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Bioengineering

Pequeñas y Wide Angle X-Ray Estudios de dispersión de macromoléculas biológicas en disolución

doi: 10.3791/4160 Published: January 8, 2013

Summary

La demostración de rayos X de pequeño ángulo y gran dispersión (SWAXS) procedimiento ha resultado fundamental en el estudio de macromoléculas biológicas. Mediante el uso de la instrumentación y los procedimientos de los métodos de ángulo específico y la preparación, los datos experimentales de los SWAXS muestra la caracterización atómica y nano escala de macromoléculas.

Abstract

En este trabajo, Ángulo Pequeño y Gran dispersión de rayos X (SWAXS) el análisis de las macromoléculas se demuestra a través de la experimentación. SWAXS es ​​una técnica en la que los rayos X son elásticamente dispersada por una muestra homogénea en el rango de nm-en ángulos pequeños (típicamente 0,1 - 5 °) y ángulos anchos (típicamente> 5 °). Esta técnica proporciona información sobre la forma, el tamaño y la distribución de las macromoléculas, distancias características de materiales parcialmente ordenados, tamaños de poros, y la relación de superficie a volumen. De ángulo pequeño dispersión de rayos X (SAXS) es capaz de entregar información estructural de macromoléculas entre 1 y 200 nm, mientras que Wide Angle X-ray (WAXS) puede resolver aún más pequeño espaciamiento de Bragg de muestras entre 0,33 nm y 0,49 nm basado en la configuración específica del sistema y el detector. La separación se determina a partir de la ley de Bragg y es dependiente de la longitud de onda y ángulo de incidencia.

En un experimento SWAXS, los materiales pueden ser sólidoso líquido, y puede contener dominios de sólidos, líquidos o gaseosos (denominadas partículas) del mismo material o de otro en cualquier combinación. SWAXS aplicaciones son muy amplias e incluyen coloides de todo tipo: metales, materiales compuestos, cemento, petróleo, polímeros, plásticos, proteínas, alimentos y productos farmacéuticos. Para muestras sólidas, el espesor está limitado a aproximadamente 5 mm.

El uso de un instrumento de laboratorio basado en SWAXS se detalla en este documento. Con el software disponible (por ejemplo, GNOM-ATSAS 2,3 paquete por D. Svergun EMBL-Hamburgo y software EasySWAXS) para el sistema SWAXS, un experimento puede llevarse a cabo para determinar algunos parámetros de interés para la muestra dada. Un ejemplo de un experimento de macromolécula biológica es el análisis de 2% en peso de lisozima en un tampón acuoso a base de agua que puede ser elegido y preparado a través de numerosos métodos. La preparación de la muestra sigue las directrices indicadas a continuación en la Preparación de la sección de muestra. A través de la experimentación SWAXS,importantes parámetros estructurales de la lisozima, por ejemplo, el radio de giro, se puede analizar.

Protocol

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1. Preparación de la muestra

  1. Utilice una aguja para extraer parte de la muestra desde el recipiente de la muestra. *
  2. Utilice la aguja para llenar el capilar (diámetro máximo de 2,2 mm) con muestra. El capilar debe ser llenado entre 2 y 3 cm de la parte inferior.
  3. Cierre el capilar por cera derretida en la punta.
  4. Desatornillar el soporte de muestra de vacío del sistema.
  5. Tome el capilar por el extremo fundido (extremo cera) e inserte el extremo no-condensado en el soporte de la muestra.
  6. Coloque el soporte de nuevo en el sistema y el tornillo en su lugar.

* Las muestras sólidas (incluyendo muestras de polvo) puede ser colocado directamente en el soporte de muestras (no capilar es necesario), mientras que las muestras de líquido debe ser colocado en un capilar.

Puesta en marcha de la máquina SWAXS

2. Fuente Procedimiento de arranque en frío

  1. Cierre el obturador pulsando el botón de disparo hasta la seguridad.
  2. Encienda la alimentación principal"ON" pulsando el botón verde en.
  3. Verifique que la emergencia "Shut-Off" está en la posición extendida.
  4. Encienda la alimentación principal pulsando el botón verde.
  5. Verifique que la luz LED de bloqueo es de color verde, indicando todos los bloqueos están bien.
  6. Espere a que la pantalla táctil para cargar. Una vez que se haya cargado, pulse "R6" en el menú.
  7. Gire la llave de espera para la posición "ON".
  8. Gire la Llave de rayos X a la posición "ON". El rojo de luz de rayos X debe encenderse.
  9. Espere a que la pantalla táctil para leer los niveles de reserva (30 kV y 0,4 mA).
  10. Gire la llave de seguridad en espera a la posición "OFF". Pulse la tecla "Cycle Start" en la parte inferior de la pantalla táctil.
  11. Espere a que la pantalla táctil para leer potencia nominal (50 kV y mA 1). Si el nivel de potencia diferente que se desea, entrar en la pantalla de configuración pulsando "R4" en la pantalla táctil e introducir los ajustes deseados.

