Summary
Lensfree optisk tomografi er en tredimensional mikroskopi teknik, som giver en rumlig opløsning på under 1 um x <1 um x <3 um x, y og z dimensioner henholdsvis over et stort billeddannelse-volumen fra 15 til 100 mm
Abstract
Tomografisk scanning har været et almindeligt anvendte værktøj i medicin som kan tilvejebringe tredimensionale (3D) strukturel information om genstande af forskellig størrelse skalaer. I mikrometer og millimeter skalaer, finde optisk mikroskopi modaliteter stigende brug på grund af ikke-ioniserende karakter af synligt lys, og tilgængeligheden af en bred vifte af belysning kilder (såsom lasere og lysemitterende-dioder) og påvisning elementer (såsom stort format CCD og CMOS-detektor-arrays). Blandt de nyligt udviklede optiske tomografiske mikroskopi nærmere, kan man inkludere optisk kohærens tomografi, optisk diffraktion tomografi, optisk projektion tomografi og lys-ark mikroskopi. 1-6 Disse platforme giver i snit billeddannelse af celler, mikroorganismer og model dyr, såsom C. elegans, zebrafisk og musefostre.
Eksisterende 3D optiske kameraer har generelt forholdsvis klodsede og kompleks arkitektur, hvilket begrænser the tilgængeligheden af disse udstyr til avancerede laboratorier, og hæmmer deres integration med lab-on-a-chip platforme og mikrofluid chips. At give et alternativ tomografisk mikroskop, vi for nylig udviklet lensfree optisk tomografi (LOT) som en high-throughput, kompakt og omkostningseffektiv optisk tomografi modalitet. 7 LOT udsmid brugen af linser og voluminøse optiske komponenter, og i stedet bygger på multi-vinkel belysning og digital beregning for at opnå dybde løst billeder af mikro-objekter over en stor billedbehandling volumen. Meget kan billedet biologisk prøve med en rumlig opløsning på under 1 um x <1 um x <3 um i x, y og z dimensioner, henholdsvis over et stort billeddannelse mængde fra 15 til 100 mm3, og kan være særligt nyttige til lab-on-a-chip platforme.
Protocol
1. Imaging Setup
LOT kan samles i et kompakt og let field-bærbar arkitektur 8, og alternativt som en optofluidic mikroskop med sektionsopdelt billeddannelse evne. 9 i denne rapport, men vi vil beskrive den grundlæggende billedbehandling opsætning af en bench-top implementering mod tomografi af statisk prøver.
- Belysning Modul: i Lot, kan delvist sammenhængende lyskilder såsom lysemitterende-dioder (LED) anvendes. For eksperimentel fleksibilitet, anvendte vi en monokromator med en Xenon-lampe (Cornerstone T260, Newport Corp.) Den monokromator blev indstillet for at tilvejebringe et udgangssignal med ~ 1-10 nm spektral bredde omkring et centrum bølgelængde på f.eks 450-650 nm. Dette delvist sammenhængende udgangssignal kobles derefter til en multimode optisk fiber (Thorlabs AFS105/125Y) til at levere delvist kohærent lys til systemet.
Den optiske fiber er monteret på en motoriseret rotation trin (ThorlabsPRM-1Z8 drevet af Thorlabs TDC001 controller) til at ændre vinklen på belysningen. Den motoriserede trin med lyskilden fastgjort, er monteret på en todimensional lineær XY-scene (Newport ILS50CC drevet af Newport UM-PPD regulatorer), som blev anvendt til at opnå i planet forskydninger af lyskilden ved en given vinkel. - Detektion: Lensfree optisk tomografi er en skalerbar teknologi, således at detektor array kan vælges i henhold til kravene i de applikationer, uden væsentligt at ændre billedet erhvervelse trin eller databehandling. I denne rapport beskæftigede vi en CMOS-sensor opstilling med 5 megapixel, med en pixelstørrelse på 2,2 um (IDS Imaging, UI-1485LE-M). Detektoren anvendes til at registrere de store felt af-visning (f.eks 24 mm 2) holografiske billeder af prøver, som blev anbragt direkte på toppen af det aktive areal af detektoren. Hvis en dobbelt-akse tomografi setup skal gennemføres 7, detektoren bør enLSO blive monteret på en vandret (med hensyn til den optiske tabellen) rotation trin (f.eks Thorlabs RP-01) at rotere prøven (sammen med detektoren) i planet vinkelret på den optiske akse. 7
2. Prøvefremstilling
Mens lensfree optisk tomografi kan billede en række objekter, såsom celler og mikroorganismer, vil vi illustrere de grundlæggende principper ved at udføre tre-dimensionelle mikroskopi af en C. elegans prøve.
- Ved anvendelse af en skalpel eller en spatel, en lille stykke agar tage fra petriskålen indeholdende C. elegans kultur. En kubisk stykke flere millimeter langs hver dimension indeholder hundredvis af nematoder.
- Anbring den lille klump agar i en polypropylen hætteglas indeholdende 1 ml deioniseret (DI) vand.
