Summary
Lensfree оптической томографии является трехмерной микроскопии, которая предлагает пространственное разрешение <1 мкм х <1 мкм × <3 мкм х, у, г размеры, соответственно, на больших изображений, объемом 15-100 мм
Abstract
Томографических изображений была широко используемым инструментом в медицине, как он может предоставить трехмерные (3D) структурную информацию об объектах различного масштаба размера. В микрометра и миллиметрового масштаба, оптической микроскопии условиях найти более широкое использование в связи с неионизирующей природы видимого света, а также наличие широкого набора источников подсветки (например, лазеров и светоизлучающих диодов) и обнаружения элементов (таких как большого формата ПЗС-и КМОП-датчик-массивов). Среди недавно разработанных оптической микроскопии условия томограф, можно включить оптической когерентной томографии, оптической томографии дифракции оптической томографии проекции и светло-лист микроскопии. 1-6 Эти платформы предоставляют секционные изображения клеток, микроорганизмов и моделей животных, таких как С. Элеганс, данио и эмбрионов мыши.
Существующие 3D оптических тепловизоры как правило, имеют относительно большой и сложной архитектуры, ограничивая йэлектронной наличие этого оборудования в современных лабораторий, а также препятствует их интеграции в лаборатории-на-чипе платформ и микрожидкостных чипов. Для обеспечения альтернативных микроскоп томографических, недавно мы разработали lensfree оптической томографии (LOT), а высокая пропускная способность, компактный и экономически эффективным оптическим методом томографии. 7 LOT отбрасывает использование линз и громоздкие оптические компоненты, а вместо этого полагается на мульти-угол освещения и цифровых вычислений для достижения глубины разрешением изображения микрообъектов на большой объем изображений. Многое можно изображения биологических образцов с пространственным разрешением от <1 мкм х <1 мкм х <3 мкм х, у, г размеры, соответственно, на большой объем изображений 15-100 мм 3, и может быть особенно полезно для лаборатории-на-чипе платформ.
Protocol
1. Настройки изображения
LOT могут быть собраны в компактный и легкий полевой портативный архитектура 8, а наоборот, как optofluidic микроскопа с секционными способность изображения. 9 В этом докладе, однако, мы опишем основные настройки изображения для настольного реализации на томографию статического образцов.
- Модуль подсветки: в LOT, частично когерентных источников света, например светоизлучающих диодов (LED) могут быть использованы. Для экспериментальной гибкости, мы использовали монохроматор с ксеноновой лампой (Cornerstone T260, Ньюпорт Corp.) Монохроматора была скорректирована обеспечить выход с ~ 1-10 нм ширина спектра вокруг центральной длиной волны 450-650 нм, например. Это частично когерентного выхода, то связаны с многомодового оптического волокна (Thorlabs AFS105/125Y) для доставки частично когерентного света в системе.
Оптического волокна установлен на моторном вращения этапе (ThorlabsPRM-1Z8 обусловлен Thorlabs TDC001 контроллер), чтобы изменить угол освещения. Моторизованных этапе, с источником света прилагается, устанавливается на двумерном линейном этапе XY (Newport ILS50CC обусловлен Ньюпорт МИД-PPD контроллеров), которая была использована для достижения в плоскости сдвига источника света под определенным углом. - Обнаружение: Lensfree оптической томографии является масштабируемой технологии, такие, что детекторов могут быть выбраны в соответствии с требованиями приложения, без существенного изменения образа приобретение шаги или обработки данных. В этом докладе мы использовали массив CMOS сенсор с 5 мегапикселей, с размером пикселя 2,2 мкм (IDS Imaging, UI-1485LE-M). Детектор используется для записи с широким полем зрения (например, 24 мм 2) голографические изображения образцов, которые были размещены прямо на верхней части активной области детектора. Если двухосевой томография установка будет осуществляться 7, детектор долженРБП быть установлен на горизонтальной (по отношению к оптической таблицу) вращение стадии (например, Thorlabs RP-01) для поворота образца (вместе с детектором) в плоскости, перпендикулярной к оптической оси 7.
2. Подготовка образцов
Хотя lensfree оптической томографии можно изображений различных объектов, таких как клетки и микроорганизмы, мы покажем основные принципы, выполняя трехмерной микроскопии C. Элеганс образца.
- С помощью скальпеля или шпателем, возьмите небольшой кусочек агара из чашки Петри содержащих C. Элеганс культуры. Кубический кусок в несколько миллиметров вдоль каждого измерения будут содержать сотни нематод.
- Поместите маленький кусочек агара в полипропиленовые флакон, содержащий 1 мл деионизированной (DI) воде.
- Осторожно вихрь 0,5-1 мин, и ждать в течение 10-15 мин, пока черви выползают из агар кусок в воду DI.
