Summary
Lensfree ottico tomografia è una tecnica tridimensionale microscopia che offre una risoluzione spaziale di <1 um x <1 um x <3 pm di x, y e Z, rispettivamente, per un grande volume di imaging di 15-100 mm
Abstract
Di imaging tomografico è stato uno strumento ampiamente utilizzato in medicina come può fornire tridimensionale (3D) informazioni strutturali per quanto riguarda oggetti di scale di misura diverse. In scale micrometri e millimetri, modalità microscopia ottica trovare uso sempre a causa della non ionizzanti natura della luce visibile, e la disponibilità di una vasta gamma di sorgenti di illuminazione (ad esempio laser e che emettono luce di diodi) e elementi di rilevazione, ad esempio grande formato CCD e CMOS-array detector). Tra i recentemente sviluppate modalità di microscopia ottica tomografiche, si può comprendere la tomografia a coerenza ottica, la tomografia a diffrazione ottica, tomografia a proiezione ottica e luce fogli microscopio. 1-6 Queste piattaforme forniscono immagini in sezione di cellule, microrganismi e animali modello come C. elegans, zebrafish ed embrioni di topo.
Esistenti imager 3D ottici hanno generalmente architetture relativamente ingombranti e complessi, limitando °e la disponibilità di questi strumenti e laboratori avanzati, e impedendo la loro integrazione con lab-on-a-chip piattaforme e chip microfluidica. Per fornire un microscopio alternativa tomografica, abbiamo recentemente sviluppato lensfree tomografia ottica (LOT) come una modalità high-throughput, compatto e conveniente tomografia ottica. 7 LOT rigetti l'uso di lenti e ingombranti componenti ottici, e si basa invece sul multi-angolo illuminazione e calcolo digitale per raggiungere profondità risolto imaging di micro-oggetti su un volume di immagini di grandi dimensioni. LOT può immagine campione biologico ad una risoluzione spaziale di <1 um x <1 um x <3 um x, y e Z, rispettivamente, su un grande volume di imaging di 15-100 mm 3, e possono essere particolarmente utili per lab-on-a-chip piattaforme.
Protocol
1. Imaging Setup
LOT possono essere assemblati in un compatto e leggero portatile campo dell'architettura 8, e alternativamente come un microscopio optofluidic con la capacità di imaging in sezione. 9 In tale relazione, tuttavia, descriveremo la configurazione di base delle immagini per una panchina-top implementazione verso la tomografia di elettricità statica campioni.
- Modulo di illuminazione: In LOT, fonti di luce parzialmente coerente come emettitori di luce dei diodi (LED) può essere utilizzato. Per una maggiore flessibilità di sperimentazione, abbiamo utilizzato un monocromatore con una lampada allo xeno (Cornerstone T260, Newport Corp.). Il monocromatore è stata regolata per fornire un output con ~ larghezza spettrale 1-10 nm lunghezza d'onda intorno a un centro di esempio 450-650 nm. Questa uscita parzialmente coerente viene poi accoppiato ad una fibra ottica multimodale (Thorlabs AFS105/125Y) per fornire luce parzialmente coerente al sistema.
La fibra ottica è montato su uno stadio di rotazione motorizzata (ThorlabsPRM-1Z8 guidato da Thorlabs TDC001 controller) per cambiare l'angolo di illuminazione. La fase motorizzato, con la sorgente luminosa collegata, è montato su una bidimensionale stadio lineare XY (Newport ILS50CC guidato da Newport MFA-controllori PPD), che è stato utilizzato per ottenere nel piano spostamenti della sorgente di luce ad un angolo determinato. - Detection: tomografia Lensfree ottica è una tecnologia scalabile tale che l'array rivelatore può essere scelto secondo le esigenze delle applicazioni senza alterare significativamente la procedura di acquisizione di immagini o il trattamento dei dati. In questa relazione, abbiamo utilizzato un array di sensori CMOS con 5 megapixel, con una dimensione dei pixel di 2,2 micron (IDS Imaging, UI-1485LE-M). Il rilevatore viene utilizzato per registrare i ampio campo di vista (esempio 24 mm 2) immagini olografiche di campioni che sono stati posizionati direttamente sulla parte superiore della zona attiva del rivelatore. Se un doppio asse configurazione tomografia è attuato 7, il rivelatore uno dovrebbeLSO essere montato su una orizzontale (rispetto alla tabella ottico) stadio di rotazione (ad esempio Thorlabs RP-01) per ruotare il campione (insieme con il rivelatore) nel piano normale all'asse ottico 7.
2. Preparazione del campione
Mentre tomografia lensfree ottico può immagine una varietà di oggetti quali cellule e microrganismi, si illustreranno i principi fondamentali eseguendo tridimensionale microscopia di C. elegans campione.
