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Bioengineering

Piccole e Wide Angle X-Ray Scattering Studi di macromolecole biologiche in soluzione

doi: 10.3791/4160 Published: January 8, 2013

Summary

La dimostrazione dell'angolo piccolo e grande X-ray scattering (SWAXS) procedura è diventato determinante per lo studio delle macromolecole biologiche. Attraverso l'uso della strumentazione e procedure di metodi angolari specifici e preparazione, i dati sperimentali dei SWAXS visualizza la caratterizzazione atomica e nano-scala di macromolecole.

Abstract

In questo lavoro, piccole e Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analisi delle macromolecole è dimostrata attraverso la sperimentazione. SWAXS è una tecnica in cui i raggi X sono elasticamente sparsi da un campione disomogeneo nel nm-gamma a piccoli angoli (tipicamente 0.1 - 5 °) e angoli di larghezza (in genere> 5 °). Questa tecnica fornisce informazioni circa la forma, le dimensioni e la distribuzione di macromolecole, distanze caratteristici di materiali parzialmente ordinati, dimensioni dei pori, e superficie-volume di rapporto. Piccolo angolo X-ray Scattering (SAXS) è in grado di fornire informazioni strutturali di macromolecole tra 1 e 200 nm, mentre Wide Angle X-ray Scattering (WAXS) può risolvere ancora minore spaziatura Bragg di campioni tra 0,33 e 0,49 nm nm basata sulla configurazione del sistema specifico e rivelatore. La distanza è determinata dalla legge di Bragg e dipende dalla lunghezza d'onda e angolo incidente.

In un esperimento SWAXS, i materiali possono essere solidio liquido e può contenere solidi, liquidi o gassosi domini (cosiddette particelle) dello stesso materiale o di un altro in qualsiasi combinazione. Applicazioni SWAXS sono molto ampie e comprendono colloidi di tutti i tipi: metalli, materiali compositi, cemento, olio, polimeri, materie plastiche, proteine, alimenti e prodotti farmaceutici. Per campioni solidi, lo spessore è limitata a circa 5 mm.

L'utilizzo di un laboratorio strumento basato SWAXS è dettagliata in questo articolo. Con il software a disposizione (ad esempio, GNOM-ATSAS 2,3 pacchetto D. Svergun EMBL-Amburgo e software EasySWAXS) per il sistema SWAXS, un esperimento può essere condotto per determinare alcuni parametri di interesse per il campione dato. Un esempio di un esperimento macromolecola biologica è l'analisi del 2% in peso di lisozima in una base di acqua tampone acquoso che possono essere scelti e preparati con numerosi metodi. La preparazione del campione segue le istruzioni riportate nella sezione Preparazione dei campioni. Attraverso la sperimentazione SWAXS,importanti parametri strutturali di lisozima, ad esempio, il raggio di girazione, possono essere analizzati.

Protocol

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1. Preparazione del campione

  1. Utilizzare un ago per rimuovere una porzione del campione dal contenitore. *
  2. Utilizzare l'ago per riempire il capillare (diametro massimo di 2,2 mm) con il campione. Il capillare deve essere riempito tra 2 e 3 cm dal fondo.
  3. Chiudere il capillare di fusione della cera sulla punta.
  4. Svitare il supporto del campione vuoto dal sistema.
  5. Prendere la capillare entro la fine fuso (fine cera) e inserire il non-fuso estremità nel supporto del campione.
  6. Posizionare il supporto nel sistema e avvitare.

* Campioni solidi (compresi campioni di polvere) può essere direttamente collocato nel supporto del campione (non necessario capillare), mentre campioni liquidi deve essere posto in un capillare.

