Summary
Lensfree 광학 tomography은 <1 μm의의 공간적 해상도를 제공하는 입체 현미경 기법이다 × <1 μm의 × 15~1백밀리미터의 큰 이미지 볼륨여 각각 X, Y 및 Z 크기에서 <3 μm의,
Abstract
그것이 서로 다른 크기의 비늘의 객체에 관한 입체 (3D) 구조적인 정보를 제공할 수있는 단층 영상 의학에서 널리 사용되는 도구가되었습니다. 마이크로 미터와 mm 스케일에서 광학 현미경 modalities는 가시 광선의 비 이온화 특성으로 증가 사용 인하여 찾고, 풍부한 조명 소스의 집합 (예 : 레이저와 발광 - 다이오드 등) 및 감지 요소 (예 :의 가용성 대형 CCD 및 CMOS 검출기 - 배열). 최근에 개발된 광학 단층 현미경 modalities 가운데 하나는 광학 일관성의 tomography, 광학 회절 tomography, 광학 프로젝션 tomography와 가벼운 시트 현미경을 포함할 수 있습니다. 1-6 이러한 플랫폼은 세포, 미생물 등 C. 등의 모델 동물의 단면 영상을 제공 elegans, zebrafish 및 마우스 배아.
기존 3D 광학 imagers는 일반적으로 일을 제한, 상대적으로 부피가 복잡한 아키텍처를전자는 첨단 실험실 이러한 장비의 가용성 및 실험실 - 온 - 칩 플랫폼과 microfluidic 칩을와의 통합을 방해한. 대안 단층 현미경을 제공하기 위해, 우리는 최근 일곱 많이 버리고 렌즈와 부피가 큰 광학 부품의 사용. 높은 처리량, 컴팩트하고 비용 효율적인 광학 tomography의 양상으로 lensfree 광학 tomography (LOT)를 개발하고, 대신 멀티 각도에 의존 조명과 대형 이미징 볼륨을 통해 마이크로 객체의 깊이 - 해결 이미징을 달성하기위한 디지털 계산. 많은에 대한 X <1 μm의 X <3 15~100mm 3 대형 이미징 볼륨여 각각 X, Y 및 Z 크기의 μm의,,, 그리고 될 수 있습니다 특히 유용 <1 μm의의 공간적 해상도로 이미지를 생물 학적 시료 수 실험실 - 온 - 칩 플랫폼.
Protocol
1. 이미징 설정
많은 콤팩트하고 경량 필드 휴대용 아키텍처 8 조립 수 있으며, 또는 단면 이미징 능력 optofluidic 현미경으로 9.이 보고서에서, 그러나, 우리는 정적의 tomography 향해 벤치 상위 구현에 대한 기본 이미지 설정을 설명합니다 샘플.
- 조명 모듈 : 많은 경우에 이러한 발광 다이오드 - (LED가)와 같은 일부 코히어런트 광원을 활용할 수 있습니다. 실험적인 유연성을 위해 지논 램프 (초석 T260, 뉴 포트 사)와 단색을 사용. 단색은 예를 들어, 450-650 nm의의 중심 파장 주위 ~ 1-10 nm의 스펙트럼 폭 출력을 제공하도록 조정되었습니다. 이것은 부분적으로 일관된 출력 후 시스템에 부분적으로 일관된 빛을 제공하는 다중 모드 광섬유 (Thorlabs AFS105/125Y)에 결합됩니다.
광학 섬유 (Thorlabs 전동식 회전 무대에 마운트되어PRM-1Z8은 조명의 각도를 변경) Thorlabs TDC001 컨트롤러에 의해 구동. 동력 무대는 광원 붙어있는, 주어진 각도로 광원의 인 - 비행기 교대를 달성하는 데 사용된 2 차원 선형 XY 스테이지 (뉴 포트 ILS50CC 뉴 포트 MFA-PPD 컨트롤러에 의해 구동)에 마운트됩니다. - 탐지 : Lensfree 광학 tomography는 검출기 배열이 상당히 이미지 수집 단계 또는 데이터 처리를 변경하지 않고 응용 프로그램의 요구 사항에 따라 선택할 수있는 그러한 확장 기술입니다. 이 보고서에서는 2.2 μm의의 픽셀 크기 (IDS 이미징, UI-1485LE-M)로, 5 메가 픽셀을 갖는 CMOS 센서 배열을 채용. 검출기는 검출기의 활성 영역의 상단에 직접 배치되었다 샘플 와이드 뷰 필드 (예 : 24mm 2) 홀로그램 영상을 기록하는 데 사용됩니다. 이중 축 tomography 설정이 구현되어 7면 감지기가되어야합니다LSO는 광학 축에 대한 일반 비행기에서 샘플을 (함께 탐지기로) 회전 수평 (광학 테이블과 관련한) 회전 무대 (예 : Thorlabs RP-01)에 장착됩니다. 7
2. 샘플 준비
lensfree 광학 tomography 이미지 등 세포 및 미생물과 같은 개체의 다양한 수 있지만, 우리는 C의 입체 현미경을 수행하여 기본 원칙을 보여주는 것입니다 elegans 샘플.
