Summary
Lensfree optisk tomografi är en tre-dimensionell mikroskopi teknik som erbjuder en rumslig upplösning på mindre än 1 m × <1 mikrometer × <3 im i x-, y-och z-mått, respektive, över ett stort imaging-volym 15-100 mm
Abstract
Tomografiska avbildning har varit ett vanligt verktyg inom medicinen som den kan ge tredimensionella (3D) strukturell information om objekt av olika storlek skalor. I mikrometer och millimeter skala, optisk mikroskopi formerna finner ökande användning på grund av den icke-joniserande natur synligt ljus, och tillgången till en rik uppsättning av belysning källor (såsom lasrar och lysdioder-dioder) och element detektion (t.ex. stora format CCD och CMOS-detektor-arrays). Bland de nyligen utvecklade optiska tomografiska mikroskopi modaliteter, kan man innefatta optisk koherens tomografi, optisk diffraktion tomografi, optisk projektion tomografi och ljus-arks-mikroskopi. 1-6 Dessa plattformar ger genomskärning avbildning av celler, mikroorganismer och djur modell som C. elegans, zebrafisk och embryon mus.
Befintliga 3D optiska kameror har i allmänhet relativt skrymmande och komplex arkitektur, vilket begränsar the tillgängligheten av dessa utrustningar till avancerade laboratorier, och hindrar deras integrering med lab-on-a-chip plattformar och mikroflödessystem chips. För att ge ett alternativ tomografiska mikroskop, utvecklade vi nyligen lensfree optisk tomografi (LOT) som en hög genomströmning, kompakt och kostnadseffektiv optisk tomografi modalitet. 7 LOT utkast användning av linser och skrymmande optiska komponenter, och i stället förlitar sig på multi-vinkel belysning och digital beräkning för att uppnå djup-löst avbildning av mikro-objekt över en stor avbildning volym. Mycket kan bilden biologiskt prov vid en spatial upplösning på <1 ^ m x <1 ^ m x <3 ^ m i x-, y-och z-dimension, respektive, över ett stort avbildningsvolymen av 15-100 mm 3 och kan vara särskilt användbara för lab-on-a-chip plattformar.
Protocol
1. Imaging Setup
LOT kan monteras i en kompakt och lätt fältet bärbar arkitektur 8 och alternativt som en optofluidic mikroskop med sektionerad avbildning förmåga. 9 I denna rapport kommer vi emellertid att beskriva Basic Imaging konfiguration för en bänkbaserade genomförandet mot tomografi av statisk prover.
- Belysning Modul: I LOT, kan delvis koherenta ljuskällor såsom Ijusemitterande-dioder (LED) användas. För experimentella flexibilitet, använde vi en monokromator med en xenon-lampa (Grundpelare T260, Newport Corp.) Monokromatom justerades för att tillhandahålla en utgång med ~ 1-10 nm spektralbredd runt en central våglängd på t ex 450-650 nm. Denna partiellt koherent utsignal kopplas sedan till en optisk multimodfiber (Thorlabs AFS105/125Y) för att leverera partiellt koherent ljus till systemet.
Den optiska fibern är monterade på en motordriven rotation steg (ThorlabsPRM-1Z8 drivs av Thorlabs TDC001 controller) för att ändra vinkeln på belysningen. Den motoriserade steget med ljuskällan fäst, är monterad på en tvådimensionell linjär XY-planet (Newport ILS50CC driven av Newport UD-PPD-styrenheter), som användes för att uppnå i planet skift av ljuskällan vid en given vinkel. - Detektion: Lensfree optisk tomografi är en skalbar teknik så att detektorgruppen kan väljas i enlighet med kraven i ansökningarna utan att väsentligt ändra stegen bildupptagning eller databehandling. I denna rapport använde vi en CMOS-sensor array med 5 megapixel, med en pixelstorlek på 2,2 pm (IDS Imaging, UI-1485LE-M). Detektorn används för att registrera de breda aktuella synfältet vy (t.ex. 24 mm 2) holografiska bilder av prover, som placerades direkt på toppen av det aktiva området hos detektorn. Om en dubbel-axel tomografi installation skall genomföras 7, detektorn bör enLSO monteras på en horisontell (med avseende på den optiska tabellen) rotation steget (t.ex. Thorlabs RP-01) för att rotera provet (tillsammans med detektorn) i planet vinkelrätt mot den optiska axeln. 7
2. Provberedning
Medan lensfree optisk tomografi kan bilden en mängd olika föremål såsom celler och mikroorganismer, kommer vi att åskådliggöra de grundläggande principerna genom att utföra tredimensionella mikroskopi av ett C. elegans prov.
- Användning av en skalpell eller en spatel, ta en liten bit agar från petriskålen innehållande C. elegans kultur. En kubisk bit flera millimeter längs varje dimension kommer att innehålla hundratals nematoder.
- Placera liten bit agar i en polypropylenampull innehållande 1 ml avjoniserat (DI) vatten.
- Vortexa försiktigt under 0,5-1 minuter och vänta 10-15 min tills maskarna krypa ut ur agar stycket i DI-vatten.
