Summary
Demonstrasjonen av den lille og vidvinkel X-ray spredning (SWAXS) prosedyren har blitt instrumental i studiet av biologiske makromolekyler. Gjennom bruk av instrumentering og prosedyrer for bestemte vinkel metoder og forberedelse, viser de eksperimentelle data fra SWAXS atom og nano-skala karakterisering av makromolekyler.
Abstract
I denne utredningen, er liten og Vidvinkel X-ray spredning (SWAXS) analyse av makromolekyler demonstrert gjennom eksperimentering. SWAXS er en teknikk der X-stråler er elastisk spredt av en inhomogen utvalget i nm-range på små vinkler (typisk 0,1 - 5 °) og brede vinkler (typisk> 5 °). Denne teknikken gir informasjon om formen, størrelsen og fordelingen av makromolekyler, karakteristiske avstand av delvis sortert materiale, porestørrelser, og overflate-til-volum-forhold. Liten vinkel røntgen Scattering (SAXS) er i stand til å levere strukturell informasjon av makromolekyler mellom 1 og 200 nm, mens vidvinkel Røntgen Scattering (WAXS) kan løse enda mindre Bragg avstanden av prøver mellom 0,33 nm og 0,49 nm basert på spesifikk systemoppsett og detektoren. Avstanden bestemmes fra Braggs lov og er avhengig bølgelengde og hendelsen vinkel.
I et SWAXS eksperiment kan materialene være faststoffeller flytende og kan inneholde faste, flytende eller gassformige domener (såkalte partikler) av den samme eller et annet materiale i en hvilken som helst kombinasjon. SWAXS programmer er svært bred og omfatter kolloider av alle typer: metaller, kompositter, sement, olje, polymerer, plast, proteiner, mat og legemidler. For faste prøver, blir tykkelsen begrenset til ca 5 mm.
Bruk av en lab-baserte SWAXS instrument er beskrevet i denne artikkelen. Med tilgjengelig programvare (f.eks gnom-ATSAS 2,3 pakke D. Svergun EMBL-Hamburg og EasySWAXS programvare) for SWAXS systemet, kan et eksperiment bli gjennomført for å fastslå visse parametre av interesse for gitt prøve. Ett eksempel på en biologisk makromolekyl eksperiment er analysen av 2 vekt% lysozym i en vannbasert vandig buffer som kan velges og fremstilles gjennom en rekke metoder. Utarbeidelse av utvalget følger retningslinjene nedenfor i utarbeidelsen av Sample delen. Gjennom SWAXS eksperimentering,viktige strukturelle parametere av lysozym, f.eks radius GYRATION, kan analyseres.
Protocol
1. Klargjøring av Sample
- Bruke en nål til å fjerne noe av prøven fra prøvebeholderen. *
- Bruk nålen å fylle kapillær (maksimum diameter på 2,2 mm) med prøven. Kapillæret må fylles mellom 2 og 3 cm fra bunnen.
- Lukk kapillær ved smelting voks på spissen sin.
- Skru vakuum prøveholderen fra systemet.
- Ta kapillære ved smeltet enden (voks ende) og sett un-smeltet enden inn i prøveholderen.
- Plasser holderen tilbake i systemet og skru på plass.
* Faste prøver (inkludert pulverprøver) kan direkte plassert i prøveholderen (ingen kapillær nødvendig), mens flytende prøver må plasseres i et kapillær.
Oppstart av den SWAXS Machine
2. Kilde Cold Oppstartprosedyre
- Lukke lukkeren ved å trykke på sikkerhet utløserknappen.
- Slå på strømmen"ON" ved å trykke på den grønne på-knappen.
- Verifisere Emergency "Shut-Off"-knappen er i utstrakt posisjon.
- Slå på strømmen ved å skyve på den grønne knappen.
- Verifisere interlock LED lyser grønt, noe som indikerer alle forriglinger er ok.
- Vent til berøringsskjermen å laste. Når den har lastet inn, trykk på "R6" på menyen.
- Slå på standby-knappen til "ON" posisjon.