- Для того, чтобывременно блокировать червей, добавляют 1 мл 5-10 мМ раствор левамизола (Sigma-Aldrich) и подождите 10 мин.
- Пипетировать 5-10 мкл образцов со дна флакона, и бутерброд между двумя скользит крышкой. Этот образец, содержащий большое количество временно иммобилизованных червей (например, 50-100 черви), могут быть размещены на детектор, чтобы начать сбор данных.
3. Сбор данных
Здесь мы кратко получения изображений шаги для типичного эксперимента LOT, который был автоматизирован с помощью специально разработанных LabView интерфейс.
- Установите начальный угол поворота этапе до -50 °, 0 ° соответствует вертикальное положение источника света.
- Установите начальное положение этапе XY к (0,0), которая в исходное положение.
- Отрегулируйте время экспозиции детектора лучше всего использовать его динамический диапазон, что образ является так ярко, как можно без сaturated пикселей.
- Не меняя угол поворота этапе захвата 9 изображений. Для каждого изображения, перемещать сцену XY в новую позицию в 3x3 квадратную сетку так, что каждое изображение сдвигается примерно на четверть пикселя по сравнению с предыдущим. Приобретение более изображений на каждом углу, например, в 6μ6 сетке, может улучшить разрешение в зависимости от типа объекта и отношение сигнал-шум (SNR) 10.
- Установите начальное положение этапе XY к (0,0), которая в исходное положение.
- Увеличение угла вращения этапа с шагом 2 °, пока не достигнет +50 °. После каждого приращения, т.е. на каждый новый угол, повторите шаги 3-5. Угловой шагом может быть прекраснее и грубее, в зависимости от оптимизации времени приобретения против изображения разрешением.
- (Необязательный шаг, если двухосевой томография схемы, которые будут использоваться) Поверните горизонтальные сцена, на которой установлен датчик на 90 °. Тогда,повторите шаги 1-6.
4. Анализ данных
После шаги 1-6 в разделе 3, набор из 459 изображений, приобретенных, которое содержит 9 суб-пикселей сдвигается изображения для каждого из 51 различных углов освещения. Во-первых, каждый набор из 9 изображений цифровой обработки, используя супер-пикселей разрешение алгоритмы 10, чтобы получить один с высоким разрешением (HR) проекция голограммы на угол. Следует отметить, что супер-пикселей резолюции содержится ссылка на преодоление ограничений размера пикселя, чем дифракционный предел, с пространственным разрешением lensfree изображений. Pixel супер-голограммы решен, то цифровая реконструкция 7-10 получить 51 изображений проекции. Это набор из 51 изображений проекции обратно-прогнозам использованием TomoJ, плагин для ImageJ (с открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа изображений) 11. Этот назад проекции операция выводит трехмерное изображение (томограмм) образца. Хотя здесь не реализована,двухосевой томография схема также может быть использован, как описано в работе. 7. В этой схеме, второй набор томограмм получается вращением источника света вдоль ортогональной оси по отношению к первой оси вращения, что обеспечивает более пространственной информации в отношении образцов, а также улучшает осевое разрешение.
5. Представитель Результаты
Большое поле-обзора (FOV) в lensfree оптической томографии показано на рисунке 1. Как образец помещается непосредственно в верхней части массива детекторов, голографические изображения объектов могут быть записаны на FOV 24 мм 2, которая может быть увеличена с использованием новейших массивов детекторов с большим активных областей.
Хотя размер пикселя детектора массив ограничивает разрешение записанного голографические изображения, пиксель супер методы разрешения смягчить эту проблему. На рисунке 2 показан пикселей супер-голограммы решили вместес восстановленных изображений (например, изображение проекции), которые предлагают суб-микронных пространственное разрешение, для трех различных углов освещения.
Проекция изображения могут быть объединены с помощью томографических методов реконструкции изображения (например, фильтруются назад проекции) для вычисления томограммы (например, трехмерные изображения) образца. На рисунке 3 показаны три кусочек изображения на плоскости ху через переднюю этого червя, где глоточной трубки видна только в срезе через г = 8 мкм, как и ожидалось от этого примерно цилиндрические структуры с ~ 5 мкм наружного диаметра. Кроме того, в поперечном сечении изображения в плоскости XZ (вставка на рисунке 3 вверху) ясно показывает границы червя и глоточной трубки внутри (указано стрелкой), демонстрируя успешное 3D визуализации глотки.
На рисунке 2 показан пикселей супер-голограммы решен (слева) и цифровой проекции изображения реконструированных (справа) на C. Элеганс червя (обрезаны от большого поля-обзора) в трех различных углов освещения. Каждая проекция изображения содержит информацию о различных углов обзора, что позволяет вычисления 3D-структуры через фильтрованную назад проекции операции.
