Summary
Lensfree optik tomografi <1 um arasındaki konumsal bir çözünürlüğe sahip bir üç-boyutlu mikroskopi tekniktir x <1 um x 15-100 mm arasında geniş bir görüntüleme-hacmi içinde, sırasıyla, x, y ve z, boyutları, içinde <3 um,
Abstract
Farklı boyut ölçekleri nesneler ile ilgili üç boyutlu (3D) yapısal bilgi sağlamak gibi tomografik görüntüleme tıpta yaygın olarak kullanılan bir araç olmuştur. Mikrometre ve milimetrik ölçeklerde, optik mikroskopi yöntemleri görünür ışık iyonlaştırıcı olmayan doğaya artan kullanımı sayesinde bulmak ve zengin bir aydınlatma kaynaklarının seti (örneğin lazer ve ışık yayan diyotlar-gibi) ve tespit elemanları (örneğin kullanılabilirliğini geniş format CCD ve CMOS algılayıcı-dizileri). Yakın zamanda geliştirilen optik tomografik mikroskopi yöntemleri arasında, tek bir optik koherens tomografi, optik kırınım tomografi, optik projeksiyon tomografi ve ışık sayfalık mikroskobu içerebilir. 1-6 Bu platformlar hücreler, mikroorganizmalar ve C gibi model hayvan kesit görüntüleme sağlamak elegans, Zebra balığı ve fare embriyoları.
Mevcut 3D optik kameralar genellikle inci sınırlayıcı, nispeten hantal ve karmaşık mimarileri varE gelişmiş laboratuarları bu ekipman durumu ve laboratuvar-on-a-chip platformları ve mikroakışkan çipleri ile entegrasyonu engelleyen. Alternatif tomografik mikroskop sağlamak için, son 7 LOT atar lensler ve hantal optik bileşenlerin kullanımı. Yüksek verimlilik, kompakt ve uygun maliyetli optik tomografi yöntemi olarak lensfree optik tomografi (LOT) geliştirilmiş ve bunun yerine çok açılı güveniyor aydınlatma ve geniş bir görüntüleme hacmi üzerinde mikro-objelerin derinlik çözülmesi görüntü elde etmek için dijital hesaplama. LOT için x <1 mikron x <3 15-100 mm 3 geniş bir görüntüleme hacmi üzerinden sırasıyla x, y ve z boyutlarda um, olabilir ve özellikle faydalı <1 mikron mekansal çözünürlükte görüntü Biyolojik örnek olabilir lab-on-a-chip platformlar.
Protocol
1. Görüntüleme Kurulumu
LOT kompakt ve hafif bir alana taşınabilir mimari 8 monte edilebilir ve alternatif kesit görüntüleme yeteneği ile bir optofluidic mikroskop gibi. 9 Bu raporda, ancak, statik tomografi doğru bir tezgah üst uygulanması için temel görüntüleme kurulum açıklayacağız örnekleri.
- Aydınlatma modülü: LOT, bu gibi ışık yayan-diyotları (LEDler) olarak kısmen koherent ışık kaynakları kullanılabilir. Deneysel esneklik için bir Xenon lamba (Cornerstone T260, Newport Corp) ile bir monokromatör kullanılır. Monokromatör örneğin 450-650 nm bir dalga boyunda merkezi etrafında ~ 1-10 nm spektral genişliğe sahip bir çıkış sağlamak üzere ayarlandı. Bu kısmen koherent çıkış daha sonra, sistem kısmen uyumlu ışık sunmak için bir çoklu fiber optik (Thorlabs AFS105/125Y) bağlanmıştır.