- Vri X-ray Nøkkelen til "ON" posisjon. Den røde X-ray lys skal lyse opp.
- Vent til berøringsskjermen til å lese standby nivåer (30 kV og 0,4 mA).
- Vri Standby Safety Nøkkelen til "OFF". Trykk på "Start Cycle"-knappen på bunnen av skjermen.
- Vent til berøringsskjermen til å lese nominell effekt (50 kV og 1 mA). Hvis en annen makt nivå er ønsket, skriver konfigurasjonen skjermen ved å trykke på "R4" på berøringsskjermen og inn ønskede innstillinger.
3. Chiller Prosedyre
- Slå av strømmen swiTCH til "ON" posisjon på temperaturen kontrollpanelet. En kontroll lys og LED temperatur displayet vil lyse opp.
- Slå strømbryteren til "ON" posisjon på chiller.
- Vent til temperaturen displayet viser "OFF". Dette er standby-modus.
- Trykk og hold Enter-knappen (return symbol) for ca 4 sek eller inntil Temperaturdisplayet viser en faktisk temperatur.
- For å endre temperaturen, trykk på pil opp eller pil. Den innstilte verdien vises på temperaturdisplayet for ca 8 sek før det kommer tilbake til den faktiske verdien.
- Trykk Enter-knappen når ønsket innstilt verdi vises. Dette vil lagre denne verdien.
- Vent til den faktiske temperaturen når den ønskede innstilte verdien.
MERK: Hvis du på noe tidspunkt feilen "E 01" dukker opp på temperaturdisplayet, følg Chiller Shutdown instruksjoner, refill bad enhet ved å helle renset vann i tanken fill, og deretter utføre chiller Oppstartprosedyre igjen.
4. Nedstengning av Chiller
- Trykk "enter" for ca 4 sek.
- Slå strømbryteren til "OFF".
5. Slå på Vacuum
- Sørg for at vakuum døren er sikret på plass.
- Slå Vacuum 1 og 2 knotter til "på" posisjoner.
- Vent til VAP5 vakuummåleren leser et vakuum nivå mindre enn 1,5 mbar.
6. Detektor System Setup
- Å sette opp gasstrykket, bekrefter Main trykkmåleren av reduksjonsventil er minst 10 bar.
- Åpne hovedventilen.
- Åpne sakte Operating trykkventil inntil trykket når 8 bar ved arbeidstrykk Gauge.
- Åpne den andre Hovedventil
- For å justere gasstrømmen, åpne hovedmenyen Trykkventil ved å vri rattet til vertikal posisjon på Gas Control panel.
- Reguler tilstrømningenhastighet med nåleventilen til måleren leser ca 8 bar.
- Slå strømbryteren til "ON" posisjon. LED-lampen skal lyse opp.
- For å justere høy spenning, aktivere høy spenning ved å vri bryteren til "ON" posisjon. LED-lampen skal lyse opp.
- Snu spenningen betjeningsrattet til ca 3.5kV er nådd på måleren. IKKE OVER 4kV.
7. Kalibrering
- De eksperimentelle trinnene ovenfor er utført med et utvalg av kjente topper.
- ASA 3,3 brukes til å innhente graf av intensitet vs kanal med 5 topper.
- Gå til Meny → Alternativer → Oppgi kanaler og tilsvarende intensiteter.
- Gå til ASA3, "TPF" tab først.
- Endre filter, forlot topp 1 mm Nickel (bjelke filter).
- Angi posisjonen 32000 (område 28000 til 32000, kritisk regionen rundt 28.000) → gå til posisjon, sørg vakuum er under 5 mbar, sørg for at detektoren er reading mellom 1k-10K.
- Kjør i 10 sekunder for ca 52 tellinger per sekund.
- Forandre energien vinduer, (eller måle energien vinduet med prøven, ikke med filter saken). Fastsette endelig kjøre i 10 sek.
- Finne plasseringen av den primære bjelken (kanal 233 for eksempel).