На рисунке 3 показана компьютерная томограммы C. Элеганс червь ое на рисунке 2. (Верхний ряд) показывает кусочек изображения всего червя при г = 3 мкм. На вставке показаны сечения изображение с передней червя. Шкала бар вставке 50 мкм. (Нижняя строка) Показывает три изображения среза передних этого червя, демонстрируя оптических срезов способность lensfree оптической томографии. Стрелки всей фигуры показывают ту же точку на глоточной трубки червя. Микроскопе изображение (x40, 0,65-НС) также предоставляется для визуального сравнения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важно подчеркнуть, что уникальная геометрия lensfree на чипе голографической микроскопии важнейшего средства обеспечения возможностей для достижения пикселей супер-разрешением и томографических изображений. С записанного изображения не считать проекцию изображения, как в некогерентных изображений контакта приближается к 12, а проекция голограммы, дифракция проходящем свете, пока не попадает на детектор может быть исправлена путем цифровой голографической реконструкции. Таким образом, изменения в образце к датчик расстояния могут быть учтены. Кроме того, поскольку образец до датчика расстояния, как правило, ~~~V 0,5-5 мм, а источник света находится на ~ 4-10 см от образца, достижения субпиксельной сдвиги не требует больших сдвигов источник. В результате, двигаясь к источнику света только на 50-100 мкм достаточно для достижения субпиксельной сдвиги в плоскости детектора, предотвращение нежелательных изменений я) освещение направлении / точки зрения,й II) эффективный образец до датчика расстояния, на каждый источник положение. Если не предотвратить, эти изменения могут привести к значительным аберраций в пиксель супер разрешением изображения. Таким образом, голограмм, записанных на каждый источник положении, под определенным углом, можно действительно рассматривать как суб-пикселей сдвигается версии одного голографического изображения. Кроме того, почти без согласования дизайна томография lensfree оптических делает его довольно проста для записи голограмм проекции под разными углами, просто вращая источник света 7,9, или с использованием нескольких источников света (например, светодиоды) под разными углами 8.
LOT является новым метод, который предлагает большое пространство пропускную способность продукта для встроенного изображения образцов. Важно отметить, что это масштабируемая технология, которая принесет большую пользу из следующих массивов детекторов поколения. То есть, как быстрее CMOS и CCD-датчик с массивами плотнее пиксели становятся доступными, многое будет континентахnuously улучшения как в соответствии с резолюцией, поля-обзора и скорости. Это является важным преимуществом lensfree на чипе микроскопии по сравнению с обычными световой микроскопии, где изображение производительность определяется несколькими подсистемами, препятствующие прямой масштабировании качество изображения с достижениями в области цифровых технологий.
В целом, обеспечивая высокую пропускную способность 3D микроскопии образцов на большой объем изображений, в компактной архитектуры, lensfree оптической томографии может быть полезным инструментов для лабораторий-на-чипе системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
- Schmitt, J. M. Optical coherence tomography (OCT): a review, J. Sel. Top. Quant. Elect. 5, 1205-1215 (1999).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sørensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sung, Y., Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Dasari, R. R., Feld, M. S. Optical diffraction tomography for high resolution live cell imaging. Opt. Exp. 17, 266-277 (2009).
- Debailleul, M., Simon, B., Georges, V., Haeberle, O., Lauer, V. Holographic microscopy and diffractive microtomography of transparent samples. Meas. Sci. Technol. 19, 074009 (2008).
- Charrière, F., Pavillon, N., Colomb, T., Depeursinge, C., Heger, T. J., Mitchell, E. A. D., Marquet, P., Rappaz, B. Living specimen tomography by digital holographic microscopy: Morphometry of testate amoeba. Opt. Exp. 14, 7005-7013 (2006).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Mavandadi, S., Yu, S. W., Feng, S., Lau, R., Ozcan, A. Lens-free optical tomographic microscope with a large imaging volume on a chip. Proc. Nat. Acad. Sci. 108, 7296-7301 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Sikora, U., Yaglidere, O., Yeah, J., Ozcan, A. Field-portable Lensfree Tomographic Microscope. Lab Chip. 11, 2222-2230 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Zhu, H., Ozcan, A. Optofluidic tomography on a chip. App. Phys. Lett. 98, 161109 (2011).
- Bishara, W., Su, T. W., Coskun, A., Ozcan, A. Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution. Opt. Exp. 18, 11181-11191 (2010).
- Messaoudi, C., Boudier, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Heng, X., Erickson, D., Baugh, L. R., Yaqoob, Z., Sternberg, P. W., Psaltis, D., Yang, C. Optofluidic Microscopy: A Method for Implementing High Resolution Optical Microscope On A Chip. Lab on a Chip. 6, 1274-1276 (2006).
