Summary
Lensfree optischen Tomographie ist eine dreidimensionale Mikroskopie-Technik, die eine räumliche Auflösung von <1 um bietet × <1 um x <3 &mgr; m in x-, y-und z-Dimensionen jeweils über einen großen Imaging-Volumen von 15-100 mm
Abstract
Tomographischen Bildgebung wurde ein weit verbreitetes Instrument in der Medizin, wie sie dreidimensionale (3D) Struktur-Informationen über Objekte unterschiedlicher Größe skaliert bieten kann. In Mikrometer und Millimeterskalen finden optische Mikroskopie Modalitäten zunehmend aufgrund der nicht-ionisierender Natur des sichtbaren Lichts, und die Verfügbarkeit eines umfassenden Satzes von Lichtquellen (wie Laser und Licht emittierende Dioden-) und Detektorelemente (z. B. großformatigen CCD-und CMOS-Detektor-Arrays). Unter den neu entwickelten optischen Mikroskopie tomographischen Modalitäten, kann man auch die optische Kohärenztomographie, beugungsoptisch Tomographie, optische Projektion und Licht-Tomographie-Blatt-Mikroskopie. 6.1 Diese Plattformen bieten Schnittbildverfahren von Zellen, Mikroorganismen und Tiere wie Modell C elegans, Zebrafisch und Maus-Embryonen.
Vorhandene optische 3D-Imager haben in der Regel relativ sperrige und komplexe Architekturen, die Begrenzung the Verfügbarkeit dieser Anlagen zu modernsten Labore, und behindert ihre Integration in Lab-on-a-Chip-Plattformen und Mikrofluidik-Chips. Um eine Alternative tomographischen Mikroskop zu schaffen, haben wir kürzlich entwickelt lensfree optischen Tomographie (LOT) als High-Throughput-, kompakte und kostengünstige optische Tomographie Modalität. 7 LOT verwirft den Einsatz von Linsen und optischen Komponenten sperrig, und statt dessen setzt auf Multi-Angle- Beleuchtung und digitale Berechnung zu tiefenaufgelöste Abbildung von Mikro-Objekte über ein großes Volumen Bildgebung zu erreichen. LOT abbilden kann biologischen Probe mit einer räumlichen Auflösung von <1 um x <1 um x <3 um in der x, y und z jeweils über einen großen Bildgebungsvolumen von 15-100 mm 3, und ist besonders nützlich Lab-on-a-Chip-Plattformen.
Protocol
1. Imaging-Setup
Vieles kann in einem kompakten und leichten tragbaren Feld-Architektur 8 zusammengebaut werden, und alternativ als optofluidischer Mikroskop mit Schnittbildverfahren Fähigkeit. 9 In diesem Bericht werden wir aber die Basic Imaging-Setup für eine Tisch-Implementierung in Richtung Tomographie von statischen beschreiben Proben.
- Beleuchtung Modul: LOT, teilweise kohärente Lichtquellen wie Licht emittierende Dioden (LEDs) verwendet werden. Für experimentelle Flexibilität, verwendeten wir einen Monochromator mit einer Xenon-Lampe (Cornerstone T260, Newport Corp.) Der Monochromator wurde eingestellt, um einen Ausgang mit ~ 1-10 nm spektrale Breite um eine Mittenwellenlänge von zB 450-650 nm bereitzustellen. Diese teilweise kohärente Ausgabe wird dann an einer Multimode-Lichtleitfaser (Thorlabs AFS105/125Y) teilweise kohärentes Licht auf das System liefern könnten.