- For andre går, endrer filtrere igjen til 2 mm Tungsten (W, bjelke stopper) og starte fra 30.000.
- Finn plasseringen av alle andre toppene i prøvene.
- Bruk ImageJ-makro programvare for å kalibrere SAXS - noe som gjør overganger fra intensitet vs kanal til intensitet vs q (eller d mellomrom) (figur 1).
- Bruk ImageJ-makro programvare for å kalibrere WAXS - å gjøre overgangene fra intensitet vs kanal til intensitet g. q (eller d mellomrom) (figur 2).
8. Software Prosedyre
- Bruk programvaren ASA 3.3, for å samle inn live data: Live data → TPF kategorien → Lagre filen.
- For EasySWAXS, klikk på kategorien Enhetsinnstillinger.
- Inn i "en", lambda, og d verdier, samt tyngdepunktet.
- Velg punkt kollimasjon.
- Velg Kulestjernehop partikkel attraksjon (med mindre det er en kjent for å være en stang av flat formet partikkel).
- Klikk på Guinier-Plot kategorien. En jeg vs q 2 grafen vises.
- Dra de vertikale linjene til surround en del av tilnærmet lineær skråningen.
- Nederst på skjermen, vil en R verdi vises. Ved siden av dette er det en validering krav.
- Fortsett å dra de vertikale linjene tettere sammen til validering verdi er mellom 1 og 2. Dette er subjektiv. R verdien, eller Radius av Gyration, oppnås er et anslag.
9. Kilde Driftstansprosedyre
- Verifisere sikkerhet og raske skodder er stengt.
- Slå på standby-knappen til "ON" posisjon.
- Vent til berøringsskjermen til å lese standby nivåer.
- Trykk R5 på touchscreen.
- Redusere dagens til 0 A.
- Redusere spenningen til 0 A.
- Vri X-ray nøkkelen til "OFF".
- Slå på strømmen "OFF" ved å trykke på den røde knapp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SAXS og WAXS helt kan gi strukturell informasjon av prøven gjennom de følgende parametere: radius av GYRATION, partikkelstørrelse og form, løsning struktur faktor, spesifikk indre overflate og porestørrelse, gitter type og dimensjon, og elektrontettheten 1. SAXS og WAXS kan også brukes til studiet av protein dynamikk 2.
Den strukturelle informasjon SWAXS eksperimenter oppnås ved å sammenligne den eksperimentelt påvist spektra og beregningsorientert resultatene av systemet. Beregningsorientert resultater ble beregnet i programvaren med en rimelig effektiv potensialet V eff (r) som er utviklet fra statistisk mekanikk modeller, slik som Ornstein-Zernike (OZ) integrert ligningen teori (et eksempel på en slik analyse kan sees fra Ref. 3) .
Som en del av dataanalyse metoder, modeller for SWAXS absolutte intensitet I (q) må bli utviklet i programvaren for studium, der spredningsvolumet intensitet, I (q), er en funksjon av impulsoverføringen i gjensidig plass, spredning vektoren q = 4π sin (θ / 2) / λ. q er en skalar størrelse som er forbundet med spredningsvinkelen, θ, og bølgelengden av strålingen, λ. q ligger i området av 0,03 til 0,6 A -1 i en typisk SAXS eksperimentere med en valgt prøve-til-detektor avstand. Størrelsen på regionen undersøkt i virkelig rom er relatert til q ved r = 2π / q, og ligger i området 11 til 2000 Å. 4. WAXS, på den annen side, kan løse avstandsstykket større enn 3,3 Å.. I (q) avhenger atom funksjoner og posisjonen av atom spredning sentre. I SWAXS eksperimentet, først målte intensitet vs kanal må kalibreres til intensitet vs q eller mellomrom d (Figur 1 og Et eksempel på den SAXS analyse av lysozym i 2 vekt% vann basert vandig buffer er vist i figur 3.. Verdien for radius gyration innhentet og vist i figur 3 sammenligner pent til forventet verdi på ca 1,44 nm 5. Flere eksempler på hvordan du bruker SAXS til biologiske makromolekyler kan finnes fra dommere. 6-13. Et eksempel på den WAXS analyse av liposomet dispergert i vandig oppløsning er vist i Figur 4. De jevnt fordelte topper avtagende med økende q, gir liposomet i vannbaserte vandige løsning prøve til en lamellær struktur. Med hver lameller, er det en nedgang i spredning som vil oppstå. 