- För atttemporärt immobilisera maskar, tillsätt 1 ml av 5-10 mM levamisol (Sigma-Aldrich) och vänta 10 minuter.
- Pipettera 5-10 ul av provet från botten av flaskan och smörgås mellan två täckglas. Detta prov, som innehåller ett stort antal tillfälligt immobiliserade maskar (t.ex. 50-100 maskar), kan placeras på detektorn för att starta förvärvet.
3. Data Acquisition
Här sammanfattar vi de steg bildupptagning för en typisk LOT experiment, som automatiserades med hjälp av en anpassad utvecklad LabView gränssnitt.
- Justera den inledande vinkeln hos rotationen steget till -50 °, där 0 ° motsvarar det vertikala läget av ljuskällan.
- Justera den inledande positionen av XY-planet för att (0,0), som är utgångsläget.
- Justera exponeringstid av detektorn att bäst utnyttja den dynamiska omfång så att bilden är så ljust som möjligt utan saturated bildpunkter.
- Utan att ändra vinkeln på rotationen scenen, ta 9 bilder. För varje bild, flytta XY scenen till en ny position i en 3x3 kvadrat galler så att varje bild skiftar med cirka en fjärdedel av en pixel jämfört med den tidigare. Förvärva fler bilder vid varje vinkel, t.ex. i en 6μ6 rutnät, kan förbättra upplösningen beroende på vilken typ av objektet och signal-brus-förhållande (SNR). 10
- Justera den inledande positionen av XY-planet för att (0,0), som är utgångsläget.
- Öka vinkeln för vridning steget i steg om 2 °, tills den når 50 °. Efter varje steg, dvs vid varje ny vinkel, upprepa steg 3-5. De kantiga steg kan vara finare eller grövre beroende på optimering av förvärvet tiden mot avbildning upplösning.
- (Valfritt steg om en dubbel-axel tomografi systemet ska användas) Vrid det horisontella scen på vilken detektorn är monterad med 90 °. Därefter,Upprepa steg 1-6.
4. Dataanalys
Efter steg 1-6 i 3 §, en uppsättning av 459 bilder förvärvas, som innehåller 9 sub-pixlar skiftade bilder för varje av de 51 olika infalls. Först varje uppsättning av 9 bilder digitalt bearbetade, med hjälp av pixel super-upplösning algoritmer 10, för att erhålla en hög upplösning (HR) projektion hologram per vinkel. Det bör noteras att pixel super-upplösning avser att övervinna begränsningar i pixelstorlek, snarare än diffraktionsgränsen, på den rumsliga upplösningen av lensfree bilder. Pixel super-lösas hologram sedan digitalt rekonstrueras 7-10 för att få 51 projektion bilder. Denna uppsättning av 51 projektion bilder är så back-projiceras med hjälp TomoJ, en plug-in för ImageJ (en open source mjukvara för bildanalys) 11. Denna back-projektion drift avger en tredimensionell bild (tomogram) av provet. Även om det inte genomförts här,en tvåaxlig tomografi systemet kan också användas såsom beskrivs i ref. 7. I detta schema är en andra uppsättning av tomogram som erhållits genom att rotera ljuskällan utmed en ortogonal axel med avseende på den första rotationsaxeln, som innehåller mer rumslig information om provet, och förbättrar axiell upplösning.
5. Representativa resultat
Den stora fält-of-view (FOV) i lensfree optisk tomografi visas i figur 1. När provet placeras direkt på toppen av detektor-grupp, kan holografiska bilder av de föremål registreras över en FOV på 24 mm 2, som kan ökas ytterligare med användning av nya detektorsystem med större aktiva områden.
Även pixelstorlek av detektorn-array begränsar upplösningen på de inspelade holografiska bilder, pixel super-upplösning tekniker mildra detta problem. Figur 2 visar pixel super-beslutade hologram samtmed de rekonstruerade bilderna (dvs. projektionsbilder) som erbjuder submikrometerstorlek rymdupplösning, för tre olika infalls.
Utsprånget bilder kan kombineras med användning av tekniker tomografiska bildrekonstruktion (t.ex. filtreras tillbaka-projektion) för att beräkna tomogram (dvs. tredimensionella bilder) av provet. Figur 3 visar tre skiktbilder i XY-planet genom den främre delen av masken, där svalget röret syns bara i den del till Z = 8 m, som förväntas från denna ungefär cylindrisk struktur med ca 5 m ytterdiameter. Dessutom visar tvärsnitt bilden i XZ-planet (infälld i figur 3 övre panelen) klart och tydligt gränserna för masken och svalg röret insidan (påpekat av pilarna), visar lyckade 3D-avbildning av svalget.
Figur 2 visar den pixel super-resolved hologram (vänstra panelen) och de digitalt rekonstruerade bilder utsprånget (höger fält) för en C. elegans mask (beskuren från ett stort fält-of-view) på tre olika belysning vinklar. Varje projicerade bilden innehåller information om en annan betraktningsvinkel, vilket möjliggör beräkning av 3D-strukturen genom en filtrerad back-projektion operation.