Die optische Faser wird auf einem Drehtisch montiert motorisierten (ThorlabsPRM-1Z8 durch Thorlabs TDC001 Regler angesteuert), um den Winkel der Beleuchtung ändern. Die motorisierten Tisch, wobei die Lichtquelle befestigt ist, auf einer zweidimensionalen linearen XY-Tisch (Newport ILS50CC von Newport MFA-Controllern gesteuert werden PPD), die verwendet werden, um Verschiebungen in der Ebene der Lichtquelle in einem bestimmten Winkel zu erreichen, wurde angebracht. - Detektion: Lensfree optischen Tomographie ist eine skalierbare Technologie, so dass die Detektoranordnung gemäß den Anforderungen der Anwendungen ohne wesentliche Änderung der Bildaufnahme, bzw. die Datenverarbeitungseinrichtung gewählt werden. In diesem Bericht beschäftigten wir einen CMOS-Sensor-Array mit 5 Megapixel, mit einer Pixelgröße von 2,2 um (IDS Imaging, UI-1485LE-M). Der Detektor wird verwendet, um die weiten Sichtfeld-Ansicht (zB 24 mm 2) holographische Bilder von Proben, die direkt auf der Oberseite des aktiven Bereichs des Detektors gebracht wurden aufgezeichnet. Wenn ein Zwei-Achsen-Tomographie-Setup durchzuführen ist 7, sollte der Detektor einlso auf einer horizontalen (mit Bezug auf die optische Tabelle) Rotationstisch (zB Thorlabs RP-01), um die Probe (zusammen mit dem Detektor) in der Ebene senkrecht zur optischen Achse drehbar gelagert werden. 7
2. Probenvorbereitung
Während lensfree optischen Tomographie abbilden kann eine Vielzahl von Objekten wie Zellen und Mikroorganismen, werden wir die grundlegenden Prinzipien, indem dreidimensionale Mikroskopie eines C veranschaulichen elegans Probe.
- Mit einem Skalpell oder einem Spatel, nehmen Sie ein kleines Stück Agar aus der Petrischale mit den C elegans Kultur. Eine kubische Stück von mehreren Millimetern entlang jeder Dimension enthält Hunderte von Nematoden.
- Setzen Sie den kleinen Klumpen des Agar-Agar in einem Polypropylen-Fläschchen mit 1 ml deionisiertem Wasser (DI).
- Vorsichtig vortexen für 0,5-1 min, und warten Sie 10-15 Minuten, bis die Würmer kriechen aus dem Agar-Stück in die DI-Wasser.
- Umvorübergehend zu immobilisieren die Würmer, 1 ml von 5-10 mm Levamisol-Lösung (Sigma-Aldrich) und warten Sie 10 min.
- Pipettieren 5-10 ul der Probe aus dem Boden des Fläschchens und Sandwich zwischen zwei Deckgläsern. Diese Probe, die eine große Anzahl von vorübergehend immobilisiert Schnecken (zB 50-100 Würmer), kann auf den Detektor mit der Datenerfassung beginnen abgegeben werden.
3. Data Acquisition
Hier fassen wir die Bildaufnahme Schritte für eine typische LOT Experiment, das unter Verwendung einer benutzerdefinierten entwickelten LabView-Schnittstelle automatisiert wurde.
- Einstellen der ersten Drehwinkel Stufe bis -50 °, wobei 0 ° entspricht der vertikalen Position der Lichtquelle.
- Stellen Sie die ursprüngliche Position der XY-Bühne auf (0,0), das ist der HOME-Position.
- Stellen Sie die Belichtung des Detektors am besten nutzen seines Dynamikbereichs so daß das Bild so hell wie möglich ohne saturated Pixel.
- Ohne Änderung des Winkels der Drehung Bühne, erobern 9 Bildern. Für jedes Bild, bewegen die XY-Stufe an eine neue Position in einem 3x3 quadratischen Raster so dass jeder Bildbereich um etwa ein Viertel eines Pixels verschiebt gegenüber dem vorherigen. Erfassen weitere Bilder in jedem Winkel, z. B. in einem 6μ6 Gitter, könnte Auflösung abhängig von der Art des Objekts und des Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) zu verbessern. 10
- Stellen Sie die ursprüngliche Position der XY-Bühne auf (0,0), das ist der HOME-Position.
- Erhöhen Sie den Winkel der Drehung der Bühne in Schritten von 2 ° bis +50 ° erreicht. Nach jedem Inkrement bei jedem neuen Blickwinkel, wiederholen Sie die Schritte 3-5 dh. Die Winkelinkrementen können feinere oder gröbere abhängig von der Optimierung der Messzeit vs Bildauflösung.