Optik lif (a Thorlabs parçalarla üzerine monte edilmiştirPRM-1Z8 aydınlatma açısını değiştirmek için) Thorlabs TDC001 kontrolör tarafından tahrik. Motorlu aşaması, ışık kaynağı ile birlikte eklenmiş, belirli bir açıyla ışık kaynağının düzlem-kaymalar elde etmek için kullanılan iki boyutlu bir doğrusal XY aşama (Newport ILS50CC Newport MFA-PPD kontrolörleri ile tahrik) üzerine monte edilir. - Algılama: Lensfree optik tomografi dedektör dizi önemli ölçüde görüntü alma adımları veya veri işleme değiştirmeden uygulamaların gereksinimlerine göre seçilebilir bu tür ölçeklenebilir bir teknolojidir. Bu yazıda, 2.2 mikron piksel boyutunu (IDS Görüntüleme, UI-1485LE-M), 5 Mega piksel olan bir CMOS sensörü dizi istihdam. Dedektör aktif alanının doğrudan üstüne yerleştirildi örneklerinin geniş açılı alan görünümü (örneğin 24 mm 2) holografik görüntüleri kaydetmek için kullanılır. Bir çift eksenli tomografi kurulum uygulanmak üzere 7 ise, detektör gerektiğiLSO optik eksenine dik düzlemde örneği (araya dedektörü ile) döndürmek için bir yatay (optik tablosu ile ilgili) rotasyonu aşama (örn. Thorlabs RP-01) üzerine monte edilebilir. 7
2. Numune Hazırlama
Lensfree optik tomografi görüntü, hücre ve mikroorganizmalar gibi nesnelerin çeşitli olabilir ederken, bir C. üç boyutlu mikroskop yaparak temel ilkeleri gözler önüne serecektir elegans örneği.
- Bir neşter veya spatula kullanarak, C. içeren petri gelen agar küçük bir parça alır elegans kültürü. Her bir boyut boyunca birkaç milimetrelik bir kübik parçası nematodlar yüz ihtiva edecektir.
- 1 ml deiyonize (Dİ) su ihtiva eden bir şişe içinde polipropilen agar, küçük parça yerleştirin.
- 0.5-1 dakika ve solucanlar DI suya agar parçası çıktı taramamıza dek 10-15 dakika beklemek için yavaşça girdap.
- Içingeçici, solucanlar hareketsiz 5-10 mM levamizol (Sigma-Aldrich) 1 ml ekleyin ve 10 dakika bekleyin.
- Iki kapak fişleri arasında 5-10 şişe dibinden örnek ul ve sandviç Pipeti. Geçici immobilize kurtları (örneğin 50-100 solucanlar), çok sayıda içeren Bu örnek, verilerin alınması başlatmak için detektör üzerine yerleştirilebilir.
3. Veri Toplama
Burada, LabView arayüzü geliştirilmiş, özel bir otomatik olarak tipik bir LOT deney için görüntü alma adımları özetlemektedir.
- 0 ° ışık kaynağının dikey konumunu karşılık -50 ° için dönme aşamasının başlangıç açısını ayarlayın.
- (0,0) XY ilk pozisyonunu ayarlayın, hangi ANA konumdur.
- En iyi görüntü herhangi bir s olmadan mümkün olduğunca parlak olduğunu ve dinamik alanı gibi kullanmak için, dedektörün pozlama süresini ayarlayınaturated piksel.
- Dönme aşamasında açısını değiştirmeden, 9 görüntüler yakalayabilir. Her bir görüntü için, her resim bir önceki oranla bir pikselin yaklaşık dörtte bir oranında kaydırır böyle bir 3x3 kare tablo içinde yeni bir konuma XY taşıyın. Bir 6μ6 ızgara örneğin, her açıda daha görüntüleri alma, nesne ve sinyal-gürültü oranı (SNR) türüne bağlı olarak çözünürlüğünü arttırmak olabilir. 10
- (0,0) XY ilk pozisyonunu ayarlayın, hangi ANA konumdur.
- +50 ° ulaşıncaya kadar, 2 ° artışlarla dönme aşamasında açısını artırın. Her bir artım sonra, her yeni açısı, 3-5 adımları tekrarlayın az yani. Açısal artışlarla alma süresi vs görüntüleme çözünürlük optimizasyonu bağlı olarak ince ya da kalın olabilir.