- Forsigtigt vortex for 0,5-1 minutter, og vente 10-15 minutter, indtil de orme kravler ud af agar stykke ind i DI vand.
- For atmidlertidigt at immobilisere ormene, tilsættes 1 ml 5-10 mM levamisol opløsning (Sigma-Aldrich), og vent 10 minutter.
- Pipettere 5-10 pi prøve fra bunden af hætteglasset, og sandwich mellem to dækglas. Denne prøve, som indeholder et stort antal midlertidigt immobiliseret orme (f.eks 50-100 orme), kan placeres på detektoren for at starte dataopsamling.
3. Data Acquisition
Her vil vi opsummere billedet køb trin til en typisk LOT eksperiment, som blev automatiseret ved hjælp af en brugerdefineret udviklet LabView interface.
- Justere første vinkel drejning trin til -50 °, hvor 0 ° svarer til den lodrette position af lyskilden.
- Justere udgangsstillingen af XY-scene til (0,0), som er startpositionen.
- Indstil en eksponeringstid på detektoren bedst udnytte sin dynamiske område, således at billedet er så lyst som muligt uden saturated pixels.
- Uden at ændre vinklen på rotationen scenen, tage 9 billeder. For hvert billede, flytte XY-scene til en ny position i en 3x3 kvadrat gitter, således at hvert billede skifter med ca en fjerdedel af en pixel i forhold til den foregående. Erhverve flere billeder ved hver vinkel, fx i en 6μ6 gitter, kan forbedre opløsning afhængig af objektet og signal-til-støjforhold (SNR). 10
- Justere udgangsstillingen af XY-scene til (0,0), som er startpositionen.
- Forøge vinklen af rotationen trin ved trin på 2 °, indtil det når 50 °. Efter hver tilvækst, dvs ved hver ny vinkel, skal du gentage trin 3-5. De vinkeltrin kan være finere eller grovere afhængig optimering af købet tid vs billedopløsning.
- (Valgfrit trin, hvis en dobbelt-akse tomografi ordningen er at blive udnyttet) Drej den horisontale scene, hvor detektoren er monteret med 90 °. Dereftergentage trin 1-6.
4. Dataanalyse
Efter trin 1-6 i afsnit 3, et sæt af 459 billeder er erhvervet, som indeholder 9 sub-pixel flyttet billeder for hver af de 51 forskellige indfalds. For det første er hvert sæt af 9 billeder digitalt bearbejdet, ved hjælp af pixel super-opløsning algoritmer 10, for at opnå en høj opløsning (HR) fremskrivning hologram pr vinkel. Det skal bemærkes, at pixel super-opløsning refererer til overvinde begrænsningen af pixelstørrelse, snarere end diffraktionsgrænsen, på den rumlige opløsning af lensfree billeder. Pixel super-løst hologrammer bliver derefter digitalt rekonstrueres 7-10 til opnåelse 51 projektion billeder. Dette sæt af 51 projektions-billeder er derefter tilbage-fremskrevet med TomoJ, en plug-in til ImageJ (en open source billede analyse software). 11 Denne back-projektion drift udsender et tredimensionelt billede (tomogrammer) af prøven. Selvom det ikke er implementeret her,en dobbelt-akse tomografi arrangement kan også anvendes som beskrevet i ref. 7. I dette skema er et andet sæt tomogrammer opnået ved at dreje lyskilden langs en vinkelret akse i forhold til den første rotationsakse, som giver mere rumlig information om prøven, og forbedrer aksial opløsning.
5. Repræsentative resultater
Den store field-of-view (FOV) i lensfree optisk tomografi er vist i figur 1. Idet prøven anbringes direkte på toppen af detektor-array, kan holografiske billeder af objekter der skal registreres over en synsfelt på 24 mm 2, som yderligere kan forøges ved hjælp af nye detektorsystemer med større aktive områder.
Selvom pixel størrelsen af detektor-array begrænser løsningen af de optagne holografiske billeder, pixel super-opløsning teknikker afhjælpe dette problem. Figur 2 viser pixel super-løst hologrammer sammenmed de rekonstruerede billeder (dvs. projektion billeder), der tilbyder sub-mikrometer rumlig opløsning, for tre forskellige indfalds.
Projektionspunkterne billeder kan kombineres med tomografiske billeder genopbygning teknikker (f.eks filtreret back-fremspring) at beregne tomogrammer (dvs. tredimensionelle billeder) af prøven. Figur 3 viser tre skive billeder i xy planet gennem den forreste del af orm, hvor pharyngeal røret er kun synligt i skive gennem z = 8 um, som forventet ud fra dette omtrent cylindrisk struktur med ~ 5 um ydre diameter. Desuden tværsnit billede i xz-planet (indsat i figur 3 øverste panel) viser tydeligt grænser ormen og pharyngeale rørets indvendige (understreget med pile), hvilket viser succesfuld 3D billeddannelse af pharynx.
Figur 2 viser pixel super-løst hologrammer (venstre panel) og digitalt rekonstruerede projektionsbilleder (højre panel) i en C. elegans orm (skåret fra et stort område-med-view) ved tre forskellige belysning vinkler. Hver projektion billede indeholder oplysninger om en anden synsvinkel, som gør det muligt beregning af 3D-strukturen gennem en filtreret back-projektion operation.