- (Optionaler Schritt, wenn ein Zwei-Achsen-Tomographie Schema genutzt werden soll) Drehen Sie den horizontalen Bühne, auf der der Detektor von 90 ° montiert ist. Dann,wiederholen Sie die Schritte 1-6.
4. Datenanalyse
Nach den Schritten 1-6 in Abschnitt 3, ein Satz von 459 Bildern wird erworben, der 9 Sub-Pixel verschoben Bilder für jede der 51 verschiedenen Beleuchtungs enthält. Zunächst wird jeder Satz von 9 Bilder digital bearbeitet, mit Pixel-Super-Resolution-Algorithmen 10, zu einem hochauflösenden (HR) Projektion Hologramm pro Winkel zu erhalten. Es sei darauf hingewiesen, dass Pixel Super-Auflösungseffekt zur Überwindung der Begrenzung der Pixelgröße bezieht, als die Beugungsgrenze der räumlichen Auflösung der Bilder lensfree werden. Pixel super-aufgelösten Hologramme werden dann digital rekonstruiert 10.07 bis 51 Projektionsbilder erhalten. Dieser Satz von 51 Projektionsbilder dann rückprojiziert mit TomoJ, ein Plug-in für ImageJ (ein Open-Source Bildanalyse-Software). 11 Dieser Rückprojektion Betrieb gibt ein dreidimensionales Bild (Tomogramme) der Probe. Obwohl hier nicht implementiert,eine zweiachsige Tomographie Modell könnte auch verwendet werden, wie in Referenz beschrieben. 7. In diesem Schema wird ein zweiter Satz der Schichtbilder durch Drehen der Lichtquelle entlang einer orthogonalen Achse in Bezug auf die erste Drehachse, die mehrere räumliche Informationen über die Probe enthält, und verbessert die axiale Auflösung.
5. Repräsentative Ergebnisse
Das große Feld-of-view (FOV) von lensfree optischen Tomographie ist in Abbildung 1 gezeigt. Wenn die Probe direkt auf der Oberseite des Detektor-Array platziert ist, können holographische Bilder der Objekte mit einem Sichtfeld von 24 mm 2, die weiter gesteigert werden kann anhand einer neuen Detektor-Arrays mit größeren aktiven Bereichen aufgezeichnet werden.
Obwohl Pixelgröße des Detektors-Array begrenzt die Auflösung der aufgenommenen holographische Bilder, mildern Pixel Super-Resolution-Techniken dieses Problem. Abbildung 2 zeigt Pixel super-aufgelösten Hologramme entlangmit den rekonstruierten Bildern (also Bilder Projektion), die Sub-Mikrometer-räumliche Auflösung bieten, für drei verschiedene Winkel der Beleuchtung.
Die Projektionsbilder kombiniert tomographische Bildrekonstruktionstechniken (zB gefilterten Rückprojektion) an Schichtaufnahmen (dh dreidimensionale Bilder) der Probe zu berechnen. 3 zeigt drei Schnittbilder in der xy-Ebene durch die vordere der Schnecke, wobei die Rachentubus ist nur in der Schicht durch z = 8 um, wie etwa ins zylindrische Struktur mit ~ 5 um Außendurchmesser erwartet sichtbar. Darüber hinaus ist die Querschnittsbild in der xz-Ebene (Einschub in Abbildung 3 oberes Feld) zeigt deutlich die Grenzen des Wurms und die Schlundsonde innen (spitz durch die Pfeile), was erfolgreiche 3D-Bildgebung des Rachens.
Abbildung 2 zeigt die Pixel super-aufgelösten Hologramme (linkes Bild) und die digital rekonstruierte Projektionsbilder (rechtes Bild) für eine C elegans-Wurm (abgeschnitten von einem großen Feld-of-view) an drei verschiedenen Beleuchtungswinkel. Jeder Vorsprung Bild enthält Informationen zu einem anderen Blickwinkel, die Berechnung der 3D-Struktur ermöglicht durch eine gefilterte Rückprojektion Betrieb.