Start-Up della Macchina SWAXS

2. Fonte procedura di avvio a freddo

  1. Chiudere l'otturatore premendo il pulsante di scatto di sicurezza.
  2. Spegnere l'interruttore principale"ON", premendo il tasto verde.
  3. Verificare che il pulsante di emergenza "Shut-Off" è in posizione estesa.
  4. Accendere l'alimentazione principale premendo il tasto verde.
  5. Verificare che la spia di blocco LED è verde e indica tutti gli interblocchi sono ok.
  6. Attendere che il touch screen da caricare. Una volta caricato, premere il tasto "R6" nel menu.
  7. Ruotare il tasto Standby sulla posizione "ON".
  8. Ruotare la radiografia chiave in posizione "ON". La radiografia luce rossa deve accendersi.
  9. Attendere che il touch screen per leggere i livelli di standby (30 kV e 0,4 mA).
  10. Girare la chiave di standby di sicurezza nella posizione "OFF". Premere il tasto "Cycle Start" pulsante nella parte inferiore del touch screen.
  11. Attendere che il touch screen per leggere la potenza nominale (50 kV e 1 mA). Se un livello di potenza diversa si desidera, accedere alla schermata di configurazione premendo "R4" sul touch screen e inserendo le impostazioni desiderate.

3. Chiller Procedura

  1. Ruotare la swi alimentazionetch in posizione "ON" sul pannello di controllo della temperatura. Una luce di controllo e il display della temperatura a LED si accende.
  2. Portare l'interruttore di alimentazione in posizione "ON" sul refrigeratore.
  3. Attendere fino a quando il display della temperatura indica "OFF". Questa è la modalità di standby.
  4. Premere e tenere premuto il pulsante di invio (simbolo di ritorno) per circa 4 secondi o fino a quando il display della temperatura indica una temperatura effettiva.
  5. Per modificare la temperatura, premere la freccia su o freccia giù. Il valore impostato viene visualizzato sul display della temperatura per circa 8 secondi prima che possa ritornare al valore effettivo.
  6. Premere il tasto ENTER una volta il valore di riferimento desiderato. Questo salverà il valore.
  7. Attendere fino a quando la temperatura effettiva raggiunge il valore impostato desiderato.

NOTA: Se in qualsiasi momento l'errore "E 01" compare sul display della temperatura, seguire le istruzioni refrigeratore arresto, l'unità di ricarica bagno versando acqua purificata nel fil serbatoiol, e quindi eseguire la procedura di avvio di nuovo refrigeratore.

4. Arresto di Chiller

  1. Premere "enter" per circa 4 secondi.
  2. Portare l'interruttore di alimentazione in posizione "OFF".

5. Accensione del vuoto

  1. Assicurare la porta vuoto è fissato in posizione.
  2. Girare il vuoto 1 e 2 manopole per i posizioni "ON".
  3. Attendere che il VAP5 vacuometro legge un livello di vuoto inferiore a 1,5 mbar.

6. Rivelatore di impostazione del sistema

  1. Per impostare la pressione del gas, verificare che il manometro principale della valvola di riduzione è di almeno 10 bar.
  2. Aprire la valvola principale.
  3. Aprire lentamente la valvola di pressione di esercizio fino a quando la pressione raggiunge 8 bar sul manometro di esercizio.
  4. Aprire la seconda valvola principale
  5. Per regolare la portata del gas, aprire la valvola principale della pressione ruotando la manopola in posizione verticale sul pannello di controllo del gas.
  6. Regolare il flussotariffa con la valvola a spillo fino a quando l'indicatore di legge circa 8 bar.
  7. Portare l'interruttore di alimentazione principale in posizione "ON". La luce LED si illumina.
  8. Per regolare l'alta tensione, attivare l'alta tensione portando l'interruttore in posizione "ON". La luce LED si illumina.
  9. Ruotare lentamente la manopola di tensione di controllo fino a circa 3.5kV viene raggiunto sul manometro. NON SUPERARE 4kV.