- Usando un bisturi o una spatola, prendete un piccolo pezzo di agar dalla capsula di Petri contenente il C. elegans cultura. Un pezzo cubo di alcuni millimetri, lungo ogni dimensione conterrà centinaia di nematodi.
- Posizionare il piccolo pezzo di agar in un flaconcino polipropilene contenente 1 ml deionizzata (DI).
- Delicatamente su vortex per 0,5-1 min, e attendere per 10-15 minuti fino a quando i vermi strisciare fuori del pezzo agar in acqua deionizzata.
- Allo scopo diimmobilizzare temporaneamente i vermi, aggiungere 1 ml di soluzione di 5-10 levamisole mM (Sigma-Aldrich) e attendere per 10 minuti.
- Pipettare 5-10 microlitri di campione dal fondo della fiala, e sandwich tra due vetrini. In questo esempio, contenente un gran numero di vermi temporaneamente immobilizzati (ad esempio 50-100 vermi), possono essere immessi sul rivelatore per avviare acquisizione dati.
3. Data Acquisition
Qui, riassumiamo le fasi di acquisizione delle immagini per un esperimento LOT tipico, che è stato automatizzato mediante un interfaccia personalizzata sviluppata LabView.
- Regolare l'angolo iniziale della fase di rotazione a -50 °, dove 0 ° corrisponde alla posizione verticale della sorgente luminosa.
- Regolare la posizione iniziale della fase XY a (0,0), che è la posizione iniziale.
- Regolare il tempo di esposizione del rivelatore di utilizzare al meglio la gamma dinamica in modo tale che l'immagine è luminosa come possibile senza saturated pixel.
- Senza modificare l'angolo di fase di rotazione, catturare immagini 9. Per ogni immagine, spostare lo stadio XY ad una nuova posizione in una griglia 3x3 quadrato tale che ciascuna immagine si sposta di circa un quarto di pixel rispetto al precedente. Acquisire più immagini ad ogni angolo, ad esempio in una griglia 6μ6, può migliorare la risoluzione a seconda del tipo di oggetto e di segnale-rumore (SNR) 10.
- Regolare la posizione iniziale della fase XY a (0,0), che è la posizione iniziale.
- Aumentare l'angolo di fase di rotazione da incrementi di 2 °, fino a raggiungere 50 °. Dopo ogni incremento, cioè ad ogni nuovo angolo, ripetere i passaggi 3-5. Gli incrementi angolari possono essere più sottili o grossolane a seconda della ottimizzazione del tempo di acquisizione vs risoluzione delle immagini.
- (Step opzionale se uno schema a doppio asse tomografia deve essere utilizzato) ruotando la fase orizzontale su cui è montato il rilevatore di 90 °. Quindi,ripetere i passaggi 1-6.
4. Analisi dei dati
Seguendo i passaggi 1-6 nella sezione 3, una serie di immagini 459 è acquisita, che contiene 9 immagini trasferite sub-pixel per ciascuna delle 51 diversi angoli di illuminazione. In primo luogo, ogni serie di 9 immagini elaborate digitalmente, utilizzando pixel di risoluzione di algoritmi super-10, per ottenere uno ad alta risoluzione (HR) per l'angolo di proiezione olografica. Va notato che pixel super-risoluzione si riferisce a superare la limitazione della dimensione dei pixel, piuttosto che il limite di diffrazione, la risoluzione spaziale di immagini lensfree. Pixel ologrammi super-risolti vengono poi ricostruiti digitalmente 7-10 di ottenere 51 immagini di proiezione. Questo insieme di 51 immagini di proiezione è quindi back-proiettato con TomoJ, un plug-in per ImageJ (open source software di analisi dell'immagine) 11. Questo retroproiezione operazione genera un immagine tridimensionale (tomografie) del campione. Anche se non implementato qui,un doppio asse regime tomografia potrebbe essere utilizzato anche come descritto in rif. 7. In questo schema, un secondo insieme di tomogrammi è ottenuta ruotando la sorgente di luce lungo un asse ortogonale rispetto al primo asse di rotazione, che fornisce informazioni relative più spaziale del campione, e migliora la risoluzione assiale.
5. Risultati rappresentativi
L'ampio campo di vista (FOV) di tomografia lensfree ottico è mostrato nella Figura 1. Poiché il campione viene posto direttamente sulla sommità del rilevatore-matrice, immagini olografiche degli oggetti possono essere registrati su un FOV di 24 mm 2, che può essere ulteriormente aumentata mediante rilevatori a schiera emergenti con grandi aree attive.