Abbildung 3 zeigt Computertomogramme für die C elegans Wurm oAbbildung 2 f. (Obere Reihe) zeigt ein Schnittbild des gesamten Wurm bei z = 3 um. Der Einschub zeigt eine Querschnittsansicht Bild von der vorderen der Schnecke. Maßstabsbalken des Einsatzes ist 50 um. (Untere Reihe) zeigt drei Schnittbilder durch die vordere des Wurms, was die optische Schnitte Fähigkeit lensfree optischen Tomographie. Pfeile in der Figur geben die gleichen Punkt auf dem Rachentubus der Schnecke. Ein Mikroskop-Bild (x40, 0,65-NA) wird auch für visuellen Vergleich zur Verfügung gestellt.
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Discussion
Es ist wichtig zu betonen, dass die einzigartige Geometrie der lensfree On-Chip-holographische Mikroskopie die kritische Enabler zu Pixel Super-Resolution und tomographische Bildgebung zu erreichen ist. Da die aufgezeichneten Bilder werden nicht angenommen Projektionsbilder sein, wie in inkohärenten Kontaktabbildungsvorrichtung nähert 12, aber Vorsprung Hologramme, die Beugung des durchgelassenen Lichts, bis sie auf den Detektor auftrifft kann digital holografische Rekonstruktion korrigiert werden. Daher können Schwankungen in der Abtast-und Sensor berücksichtigt werden. Darüber hinaus, da der Abtast-und Sensor typischerweise ~~~V 0,5-5 mm, während die Lichtquelle bei ~ 4-10 cm Abstand von der Probe angeordnet ist, erreichen Subpixel-Verschiebungen erfordert keine großen Verschiebungen Quelle. Als ein Ergebnis Bewegen der Lichtquelle nur von 50-100 um ausreichend ist, um Sub-Pixel-Verschiebungen in der Detektorebene, verhindert unerwünschte Variationen in i) Beleuchtungsrichtung / perspektivische, ein zu erreichennd ii) effektive Probe-zu-Sensor-Abstand bei jeder Quelle Position. Wenn nicht verhindert, könnte diese Variationen zu erheblichen Abweichungen in den Pixel-super-aufgelösten Bildern. Daher können die Hologramme in jede Quelle Position aufgezeichnet, in einem bestimmten Winkel, tatsächlich als Sub-Pixel verschobenen Versionen des gleichen holographisches Bild sein. Darüber hinaus macht die fast Ausrichtung-freie Gestaltung der optischen Tomographie lensfree es ziemlich einfach, Projektion Hologramme in verschiedenen Winkeln aufnehmen, einfach durch Drehen einer Lichtquelle 7,9, oder die Verwendung mehrerer Lichtquellen (zB LEDs) in unterschiedlichen Winkeln 8.
LOT ist eine aufstrebende Technik, die einen großen Raum-Bandbreite-Produkt für On-Chip-Bildgebung von Proben bietet. Wichtig ist, dass es sich um eine skalierbare Technologie, die sich stark von der nächsten Generation Detektor-Arrays profitieren. Das heißt, als schneller CMOS-und CCD-Detektor Arrays mit dichter Pixel verfügbar sind, wird LOT Continuously verbessern sowohl in Bezug auf Auflösung, field-of-view und Geschwindigkeit. Dies ist ein wichtiger Vorteil der lensfree On-Chip-Mikroskopie über herkömmliche Lichtmikroskopie, wo Abbildungsleistung von mehreren Teilsysteme bestimmt wird, die Behinderung des direkten Skalierung der Bildqualität mit den Fortschritten in der digitalen Technologie.
Zusammenfassend ermöglicht Hochdurchsatz-3D-Mikroskopie von Präparaten über einen großen Bildgebungsvolumen, in einem kompakten Architektur können lensfree optischen Tomographie eine nützliche Werkzeuge für Lab-on-a-Chip-Systeme sein.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
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