3. Chiller Procedimiento

  1. Gire el swi podertch a la posición "ON" en el panel de control de temperatura. Una luz de control y la pantalla de temperatura LED se iluminará.
  2. Gire el interruptor de encendido en la posición "ON" en la enfriadora.
  3. Espere hasta que el indicador de temperatura muestra "OFF". Este es el modo de espera.
  4. Mantenga pulsado el botón de entrar (símbolo de retorno) durante unos 4 segundos o hasta que el indicador de temperatura muestra la temperatura actual.
  5. Para cambiar la temperatura, presione las flechas arriba hacia abajo. El valor de ajuste se muestra en la pantalla de temperatura durante aproximadamente 8 segundos hasta que se vuelva al valor real.
  6. Pulse el botón Enter una vez el valor ajustado deseado. Esto almacenará ese valor.
  7. Esperar hasta que la temperatura real alcanza el valor de referencia deseado.

NOTA: Si en cualquier momento el error "E 01" aparece en la pantalla de temperatura, siga las instrucciones de apagado refrigerador, baño de recarga de la unidad mediante el vertido de agua purificada en el filtro del tanquel, a continuación, realice el procedimiento de inicio de enfriadores de nuevo.

4. Parada de Chiller

  1. Pulse "enter" durante aproximadamente 4 segundos.
  2. Gire el interruptor de encendido en la posición "OFF".

5. Encendido del vacío

  1. Asegúrese de que la puerta de vacío se fija en su lugar.
  2. Encienda la aspiradora 1 y 2 a los mandos de posiciones "ON".
  3. Espere hasta que el indicador de vacío VAP5 lee un nivel de vacío inferior a 1,5 mbar.

6. Detector de configuración del sistema

  1. Para configurar la presión del gas, verifique que el manómetro principal de la válvula de reducción es de al menos 10 bar.
  2. Abra la válvula principal.
  3. Abrir lentamente la válvula de presión de funcionamiento hasta que la presión alcanza 8 bar en el medidor de presión de trabajo.
  4. Abra la válvula principal Segundo
  5. Para ajustar el flujo de gas, abra la válvula de presión principal girando la perilla a la posición vertical en el panel de control de gas.
  6. Ajuste el flujo develocidad con la válvula de aguja hasta que el manómetro marque aproximadamente 8 bar.
  7. Gire el interruptor de alimentación principal a la posición "ON". La luz LED se iluminará.
  8. Para ajustar la tensión alta, activar la alta tensión girando el interruptor en la posición "ON". La luz LED se iluminará.
  9. Gire lentamente la perilla de control de voltaje de hasta aproximadamente 3.5kV se alcanza en el manómetro. NO EXCEDA 4kV.

7. Calibración

  1. Las etapas experimentales anteriores se realizan con una muestra de picos conocidos.
  2. ASA 3,3 se utiliza para obtener el gráfico de intensidad vs canal con 5 picos.
  3. Vaya a Menú → Opciones → Introducir canales y las intensidades correspondientes.
  4. Ir a ASA3 ", TPF" primera ficha.
  5. Cambiar el filtro, arriba a la izquierda 1 mm Níquel (haz filtro).
  6. Establece la posición 32.000 (rango 28.000 a 32.000, región crítica en torno a 28.000) → pasar a la posición, hacer vacío que es inferior a 5 mbar, asegúrese de que el detector se reading entre 1k-10K.
  7. Corre por 10 segundos durante aproximadamente 52 cuentas por segundo.
  8. Cambiar las ventanas de energía, (o medir la ventana de energía con la muestra solamente, sin incluir la caja del filtro). Ajuste la recta final durante 10 segundos.
  9. Encontrar la ubicación de la viga principal (233 canal, por ejemplo).
  10. Para otras carreras, cambie el filtro de nuevo en Tungsteno mm 2 (W, haz tapón) y empezar de 30.000.
  11. Encuentre la ubicación de todos los otros picos de las muestras.
  12. Use ImageJ-macro software para calibrar SAXS - hacer transiciones de intensidad vs canal de intensidad vs q (o espaciado d) (Figura 1).
  13. Use ImageJ-macro software para calibrar WAXS - hacer transiciones de intensidad vs canal de intensidad vs q (o espaciado d) (Figura 2).

