hamburg og EasySWAXS software) for SWAXS system, kan et eksperiment udføres for at bestemme visse parametre af interesse for den givne prøve. Et eksempel på et biologisk makromolekyle eksperiment er analysen af 2 vægt-% lysozym i en vandbaseret vandig buffer, som kan vælges og fremstilles ved adskillige metoder. Fremstillingen af prøven følger nedenstående retningslinjer i udarbejdelsen af Sample sektion. Gennem SWAXS eksperimenter,vigtige strukturelle parametre for lysozym, f.eks gyrationsradius, analyseres.
Protocol
1. Forberedelse af prøven
- Anvende en kanyle til at fjerne noget af prøven fra prøvebeholderen. *
- Brug nålen til at fylde kapillarrøret (maksimal diameter på 2,2 mm) med prøven. Kapillarrøret skal fyldes mellem 2 og 3 cm fra bunden.
- Luk kapillarrøret ved smeltende voks på sin spids.
- Skru vakuum prøveholderen fra systemet.
- Tag kapillarrøret af den fusionerede ende (voks ende) og sæt un-kondenserede ende i prøveholderen.
- Sæt holderen tilbage i systemet og skruen på plads.
* Fast prøver (inkl. pulver prøver) kan placeres direkte i prøveholderen (ingen kapillære nødvendigt), hvorimod flydende prøver skal placeres i et kapillar.
Start-Up af SWAXS Machine
2. Kilde Cold Startup Procedure
- Luk lukkeren ved at skubbe sikkerheden udløserknappen.
- Tænd for hovedafbryderen"ON" ved at trykke på den grønne på knappen.
- Verificere Emergency "Shut-Off" knappen er i udstrakt stilling.
- Sluk for strømmen på ved at trykke på den grønne knap.
- Verificer interlock LED lyser grønt, hvilket indikerer alle interlocks er ok.
- Vent på den berøringsfølsomme skærm for at indlæse. Når den er indlæst, tryk "R6" på menuen.
- Drej Standby nøglen til "ON" position.
- Drej X-ray nøgle til "ON" position. Den røde X-ray lys skal lyse op.
- Vent på den berøringsfølsomme skærm til at læse standby-niveauer (30 kV og 0,4 mA).
- Drej Standby Safety nøglen til "OFF" position. Tryk på "Start Cycle" knappen i bunden af skærmen.
- Vent på den berøringsfølsomme skærm for at læse nominel effekt (50 kV og 1 mA). Hvis et andet varmetrin ønskes, skal du indtaste den konfiguration skærmen ved at trykke på "R4" på skærmen og indtaste de ønskede indstillinger.
3. Chiller Procedure
- Sluk for strømmen SWITCH til "ON" position på temperaturen kontrolpanel. En kontrol lys og LED temperatur displayet lyser op.
- Drej strømafbryderen til "ON" position på køleren.
- Vent, indtil temperaturen displayet viser "OFF". Dette er standbytilstand.
- Tryk på og hold Enter-knappen (return symbol) for omkring 4 sekunder, eller indtil temperaturdisplayet vises en aktuel temperatur.
- For at ændre temperaturen ved at trykke på op eller pil ned. Den indstillede værdi bliver vist på temperaturdisplayet i ca 8 sek før det vil vende tilbage til den faktiske værdi.
- Tryk på Enter-knappen, når den ønskede indstillede værdi vises. Dette vil gemme denne værdi.
- Vente, indtil den aktuelle temperatur når den ønskede indstillede værdi.
BEMÆRK: Hvis du på noget tidspunkt fejlen "E 01" dukker op på temperaturdisplayet, skal du følge Chiller Shutdown instruktionerne, refill bad enhed ved at hælde rent vand i tanken fill, og derefter udføre chiller Idrifttagningsforløb igen.
4. Lukning af Chiller
- Tryk på "enter" i ca 4 sek.
- Drej afbryderen til "OFF" position.
5. Tænd for Vacuum
- Sørg for, at vakuum Døren er fastgjort på plads.
- Drej Vacuum 1 og 2 knopper til "On" positioner.
- Vente, indtil VAP5 vakuummåler læser et vakuumniveau under 1,5 mbar.
6. Detektor System Setup
- For at opsætte gastrykket, kontrollere Main trykmåler af reduktionsventilen er mindst 10 bar.
- Åbn hovedventilen.
- Åbn langsomt Operating trykventil indtil trykket når 8 bar ved arbejdstrykket Gauge.
- Åbn den anden Main Valve
- For at justere gas flow, åbne Main Trykventil ved at dreje knappen til den lodrette position på Gas Control panel.
- Justere flowetsats med nåleventilen indtil måleren læser cirka 8 bar.