- 메스 또는 주걱 사용하여 C를 포함하는 배양 접시로부터 한천의 작은 조각을 elegans 문화. 각 차원을 따라 몇 mm의 큐빅 조각 nematodes 수백 포함됩니다.
- 한 ML 드 이온화 (DI) 물을 포함하는 폴리 프로필렌의 유리병에 한천의 작은 청크를 놓습니다.
- 0.5-1 분, 그리고 벌레는 DI 물에 한천 조각 기어 나와서 때까지 10-15 분 기다려야 위해 부드럽게 소용돌이.
- ... 할 목적으로일시적으로, 벌레를 고정 5-10 밀리미터 levamisole 솔루션 (시그마 - 올드 리치) 1 ML을 추가하고 10 분 기다립니다.
- 두건의 살인 사건이 은폐이 풀리지 사이 5-10 유리병의 바닥에서 샘플의 μl, 그리고 샌드위치를 피펫. 일시적으로 고정화 웜 (예 : 50-100 웜)의 다수가 포함된이 샘플은, 데이터 수집을 시작 검출기에 둘 수 있습니다.
3. 데이터 수집
여기서는 LabView 인터페이스를 개발한 사용자 정의를 사용하여 자동화되었습니다 전형 많이 실험에 대한 이미지 수집 단계를 요약합니다.
- 0 °는 광원의 수직 위치에 해당 -50 °로 회전 무대의 초기 각도를 조정합니다.
- (0,0)로 XY 스테이지의 초기 위치를 조정,이 홈 위치입니다.
- 최고의 이미지가 어떠한들없이 최대한 밝은 것이 자사의 다이나믹 레인지와 같은 활용하는 감지기의 노출 시간을 조절aturated 픽셀.
- 회전 무대의 각도를 변경하지 않고, 9 이미지를 캡처합니다. 각 이미지의 경우, 각 이미지가 이전에 비해 픽셀의 약 분기까지 바꿔 주던 그러한 3x3 사각형 격자의 새로운 위치로 XY 스테이지 이동합니다. 6μ6 그리드에 예를 들어, 각각의 각도에서 더 많은 이미지를 취득, 개체 및 신호 대 노이즈 비율 (SNR)의 종류에 따라 해상도를 향상시킬 수 있습니다. 10
- (0,0)로 XY 스테이지의 초기 위치를 조정,이 홈 위치입니다.
- 50 °에 도달하기 전까지는, 2 ° 단위로 회전 무대의 각도를 높이십시오. 각 증가 후, 각각의 새 각도, 3-5 단계를 반복에서 즉. 각도 단위는 획득 시간 대 이미징 해상도의 최적화에 따라 미세한 또는 coarser 될 수 있습니다.
- (이중 축 tomography 기법이 활용되는 경우 선택적 단계) 검출기가 90 °로 장착되는 수평 무대를 회전합니다. 그런 다음,1-6 단계를 반복합니다.
4. 데이터 분석
제 3 항, 조명의 51 각도의 각 9 서브 픽셀 이동 이미지가 포함되어 취득 459 이미지 세트에서 단계 1-6를 수행. 첫째, 9 이미지의 각 집합에 디지털 한 고해상도 (HR) 각도마다 프로젝션 홀로그램을 얻기 위해 픽셀 슈퍼 해상도 알고리즘 10, 사용, 처리됩니다. 이것은 화소 슈퍼 해상도 lensfree 이미지의 공간적 해상도에서 오히려 회절 한계보다 픽셀 크기의 한계를 극복이라는 점에 주목하여야한다. 픽셀 슈퍼 해결 홀로그램 그런 다음 디지털 51 프로젝션 이미지를 얻을 7-10 복원됩니다. 51 투영 화상의이 세트는 다음 TomoJ, 플러그인 ImageJ (오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어)에 대한. 11이 백 프로젝션 작업이 샘플의 3 차원 이미지 (tomograms)를 출력합니다.를 사용하여 백 예상된다 여기에 구현되지 않지만,참조에서 설명한대로 이중 축 tomography 기법도 활용 수 있습니다. 7. 이 제도에서는 tomograms의 두 번째 세트는 샘플에 대한 자세한 공간적 정보를 제공하며 축 해상도를 향상 최초의 회전 축에 관하여 직교 축을 따라 광원을 회전하여 얻어진다.
5. 대표 결과
lensfree 광학 tomography의 넓은 뷰 필드 (FOV)은 그림 1에서 증명된다. 시료가 검출기 - 배열의 맨에 직접 배치되면서 개체의 홀로그램 이미지가 더 큰 활성 영역과 신흥 검출기 배열을 사용하여 증가 수 24 FOV mm 2 이상 기록될 수 있습니다.
검출기 - 배열의 픽셀 크기가 기록된 홀로그램 이미지의 해상도를 제한하지만, 화소 수퍼 해상도 기술이 문제를 완화. 그림 2는 함께 화소 슈퍼 해결 홀로그램을 보여줍니다와 조명의 세 가지 다른 각도, 하위 마이크로 미터 공간적 해상도를 제공하는 복원 이미지 (즉, 프로젝션 이미지).