8. Software Procedimiento

  1. Utilice el software ASA 3.3, para recoger los datos en vivo: Live Data TPF → → ficha Guardar archivo.
  2. Para EasySWAXS, haga clic en la ficha Configuración de dispositivo.
  3. Introduzca la "a", lambda, y valores d, así como el centro de gravedad.
  4. Seleccione Colimación Point.
  5. Seleccionar el tipo de partícula globular (a menos que sea un conocido por ser una varilla de partícula conformada plana).
  6. Haga clic en la ficha Guinier-Plot. Un I vs q 2 gráfico será mostrado.
  7. Arrastre las líneas verticales que rodean una sección de pendiente aproximadamente lineal.
  8. En la parte inferior de la pantalla, un valor de R se mostrará. Junto a esta hay un requisito de validación.
  9. Continúe arrastrando las líneas verticales más juntos hasta que el valor de validación es entre 1 y 2. Esto es subjetivo. El valor R, o radio de giro, que se obtiene es una estimación.

9. Fuente Procedimiento de apagado

  1. Verifique la seguridad y persianas rápidas están cerrados.
  2. Gire la llave de espera para la posición "ON".
  3. Espere a que la pantalla táctil para leer los niveles de reserva.
  4. Pulse R5 en el touchscreen.
  5. Reducir la corriente a 0 A.
  6. Reducir la tensión a 0 A.
  7. Gire la llave de rayos X a la posición "OFF".
  8. Encienda el interruptor principal en "OFF" presionando el botón de color rojo.

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Representative Results

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SAXS y WAXS completo puede proporcionar información estructural de la muestra a través de los siguientes parámetros: el radio de giro de tamaño de partícula, y la forma, el factor de estructura de la solución, la superficie interior específica y tamaño de poro, tipo celosía y dimensión, y la densidad de electrones 1. SAXS y WAXS también puede ser aplicado al estudio de la dinámica de las proteínas 2.

La información estructural de experimentos SWAXS se obtiene por comparación del espectro detectado experimentalmente y los resultados computacionales del sistema. Los resultados computacionales se calcularon en el programa con un razonable potencial efectivo V ef (r) desarrollado a partir de los modelos de la mecánica estadística, como el Ornstein-Zernike (OZ) la teoría de la ecuación integral (un ejemplo de este tipo de análisis se puede observar de la referencia. 3) .

Como parte de los métodos de análisis de datos, modelos de para la intensidad absoluta SWAXS I (q) tendrá que ser desarrollado en el software para el estudio, donde la intensidad de dispersión, I (q), es una función de la transferencia de impulso en el espacio recíproco, el vector de dispersión q = sen 4π (θ / 2) / λ. q es una cantidad escalar que está conectado con el ángulo de dispersión, θ, y la longitud de onda de la radiación, λ. q está en el intervalo de 0,03 a 0,6 Å -1 en un experimento típico SAXS con un seleccionado de muestra a detector de distancia. El tamaño de la región estudiada en el espacio real está relacionada con q por r = 2π / q, y se encuentra en el rango de 11-2000 4 Å. WAXS, por otro lado, puede resolver espaciamiento mayor que 3,3 Å. I (q) depende de las características atómicas y la posición de los centros de dispersión atómicos. En el experimento SWAXS, primero la intensidad medida vs canal debe ser calibrado con la intensidad vs q o espaciado d (Figura 1 y

Un ejemplo del análisis de SAXS de la lisozima en agua 2% en peso basado en tampón acuoso se muestra en la Figura 3. El valor para el radio de giro obtenido y se muestra en la Figura 3 se compara bien con el valor esperado de aproximadamente 1,44 nm 5. Más ejemplos de cómo aplicar SAXS a macromoléculas biológicas se pueden encontrar a partir de las referencias. 6-13. Un ejemplo del análisis WAXS del liposoma dispersada en una solución acuosa se ​​muestran en la Figura 4. Los picos igualmente espaciados decrecientes con el aumento de q, presta el liposoma en la base de agua de la muestra solución acuosa a una estructura laminar. Con cada laminillas, hay una disminución en la dispersión que se va a producir.