- Drej hovedafbryderen til "ON" position. LED lys skal lyse op.
- For at justere den høje spænding, aktivere den høje spænding ved at dreje kontakten til "ON" position. LED lys skal lyse op.
- Drej langsomt spændingen drejeknap indtil ca 3.5kV er nået på måleren. OVERSKRID IKKE 4kV.
7. Kalibrering
- De eksperimentelle ovenstående trin udføres med en prøve af kendte toppe.
- ASA 3,3 bruges til at indhente graf af intensitet vs kanal med 5 toppe.
- Gå til Menu → Indstillinger → Indtast kanaler og tilhørende intensiteter.
- Gå til ASA3, "TPF"-fanen først.
- Skift filter, øverst til venstre 1 mm Nikkel (stråle filter).
- Indstil position 32.000 (interval 28.000 til 32.000, kritisk region omkring 28.000) → gå til position, skal du sørge vakuum er under 5 mbar, skal du sørge detektoren er reading mellem 1k-10K.
- Kør i 10 sekunder i cirka 52 tællinger pr sek.
- Skift energi vinduer, (eller måle energi-vinduet med prøven kun, ikke inklusive filter sag). Indstil den endelige løb i 10 sek.
- Finde placeringen af den primære stråle (kanal 233 for eksempel).
- For andre kørsler, ændre filter igen til 2 mm Wolfram (W, stråle prop) og start fra 30.000.
- Finde placeringen af alle andre toppe af prøverne.
- Brug ImageJ-makro software til at kalibrere SAXS - at skifte fra intensitet som funktion kanal til intensitet som funktion af q (eller d-afstandsmønster) (figur 1).
- Brug ImageJ-makro software til at kalibrere WAXS - at skifte fra intensitet som funktion kanal til intensitet som funktion af q (eller d-afstandsmønster) (figur 2).
8. Software Procedure
- Brug softwaren ASA 3,3, for at indsamle data direkte: live data → TPF fanen → Gem filen.
- For EasySWAXS, skal du klikke på fanen Enhedsindstillinger.
- Indtaste "a", lambda, og d-værdier, såvel som tyngdepunktet.
- Vælg punkt kollimation.
- Vælg Globular partikeltype (medmindre det er en kendt for at være en stang af fladt formet partikel).
- Klik på Guinier-Plot fanen. En I vs q 2 graf vil blive vist.
- Træk de lodrette linjer til at omgive en del af tilnærmelsesvis lineære hældning.
- I bunden af skærmen, vil en R værdi vises. Desuden er der også en validering krav.
- Fortsæt med at trække de lodrette linier tættere sammen, indtil valideringen værdi er mellem 1 og 2. Det er subjektiv. R værdi, eller gyrationsradius, opnås, er et skøn.
9. Kilde Shutdown Procedure
- Kontroller sikkerheden og hurtige skodder er lukket.
- Drej Standby nøglen til "ON" position.
- Vent på den berøringsfølsomme skærm for at læse standby niveauer.
- Tryk R5 på touchscreen.
- Reducer strøm til 0 A.
- Reducer spændingen til 0 A.
- Drej X-ray nøglen til "OFF" position.
- Sluk for strømmen "OFF" ved at trykke på den røde sluk-knappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SAXS og WAXS helt kan tilvejebringe strukturel information af prøven ved hjælp af følgende parametre: gyrationsradius, partikelstørrelse og form, opløsning struktur faktor, specifik indre overflade og porestørrelse, lattice type og dimension, og elektrontæthed 1. SAXS og WAXS kan også anvendes til at studere protein-dynamik 2.
Den strukturelle information af SWAXS eksperimenter opnås ved at sammenligne den eksperimentelt påvist spektre, og de beregningsmæssige resultater af systemet. De beregningsmæssige resultater blev beregnet i softwaren med en rimelig effektiv potentiel V eff (r) udviklet fra statistisk mekanik modeller, såsom Ornstein-Zernike (OZ) integrerende ligning teori (et eksempel på en sådan analyse kan ses fra ref. 3) .