프로젝션 이미지는 시편의 tomograms (즉, 입체 영상)을 계산하는 (예 : 여과 백 프로젝션) 단층 영상 재구성 기법을 사용하여 조합하여 사용할 수 있습니다. 그림 3은 웜의 앞부분을 통해 XY 평면에 세 슬라이스 이미지를 보여줍니다, 어디에 pharyngeal 튜브는 등 ~ 5 μm의 외경이 약 원통형 구조에서 예상 Z = 8 μm의를 통해 슬라이스에서 볼 수 있습니다. 또한, xz 평면에서 교차 단면 이미지 (그림 3 상단 패널에 삽입된 페이지) 명확 웜 경계와 인두의 성공적인 3D 영상을 보여주 pharyngeal 튜브 내부를 (화살표가 가리키는) 보여줍니다.
그림 2는 슈퍼 해결 홀로그램 (왼쪽 패널)와 디지털 복원 프로젝션 이미지 (오른쪽 패널) C.위한 픽셀을 보여줍니다 세 가지 조명 각도에서 elegans 벌레 (대형 뷰 필드에서 잘립니다.) 각각의 투영 이미지는 필터링된 백 프로젝션 작업을 통해 3 차원 구조의 계산을 가능하게 다른 시야각을에 관한 정보가 포함되어 있습니다.
그림 3은 C.에 대한 계산된 tomograms을 보여줍니다 elegans 벌레 OF 그림 2. (끝줄)는 Z = 3 μm의에서 전체 웜 슬라이스 이미지를 보여줍니다. 삽입된 페이지는 벌레의 앞부분에서 교차 단면 이미지를 보여줍니다. 삽입된 페이지의 스케일 바는 50 μm의입니다. (하단 행)은 lensfree 광학 tomography의 광학 sectioning 능력을 보여주 웜의 앞부분을 통해 세 슬라이스 이미지를 표시합니다. 그림 전체에 화살표가 웜의 pharyngeal 튜브에 동일한 지점을 나타냅니다. 현미경 이미지 (x40, 0.65-NA)도 시각적으로 비교 제공됩니다.
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Discussion
그것은 lensfree 온칩 홀로그램 현미경의 독특한 기하학 픽셀 슈퍼 해상도와 단층 이미지를 달성하기위한 중요한 원동력임을 강조하는 것이 중요합니다. 녹화된 영상은 12에 도달 조리 연락처 이미징에서와 같이 프로젝션 이미지로 간주 아니지만 프로젝션 홀로그램, 전송 빛의 회절은 검출기에 impinges까지 디지털 홀로그램 재건축으로 해결할 수 있기 때문에. 따라서 샘플 - 투 - 센서 거리 차이가 차지했다 수 있습니다. 광원이 시료에서 ~ 4~10cm 거리에 배치되는 동안 또한, 샘플 - 투 - 센서 거리 때문에 일반적으로 큰 소스 교대를 요구하지 않는 서브 픽셀 변화를 달성, 0.5-5 밀리 낙제야있다. 결과적으로, 오직 50-100 μm의에 의해 광원을 이동하면 하위 픽셀 전에서 원치 않는 변형을 방지 탐지 비행기에서 교대) 조명 방향 / 관점을 달성하기 충분하다각 원본 위치에서 ND II) 효과적인 샘플 - 투 - 센서 거리. 예방하지 않으면 다음 유사 화소 슈퍼 해결된 이미지 크게 aberrations가 발생할 수 있습니다. 따라서 주어진 각도에서 각 원본 위치에 기록된 홀로그램은 실제로 같은 홀로그램 이미지의 서브 픽셀 이동 버전으로 간주 할 수 있습니다. 또한, lensfree 광학 장치 tomography의 거의 정렬이없는 디자인은 단순히 광원에게 7,9를 회전, 또는 8 개의 다른 각도에서 여러 개의 광원 (예 : 발광 다이오드 (LED)와 같은)를 사용하여 서로 다른 각도에서 프로젝션 홀로그램을 기록하는 것이 비교적 간단합니다.
많은 샘플 온칩 이미징을위한 넓은 공간 대역폭 제품을 제공하는 신흥 기술입니다. 중요한 것은 크게 차세대 검출기 어레이로부터 혜택을 확장 기술입니다. 빠른 CMOS와 고밀도 화소로 CCD 검출기 어레이 출시되면 그것이며, 많은 conti됩니다nuously 해상도, 뷰 필드과 속도 면에서 모두 향상시킵니다. 이것은 이미징 성능이 디지털 기술의 발전과 이미지 품질을 직접 배율을 방해한, 서브 시스템 다중에 의해 결정되는 기존의 조명 현미경, 현미경 이상의 온 - 칩 lensfree의 중요한 장점이다.
요약에서는 소형 아키텍처에 큰 이미징 볼륨을 통해 표본의 높은 처리량 3D 현미경을 사용, lensfree 광학 tomography는 실험실 - 온 - 칩 시스템을위한 유용한 툴들이 될 수 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
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