Figur 3 visar beräknade tomogram för C. elegans mask of Figur 2. (Övre raden) visar en skiktbild av hela masken vid z = 3 | im. Insatsen visar en tvärsnittsvy bild från den främre delen av masken. Skalstrecket i den infällda bilden är 50 pm. (Nedersta raden) visar tre skiktbilder genom främre delen av masken, vilket visar den optiska sektionering förmåga lensfree optisk tomografi. Pilar i hela figuren anger samma punkt på svalget röret av masken. Ett mikroskop bild (x40, 0,65-NA) är också för visuell jämförelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är viktigt att betona att den unika geometri lensfree on-chip holografisk mikroskopi är den kritiska möjliggörare för att nå pixel super-upplösning och tomografisk avbildning. Eftersom inspelade bilderna inte antas vara projektion bilder som i osammanhängande kontakt avbildning närmar 12, men projektion hologram, den diffraktion av ljus tills det träffar detektorn kan digitalt korrigeras genom holografisk rekonstruktion. Därför kan variationer i prov-till-sensor-avstånd redovisas. Dessutom eftersom det prov-till-sensor avståndet normalt på ~ 0,5-5 mm, medan ljuskällan är placerad vid ~ 4-10 cm avstånd från provet, uppnå sub-pixel skift inte kräver stora källa skift. Som ett resultat, rör sig ljuskällan endast genom 50-100 pm är tillräcklig för att uppnå delbildelementdata skift vid detektorplanet, som förhindrar oönskade variationer i i) belysning riktning / perspektiv ennd ii) effektiv prov-till-sensor avstånd varje källa position. Om inte förhindras, kan dessa variationer leda till betydande avvikelser i de pixel super-lösta bilder. Därför kan hologrammen registreras vid varje källa positionen, vid en given vinkel, som faktiskt anses vara sub-pixel skiftade versioner av samma holografiska bilden. Dessutom gör den nästan inriktningen utan design av lensfree optisk tomografi det ganska enkelt att spela in projektion hologram i olika vinklar, helt enkelt genom att vrida en ljuskälla 7,9, eller använder flera ljuskällor (t.ex. LED) i olika vinklar 8.
Lot är en ny teknik som erbjuder ett stort utrymme, bandbredd produkt för on-chip avbildning av prover. Det är viktigt, det är en skalbar teknik som i hög grad kommer att gynnas av nästa matriserna generations detektor. Det är, som snabbare CMOS och CCD-arrayer detektor med tätare pixlar blir tillgängliga, kommer mycket att Continuerligt förbättra både vad gäller upplösning, fält-av-vy och hastighet. Detta är en viktig fördel med lensfree on-chip mikroskopi jämfört med konventionell ljusmikroskopi, där avbildning prestanda bestäms av flera delsystem, vilket hindrar direkta skalning av bildkvalitet med framstegen inom digital teknik.
Sammanfattningsvis, så hög kapacitet 3D mikroskopi av prover över ett stort avbildning volym, i en kompakt arkitektur kan lensfree optisk tomografi vara ett användbart uppsättning verktyg för lab-on-a-chip-system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
- Schmitt, J. M. Optical coherence tomography (OCT): a review, J. Sel. Top. Quant. Elect. 5, 1205-1215 (1999).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sørensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sung, Y., Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Dasari, R. R., Feld, M. S. Optical diffraction tomography for high resolution live cell imaging. Opt. Exp. 17, 266-277 (2009).
- Debailleul, M., Simon, B., Georges, V., Haeberle, O., Lauer, V. Holographic microscopy and diffractive microtomography of transparent samples. Meas. Sci. Technol. 19, 074009 (2008).
- Charrière, F., Pavillon, N., Colomb, T., Depeursinge, C., Heger, T. J., Mitchell, E. A. D., Marquet, P., Rappaz, B. Living specimen tomography by digital holographic microscopy: Morphometry of testate amoeba. Opt. Exp. 14, 7005-7013 (2006).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Mavandadi, S., Yu, S. W., Feng, S., Lau, R., Ozcan, A. Lens-free optical tomographic microscope with a large imaging volume on a chip. Proc. Nat. Acad. Sci. 108, 7296-7301 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Sikora, U., Yaglidere, O., Yeah, J., Ozcan, A. Field-portable Lensfree Tomographic Microscope. Lab Chip. 11, 2222-2230 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Zhu, H., Ozcan, A. Optofluidic tomography on a chip. App. Phys. Lett. 98, 161109 (2011).
- Bishara, W., Su, T. W., Coskun, A., Ozcan, A. Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution. Opt. Exp. 18, 11181-11191 (2010).
- Messaoudi, C., Boudier, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Heng, X., Erickson, D., Baugh, L. R., Yaqoob, Z., Sternberg, P. W., Psaltis, D., Yang, C. Optofluidic Microscopy: A Method for Implementing High Resolution Optical Microscope On A Chip. Lab on a Chip. 6, 1274-1276 (2006).