Som en del af dataanalyse metoder, modeller for SWAXS absolutte intensitet I (q) vil være nødvendigt at udvikle i softwaren for undersøgelsen, hvor spredning intensitet, I (q), er en funktion af den fremdrift, overførsel i reciprokke rum, spredningen vektor q = 4π sin (θ / 2) / λ. q er en skalar størrelse, der er forbundet til spredningsvinklen, θ, og bølgelængden af strålingen, λ. q ligger i området fra 0,03 til 0,6 Å-1 i et typisk SAXS eksperimentere med en udvalgt prøve til detektor-afstanden. Størrelsen af den region undersøgt i det reale rum er relateret til q ved r = 2π / Q, og ligger i området fra 11 til 2000 Å 4. WAXS, på den anden side, kan løse afstand større end 3,3 Å. I (q) er afhængig af de atomare træk og placeringen af de atomare spredende centre. I SWAXS forsøg, den målte intensitet som funktion kanal først skal kalibreres for intensitet som funktion af q eller afstanden d (figur 1 og Et eksempel på SAXS analyse af lysozym i 2 vægt-% vandbaseret vandig puffer er vist i figur 3.. Værdien for gyrationsradius opnået og vist i figur 3 sammenligner pænt til den forventede værdi på ca 1,44 nm 5. Flere eksempler på, hvordan man kan anvende SAXS til biologiske makromolekyler kan findes fra Refs. 6-13. Et eksempel på WAXS analyse af liposomet dispergeret i vandig opløsning er vist i fig. 4. De jævnt fordelte toppe faldende med stigende q, giver liposomet i den vandbaserede vandige opløsning prøve til en lamelstruktur. Med hver lameller, er der et fald i den spredning, der vil forekomme. 
Figur 1. Den SAXS Kalibrering med ImageJ-makro-software. Den anvendte prøve er sølv stearat med d-afstandsmønster 48,68 Å. Den primære stråle er placeret i kanalen 367 og de fem hovedtoppe (eller gitterparametre af prøven) er anbragt ved 539, 717, 896, 1075, og 1253 kanaler, henholdsvis. 
Figur 2. Den WAXS-Callibration med ImageJ-makro-software. Den anvendte prøve er para-brom benzoesyre pulver. De seks store toppe (eller gitterparametre af prøven) er anbragt ved 130, 484, 555, 613, 657, og 902 kanaler, henholdsvis. 
Figur 3. Baggrundssubtraktion SAXS rå-data af lysozym (2 vægt%). Det Guinier-plot fra EasySWAXS software kan udnytte den meget lave q 
Figur 4. Baggrundssubtraktion WAXS rå-data af liposom dispergeret i et vandbaseret vandige opløsning er vist i figur 4A. De skematiske diagrammer af strukturen af liposom (1D lamellar), den hydrofile hoved-og hydrofob hale, dens phospholipidmembran stak, og dens elektrontæthed, er vist i figur 4B. se større tal .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den sammenlignende fremgangsmåde af SWAXS systemet tillader talrige variabler, der skal bestemmes fra eksperimentel analyse. De parametre, der opnås fra analysen kan anvendes til forskellige formål i henhold til prøven og forsøgsopstillingen. SAXS indeholder oplysninger om nano-skala størrelse og form af objektet, hvorimod WAXS fokuserer på det atomare og mikro-skala struktur (f.eks molekylær gitter, enhedscelle dimension symmetri). Mere specifikt for partikler i fortyndede opløsninger, kan SAXS studere gyrationsradius, partikelstørrelse og form, for high-density prøver, kan SAXS studere strukturen faktor opløsningen, for tilfældige porøse / 2 fasesystemer, kan SAXS studere specifik indre overflade og porestørrelse, og flydende krystallinske prøver, kan WAXS studere gitter dimensioner og enhedscellen struktur. En begrænsning af SWAXS er, at en bred vifte af fordelingen af partikelstørrelser eller polydispersitet alvorligt vil downgrAde de eksperimentelle resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Manfred Kriechbaum af Hecus Rtg og Institut for Biofysik og Nanosystems Forskning ved den østrigske Academy of Sciences i Graz, Østrig. LL og XW blev delvist understøttet af US Department of Energy, under DMU-C Award nr. DE-FG07-07ID14889 og US Nuclear Regulatory Commission, under Award No NRC-38-08-950. Den SWAXS instrumentet også delvist understøttet af US Department of Energy, under Award nr. DE-NE0000325.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera | Hecus XRS and IBN, Graz, Austria |
||
| GNOM | ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg |
References
- Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
- Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
- Maranas, J. K. The effect of environment on local dynamics of macromolecules. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).
- Lysozyme in Water [Internet]. , Available from: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/lysozyme/10_analysis2.html (2008-2012).
- Stribeck, N. X-Ray Scattering of Soft Matter. , Springer. Heidelberg. (2007).
- Mertens, H. D., Svergun, D. I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. J. Struct. Biol. 172 (1), 128 (2010).
- Svergun, D. I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. Biol. Chem. 391 (7), 737 (2010).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
- Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27 (5-8), 1377-1381 (2007).
- Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures. Journal of Colloid and Interface Science. 357 (1), 88-94 (2011).
- Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution. Macromolecules. 27 (21), 6046-6054 (1994).
- Mittelbach, R., Glatter, O. Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles. Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).