Figur 1. Den SAXS Kalibrering med ImageJ-makro programvare. Prøven brukes er sølv stearate med d avstand 48,68 Å.. Den primære strålen ligger på kanal 367 og de fem store topper (eller gitter parametere prøven) er plassert på 539, 717, 896, 1075, og 1253 kanaler, henholdsvis. 
Figur 2. Den WAXS-Kalibrering med ImageJ-makro programvare. Prøven brukes er Para-Bromo benzosyre pulver. De seks hovedtopper (eller gitter parametere prøven) er plassert i 130, 484, 555, 613, 657, og 902 kanaler, henholdsvis. 
Figur 3. Bakgrunn-subtraherte SAXS rå-data av lysozym (2 vekt%). Den Guinier-plot fra EasySWAXS programvare kan utnytte svært lav q 
Figur 4. Bakgrunn-subtraherte WAXS rå-data av liposom dispergert i en vannbasert vandig oppløsning er beskrevet i figur 4A. De skjematiske diagrammer av strukturen av liposom (1D lamellær), sin hydrofile hode og hydrofob hale, dets fosfolipid membran stakken, og dens elektrontetthet funksjon er vist i Figur 4B. Klikk her for å vise større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignende prosedyren for SWAXS systemet tillater for mange variabler som skal bestemmes fra eksperimentell analyse. Parametrene som er oppnådd fra analysen kan brukes til ulike formål i henhold til prøven og eksperimentelle oppsett. SAXS gir informasjon om nanoskala størrelse og form av objektet, mens WAXS fokuserer på atom og mikroskala struktur (f.eks molekylær gitter, enhetscellen dimensjon symmetri). Mer spesifikt, for partikler i fortynnede løsninger, kan SAXS studere radius GYRATION, partikkelstørrelse og form, for høy tetthet prøver kan SAXS studere strukturen faktor av løsningen, for tilfeldige porøst / 2 fasesystemer kan SAXS studere spesifikk indre overflate og porestørrelse, og for flytende krystallinske prøver kan WAXS studere lattice dimensjoner og enhetscellen struktur. Imidlertid er en begrensning av SWAXS at et bredt spekter av distribusjon av partikkelstørrelser eller polydispersitet vil sterkt downgrade de eksperimentelle resultatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke dr. Manfred Kriechbaum av Hecus XRS og Institute of biofysikk og nanosystemer Forskning ved den østerrikske vitenskapsakademiet i Graz, Østerrike. LL og XW ble støttet i en del av US Department of Energy, under NERI-C Award No DE-FG07-07ID14889, og US Nuclear Regulatory Commission, under Award No NRC-38-08-950. Den SWAXS instrument støttes også i en del av US Department of Energy, under Award No DE-NE0000325.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera | Hecus XRS and IBN, Graz, Austria |
||
| GNOM | ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg |
References
- Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
- Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
- Maranas, J. K. The effect of environment on local dynamics of macromolecules. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).
- Lysozyme in Water [Internet]. , Available from: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/lysozyme/10_analysis2.html (2008-2012).
- Stribeck, N. X-Ray Scattering of Soft Matter. , Springer. Heidelberg. (2007).
- Mertens, H. D., Svergun, D. I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. J. Struct. Biol. 172 (1), 128 (2010).
- Svergun, D. I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. Biol. Chem. 391 (7), 737 (2010).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
- Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27 (5-8), 1377-1381 (2007).
- Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures. Journal of Colloid and Interface Science. 357 (1), 88-94 (2011).
- Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution. Macromolecules. 27 (21), 6046-6054 (1994).
- Mittelbach, R., Glatter, O. Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles. Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).