Figura 1
Figura 1. Calibración La SAXS con ImageJ-macro software. La muestra utilizada es el estearato de plata con la separación d 48,68 Å. La viga principal se encuentra en el canal 367 y los cinco picos principales (o parámetros de red de la muestra) se encuentra en 539, 717, 896, 1075, y 1253 canales, respectivamente.

Figura 2
Figura 2. El WAXS-Calibración con el software ImageJ-macro. La muestra utilizada es Para-Bromo polvo de ácido benzoico. Los seis picos principales (o parámetros de red de la muestra) se encuentra en 130, 484, 555, 613, 657, y canales 902, respectivamente.

Figura 3
Figura 3. Fondo-resta SAXS de datos sin procesar de lisozima (2% en peso). El Guinier de parcelas de software EasySWAXS puede utilizar la muy baja q

Figura 4
Figura 4. Fondo-resta WAXS de datos sin procesar de liposoma dispersa en una solución acuosa a base de agua se muestra en la Figura 4A. Los diagramas esquemáticos de la estructura de liposoma (lamelar 1D), su cabeza hidrófila y una cola hidrófoba, su pila de fosfolípidos de membrana, y su función de densidad de electrones se muestra en la Figura 4B. Haga clic aquí para ampliar la figura .

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Discussion

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El procedimiento comparativo del sistema SWAXS permite numerosas variables que deben determinarse a partir del análisis experimental. Los parámetros que se alcanzan a partir del análisis puede ser usada para fines diferentes de acuerdo con la muestra y la configuración experimental. SAXS proporciona información acerca de nano-escala de tamaño y la forma del objeto, mientras que WAXS se centra en la estructura atómica y micro escala-(por ejemplo, red molecular, celda unidad simetría dimensión). Más específicamente, para las partículas en las soluciones diluidas, SAXS puede estudiar el radio de giro, tamaño de partícula, y la forma; para muestras de alta densidad, SAXS puede estudiar el factor de estructura de la solución; para sistemas de fase aleatorias poroso / 2, SAXS estudiar puede superficie interior específica y tamaño de poro, y para muestras líquidas cristalinas, WAXS puede estudiar dimensiones celosía y la estructura de la unidad celular. Sin embargo, una limitación de SWAXS es ​​que un amplio rango de distribución de tamaños de partículas o polidispersidad severamente downgrade los resultados experimentales.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias al Dr. Manfred Kriechbaum de XRS Hecus y el Instituto de Biofísica y nanosistemas Investigación de la Academia Austriaca de Ciencias en Graz, Austria. LL y XW se apoya en parte por EE.UU. Departamento de Energía, bajo NERI-C Laudo No. DE-FG07-07ID14889 y los EE.UU. Comisión de Regulación Nuclear, bajo la Donación No. NRC-38-08-950. El instrumento SWAXS también es apoyado en parte por el Departamento de Energía de EE.UU., bajo la Donación No. DE-NE0000325.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera Hecus XRS and IBN,
Graz, Austria
GNOM ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
  2. Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
  3. Maranas, J. K. The effect of environment on local dynamics of macromolecules. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).
  4. Lysozyme in Water [Internet]. Available from: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/lysozyme/10_analysis2.html (2008-2012).
  5. Stribeck, N. X-Ray Scattering of Soft Matter. Springer. Heidelberg. (2007).
  6. Mertens, H. D., Svergun, D. I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. J. Struct. Biol. 172, (1), 128 (2010).
  7. Svergun, D. I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. Biol. Chem. 391, (7), 737 (2010).
  8. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
  9. Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27, (5-8), 1377-1381 (2007).
  10. Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures. Journal of Colloid and Interface Science. 357, (1), 88-94 (2011).
  11. Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution. Macromolecules. 27, (21), 6046-6054 (1994).
  12. Mittelbach, R., Glatter, O. Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles. Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).
Pequeñas y Wide Angle X-Ray Estudios de dispersión de macromoléculas biológicas en disolución
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Cite this Article

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).More

Liu, L., Boldon, L., Urquhart, M., Wang, X. Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution. J. Vis. Exp. (71), e4160, doi:10.3791/4160 (2013).

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