7. Taratura

  1. Le fasi sperimentali sopra vengono eseguite con un campione di picchi noti.
  2. ASA 3.3 è utilizzato per ottenere il grafico di intensità vs canale con 5 picchi.
  3. Passare a Menu → Opzioni → Inserisci canali e intensità corrispondenti.
  4. Vai a ASA3, scheda "TPF" prima.
  5. Sostituire il filtro, in alto a sinistra 1 millimetro Nichel (fascio di filtro).
  6. Imposta la posizione 32.000 (intervallo 28.000 a 32.000, regione critica circa 28.000) → vai a posizione, creare il vuoto che è inferiore a 5 mbar, assicurarsi che il rilevatore è ragioneding tra 1k-10K.
  7. Eseguire per 10 secondi per circa 52 impulsi al secondo.
  8. Cambiare le finestre di energia, (o misurare la finestra di energia con l'unico campione, non compreso il caso del filtro). Impostare la corsa finale per 10 sec.
  9. Individuare la posizione del fascio primario (233 canale per esempio).
  10. Per le altre piste, sostituzione del filtro di nuovo a 2 Tungsten mm (W, fascio tappo), a partire da 30.000.
  11. Trovare la posizione di tutti gli altri picchi dei campioni.
  12. Utilizzare ImageJ-macro software per calibrare SAXS - loro transizione da intensità vs canale di intensità vs q (o spaziatura d) (Figura 1).
  13. Utilizzare ImageJ-macro software per calibrare WAXS - loro transizione da intensità vs canale di intensità vs q (o spaziatura d) (Figura 2).

8. Software Procedura

  1. Utilizzare il software ASA 3.3, per la raccolta dei dati in tempo reale: dati in diretta → TPF scheda → Salva file.
  2. Per EasySWAXS, fare clic sulla scheda Impostazioni periferica.
  3. Immettere la "a", lambda, e valori d, così come il centro di gravità.
  4. Selezionare Punto di collimazione.
  5. Selezionare il tipo di particella globulare (a meno che non si tratta di un noto per essere una canna di appartamento a forma di particelle).
  6. Fare clic sulla scheda Guinier-Plot. Un I vs q 2 grafico verrà visualizzato.
  7. Trascinare le linee verticali per circondare un tratto di pendenza pressoché lineare.
  8. Nella parte inferiore della schermata, un valore di R viene visualizzato. Accanto a questo vi è un requisito di convalida.
  9. Continuare a trascinare le linee verticali avvicinare finché il valore di convalida è tra 1 e 2. Questo è soggettiva. Il valore di R, o raggio della rotazione, che si ottiene è una stima.

9. Fonte Procedura di arresto

  1. Verificare la sicurezza e persiane veloci sono chiuse.
  2. Ruotare il tasto Standby sulla posizione "ON".
  3. Attendere che il touchscreen per leggere i livelli di standby.
  4. Premere R5 sulla touchscreen.
  5. Ridurre la corrente a 0 A.
  6. Ridurre la tensione a 0 A.
  7. Ruotare la radiografia a chiave in posizione "OFF".
  8. Spegnere l'alimentazione principale su "OFF" premendo il pulsante rosso spento.

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Representative Results

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SAXS e WAXS complessivamente possono fornire informazioni strutturali del campione attraverso i seguenti parametri: il raggio di girazione, dimensione delle particelle e la forma, la struttura fattore soluzione, specifica superficie interna e la dimensione dei pori, tipo lattice e dimensione e densità elettronica 1. SAXS e WAXS può essere applicato anche allo studio della dinamica delle proteine ​​2.

L'informazione strutturale di esperimenti SWAXS viene ottenuta confrontando gli spettri sperimentalmente rilevato e risultati di calcolo del sistema. I risultati sono stati calcolati computazionali nel software con un ragionevole potenziale efficace V eff (r) sviluppato da modelli statistici meccanica, come la Ornstein-Zernike (OZ) teoria equazione integrale (un esempio di tale analisi può essere visto dal rif. 3) .

Nell'ambito dei metodi di analisi dei dati, i modelli per l'intensità assoluta SWAXS I (q) sarà necessario sviluppare nel software per lo studio, in cui l'intensità di scattering, I (q), è una funzione di trasferimento di momento in spazio reciproco, la dispersione vettore q = sin 4π (θ / 2) / λ. q è una quantità scalare che è collegato l'angolo di scattering, θ, e la lunghezza d'onda λ della radiazione,. q è compresa nel campo di 0,03-0,6 Å -1 in un esperimento tipico SAXS con un selezionato campione-detector distanza. La dimensione della regione indagato nello spazio reale è relativo a q da r = 2π / q, e si trova nell'intervallo 11-2000 Å 4. WAXS, d'altra parte, può risolvere spaziatura maggiore di 3,3 Å. I (q) dipende dalle caratteristiche atomiche e la posizione dei centri di scattering atomico. Nell'esperimento SWAXS, prima l'intensità misurata vs canale deve essere calibrato per intensità vs q o distanza d (figura 1 e