Figur 3 viser beregnede tomogrammer til C. elegans orm of Figur 2. (Øverste række) viser en skive billede af hele orm ved z = 3 um. Den indsatte viser et tværsnit billede fra den forreste del af orm. Skala bar den indsatte er 50 um. (Nederste række) viser tre slice billeder gennem den forreste af ormen, viser den optiske sektionering evne lensfree optisk tomografi. Pilene hele tal angiver det samme punkt på pharynxregionens rør af orm. Et mikroskop billede (x40, 0,65-NA) er også til visuel sammenligning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er vigtigt at understrege, at den unikke geometri lensfree on-chip holografisk mikroskopi er den kritiske enabler for at opnå pixel super-opløsning og tomografisk billeddannelse. Da de optagede billeder ikke antages at være projektion billeder som i usammenhængende kontakt billedbehandling nærmer sig 12, men projektion hologrammer og diffraktion af det transmitterede lys, indtil den rammer detektoren kan digitalt korrigeres ved holografisk genopbygning. Derfor kan variationer i prøve-til-sensor afstand tages i betragtning. Endvidere er eftersom prøve-til-sensor afstand typisk på ~ 0,5-5 mm, medens lyskilden er placeret på ~ 4-10 cm afstand fra prøven og opnåede subpixeldata skift ikke kræver stor kilde forskydninger. Som et resultat er at bevæge lyskilden kun 50-100 um tilstrækkeligt til at opnå subpixeldata forskydninger på detektoren planet, som forhindrer uønskede variationer i i) belysning retning / perspektiv ennd ii) en effektiv prøve-til-sensor afstand hver kilde position. Hvis ikke forebygges, kan disse variationer forårsage betydelige aberrationer i pixelen super-løst billeder. Derfor kan hologrammer registreres ved hver kildens position, ved en given vinkel, der faktisk anses for at være sub-pixel forskudte versioner af den samme holografiske billede. Desuden næsten justering uden udformning af lensfree optisk tomografi gør det temmelig ligetil at optage fremspringet hologrammer ved forskellige vinkler, blot ved at dreje en lyskilde 7,9, eller ved hjælp af flere lyskilder (såsom LED'er) ved forskellige vinkler 8.
LOT er en ny teknik, der tilbyder et stort rum-båndbredde produkt til on-chip billeddannelse af prøver. Vigtigere er det en skalerbar teknologi, der vil få stor gavn af den næste generation detektorsystemer. Det er, som hurtigere CMOS og CCD detektorsystemer med tættere pixel bliver tilgængelige, parti continuously forbedre både i forhold til opløsning, field-of-view og hastighed. Dette er en vigtig fordel ved lensfree on-chip mikroskopi på konventionel lysmikroskopi, hvor billedkvalitet bestemmes af flere sub-systemer, hvilket hæmmer direkte skalering af billedkvalitet med de fremskridt inden for digitale teknologier.
Sammenfattende, så high-throughput 3D mikroskopi af prøver over en stor billedbehandling volumen, i et kompakt arkitektur kan lensfree optisk tomografi være et nyttigt værktøjssæt til lab-on-a-chip systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
- Schmitt, J. M. Optical coherence tomography (OCT): a review, J. Sel. Top. Quant. Elect. 5, 1205-1215 (1999).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sørensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sung, Y., Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Dasari, R. R., Feld, M. S. Optical diffraction tomography for high resolution live cell imaging. Opt. Exp. 17, 266-277 (2009).
- Debailleul, M., Simon, B., Georges, V., Haeberle, O., Lauer, V. Holographic microscopy and diffractive microtomography of transparent samples. Meas. Sci. Technol. 19, 074009 (2008).
- Charrière, F., Pavillon, N., Colomb, T., Depeursinge, C., Heger, T. J., Mitchell, E. A. D., Marquet, P., Rappaz, B. Living specimen tomography by digital holographic microscopy: Morphometry of testate amoeba. Opt. Exp. 14, 7005-7013 (2006).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Mavandadi, S., Yu, S. W., Feng, S., Lau, R., Ozcan, A. Lens-free optical tomographic microscope with a large imaging volume on a chip. Proc. Nat. Acad. Sci. 108, 7296-7301 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Sikora, U., Yaglidere, O., Yeah, J., Ozcan, A. Field-portable Lensfree Tomographic Microscope. Lab Chip. 11, 2222-2230 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Zhu, H., Ozcan, A. Optofluidic tomography on a chip. App. Phys. Lett. 98, 161109 (2011).
- Bishara, W., Su, T. W., Coskun, A., Ozcan, A. Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution. Opt. Exp. 18, 11181-11191 (2010).
- Messaoudi, C., Boudier, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Heng, X., Erickson, D., Baugh, L. R., Yaqoob, Z., Sternberg, P. W., Psaltis, D., Yang, C. Optofluidic Microscopy: A Method for Implementing High Resolution Optical Microscope On A Chip. Lab on a Chip. 6, 1274-1276 (2006).