Sebbene dimensioni dei pixel del rivelatore-matrice limita la risoluzione delle immagini registrate olografiche, pixel super-risoluzione tecniche attenuare questo problema. Figura 2 mostra pixel super-risolti ologrammi lungocon le immagini ricostruite (cioè immagini di proiezione) che offrono sub-micrometrica risoluzione spaziale, per tre diversi angoli di illuminazione.
Le immagini proiezione possono essere combinate con le tecniche di ricostruzione delle immagini tomografiche (per esempio filtrato retro-proiezione) per calcolare tomogrammi (ossia immagini tridimensionali) del campione. Figura 3 mostra tre immagini di fetta nel piano xy attraverso la parte anteriore della vite senza fine, in cui la tubo faringeo è visibile solo nella fetta attraverso z = 8 pm, come previsto da questa struttura approssimativamente cilindrica con diametro di 5 micron ~ esterno. Inoltre, la sezione trasversale immagine nel piano xz (inserto nella Figura 3 pannello superiore) mostra chiaramente i confini della vite e il tubo interno faringeo (indicato dalle frecce), dimostrando successo immagini 3D della faringe.
La figura 2 mostra il super-pixel risolti ologrammi (pannello di sinistra) e le immagini di proiezione digitale ricostruito (pannello destro) per un C. elegans worm (ritagliata da un grande campo di vista) a tre diversi angoli di illuminazione. Ogni immagine di proiezione contiene informazioni riguardanti un diverso angolo visuale, che permette il calcolo della struttura 3D attraverso una retro-proiezione filtrata funzionamento.
La Figura 3 mostra tomogrammi calcolati per la C. elegans verme of Figura 2. (Riga in alto) mostra una immagine fetta del worm intero z = 3 micron. L'inserto mostra una sezione immagine dalla parte anteriore della vite senza fine. Barra di scala del riquadro è di 50 micron. (Riga in basso) mostra tre immagini di fetta attraverso la parte anteriore del verme, dimostrando la capacità di sezionamento ottico lensfree tomografia ottica. Frecce tutta la figura indicano lo stesso punto sul tubo faringeo del worm. Un'immagine microscopio (x40, 0,65-NA) è anche fornita per confronto visivo.
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Discussion
È importante sottolineare che la geometria unica di lensfree on-chip microscopia olografico l'attivatore è critica per ottenere pixel super-risoluzione e di imaging tomografico. Poiché le immagini registrate non vengono considerati come immagini di proiezione di immagini in contatto incoerente avvicina 12, ma ologrammi di proiezione, la diffrazione della luce trasmessa fino colpisca il rivelatore può essere corretto digitalmente da ricostruzione olografica. Pertanto, le variazioni nel campione a sensore di distanza può essere rappresentato. Inoltre, poiché il campione a sensore di distanza è tipicamente ~~~V 0,5-5 mm, mentre la sorgente luminosa è posto a ~ 4-10 cm di distanza dal campione, il raggiungimento di sub-pixel spostamenti non richiede grandi spostamenti di origine. Come risultato, spostando la sorgente luminosa solo 50-100 um è sufficiente per conseguire sub-pixel turni al piano del sensore, impedendo variazioni indesiderate i) prospettiva illuminazione direzione /, unnd ii) efficace campione a sensore di distanza ad ogni posizione della sorgente. Se non impedito, queste variazioni potrebbero causare aberrazioni significative nelle immagini pixel super-risolti. Pertanto, gli ologrammi registrati in ciascuna posizione della sorgente, ad un dato angolo, può effettivamente essere considerato versioni spostate sub-pixel della stessa immagine olografica. Inoltre, la progettazione allineamento quasi privo di tomografia lensfree ottico rende piuttosto semplice per registrare ologrammi proiezione ad angoli differenti, semplicemente ruotando una sorgente di luce 7,9, o l'utilizzo di più sorgenti luminose, ad esempio LED) ad angoli differenti 8.
LOT è una tecnica emergente che offre un grande spazio-prodotto per la larghezza di banda on-chip di imaging di campioni. È importante sottolineare che si tratta di una tecnologia scalabile che si avvarrà delle matrici di prossima generazione di rivelatori. Cioè, come più veloce CMOS e insiemi di rivelatori CCD con pixel più dense saranno disponibili, lotto continuamente migliorare sia in termini di risoluzione, campo di vista e velocità. Questo è un vantaggio importante di lensfree on-chip microscopia in microscopia ottica convenzionale, in cui si determina prestazioni di imaging da parte di più sotto-sistemi, impedendo la scalata diretta della qualità delle immagini con i progressi nelle tecnologie digitali.
In sintesi, consentendo ad alta produttività microscopia 3D di campioni in un grande volume di imaging, in un'architettura compatta, tomografia lensfree ottico può essere una serie di strumenti utili per lab-on-a-chip.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
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