Un esempio di analisi SAXS del lisozima in tampone 2 wt% acqua a base acquosa è mostrato in Figura 3. Il valore di raggio di girazione ottenuto e mostrato in figura 3 confronta bene al valore atteso di circa 1,44 nm 5. Altri esempi di come applicare SAXS di macromolecole biologiche può essere trovato da Refs. 6-13. Un esempio di analisi WAXS del liposoma disperso in soluzione acquosa è mostrato in Figura 4. I picchi equamente distanziati decrescente con l'aumentare q, presta il liposoma nel campione basato sulla soluzione acquosa di acqua ad una struttura lamellare. Con ogni lamelle, vi è una diminuzione della dispersione che si verifica.

Figura 1
Figura 1. La calibrazione SAXS con ImageJ-macro software. Il campione utilizzato è stearato argento con distanza d 48,68 Å. Fascio principale si trova al canale 367 e cinque picchi principali (o parametri reticolari del campione) si trovano a 539, 717, 896, 1075, e 1253 canali, rispettivamente.

Figura 2
Figura 2. L'WAXS-Callibration con ImageJ-macro software. Il campione utilizzato è Para-Bromo polvere di acido benzoico. I sei picchi principali (o parametri reticolari del campione) sono situati a 130, 484, 555, 613, 657, e 902 canali, rispettivamente.

Figura 3
Figura 3. Sfondo-sottratti SAXS grezzi-dati di lisozima (2% in peso). Il Guinier-plot dal software EasySWAXS possono utilizzare il molto basso q

Figura 4
Figura 4. Sfondo sottratto WAXS dati grezzi di liposoma disperso in una soluzione acquosa a base di acqua è mostrato in Figura 4A. I diagrammi schematici della struttura lamellare di liposoma (1D), la sua testa idrofila e coda idrofoba, la sua pila fosfolipidi di membrana, e la sua funzione di densità di elettroni sono mostrati nella Figura 4B. Clicca qui per ingrandire figura .

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Discussion

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La procedura comparativa del sistema SWAXS consente numerose variabili che devono essere determinati da analisi sperimentale. I parametri che vengono raggiunti dalla analisi può essere utilizzato per scopi diversi a seconda del campione e la configurazione sperimentale. SAXS fornisce informazioni su scala nanometrica dimensioni e la forma dell'oggetto, mentre WAXS si concentra sulla struttura atomica e micro-scala (ad esempio reticolo molecolare, cellulare simmetria unità di misura). Più specificamente, per particelle in soluzioni diluite, SAXS può studiare il raggio di girazione, dimensione delle particelle, la forma, per campioni ad alta densità, SAXS può studiare il fattore di struttura della soluzione, per sistemi di fase casuali porosa / 2, SAXS può studiare specifica superficie interna e la dimensione dei pori, e per liquidi campioni cristallini, WAXS possono studiare le dimensioni e la struttura a traliccio cella elementare. Tuttavia, una limitazione di SWAXS è che una vasta gamma di distribuzione delle dimensioni particellari o polidispersità severamente il downgrade i risultati sperimentali.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare il Dott. Manfred Kriechbaum di XRS Hecus e l'Istituto di Biofisica e della Ricerca Nanosystems presso l'Accademia Austriaca delle Scienze a Graz, in Austria. LL e XW sono stati sostenuti in parte da US Department of Energy, sotto NERI-C Award No. DE-FG07-07ID14889, e US Nuclear Regulatory Commission, sotto Award n NRC-38-08-950. Lo strumento SWAXS è supportato anche in parte da US Department of Energy, sotto Award No. DE-NE0000325.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera Hecus XRS and IBN,
Graz, Austria
GNOM ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Piccole e Wide Angle X-Ray Scattering Studi di macromolecole biologiche in soluzione
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Cite this Article

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).More

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).

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