- (A çift eksenli tomografi düzeni kullanılmak üzere ise isteğe bağlı adım) detektörü 90 ° monte edildiği yatay aşaması döndürür. Daha sonra,1-6 adımları tekrarlayın.
4. Veri Analizi
Bölüm 3, aydınlatma 51 farklı açılardan her biri için 9 alt-piksel kaydırılır görüntüleri içeren kazanılır 459 görüntü kümesi, içinde 1-6 adımları izleyerek. Birincisi, 9 görüntülerin her set dijital bir yüksek çözünürlüklü (İK) Her açı için projeksiyon hologram elde etmek için piksel çözünürlüklü süper algoritmaları 10, kullanarak işlenir. Bu piksel çözünürlükte süper-lensfree görüntülerin mekansal çözünürlüğüne, daha ziyade kırınımı sınırından daha, piksel boyutu sınırlama üstesinden ifade ettiği belirtilmelidir. Piksel süper giderilmiş hologramlar sonra 51 dijital projeksiyon görüntüleri elde etmek için 7-10 sökülmelidir. 51 projeksiyon görüntüleri Bu set daha sonra TomoJ, bir plug-in ImageJ (açık kaynak kodlu bir görüntü analiz yazılımı) için. 11 Bu arka projeksiyon çalışması örnek bir üç boyutlu görüntü (tomogram) çıktılar. Kullanılarak geri yansıtılır olduğunu Burada uygulanan olmasa da,Referans tarif edildiği gibi, bir çift eksenli tomografi düzeni de yararlanılabilir. 7. Bu düzende, tomogram bir ikinci dizi örnek ile ilgili daha fazla bilgi sağlar mekansal ve eksenel çözünürlüğünü arttırır birinci dönme ekseni, ile ilgili olarak ortogonal bir eksen üzerinde dönen bir ışık kaynağı ile elde edilir.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Lensfree optik tomografi geniş görüş alanı (FOV) Şekil 1'de gösterilmiştir. Örnek dedektör-dizi doğrudan üstüne konur, nesnelerin holografik görüntüleri daha büyük aktif alanlar ile ortaya çıkan algılayıcı dizileri kullanılarak artırılabilir bir 24 FOV mm 2, üzerinde kaydedilebilir.
Dedektör-dizinin piksel boyutu kaydedilen holografik görüntülerin çözünürlüğünü sınırlamasına rağmen, piksel süper-çözünürlük teknikleri bu sorunu hafifletmek. Şekil 2 boyunca piksel süper giderilmiş hologramlar gösteririle aydınlatma üç farklı açılar için, alt-mikrometre uzaysal çözünürlüğü ile rekonstrüksiyon görüntüleri (yani projeksiyon görüntüleri).
Projeksiyon görüntüleri numunenin tomogram (yani üç boyutlu görüntü) hesaplamak için (örneğin filtre arka projeksiyon) tomografik görüntü oluşturma teknikleri ile kombine edilebilir. Şekil 3 solucanın ön aracılığıyla xy düzleminde üç dilim görüntüleri gösterir, burada faringeal tüp sadece ~ 5 mm dış çaplı bu kabaca silindirik yapıdaki beklenen z = 8 mikron aracılığıyla dilim görünür. Ayrıca, xz düzleminde kesitsel görüntü (Şekil 3 üst panelinde inset) açıkça solucanın sınırları ve farenks başarılı 3D görüntüleme gösteren faringeal tüp içinde (oklarla gösterilen) gösterir.
Şekil 2 süper giderilmiş hologramlar (sol panel) ve dijital olarak yeniden projeksiyon görüntüleri (sağ panel) bir C için piksel gösterir üç farklı aydınlatma açılarda elegans solucan (geniş açılı alan görünümü kırpılmış). Her projeksiyon görüntü süzülmüş bir arka projeksiyon çalışması yoluyla 3D yapı hesaplama sağlayan farklı bir görüş açısı ile ilgili bilgileri içerir.
Şekil 3, C için hesaplanan tomogram gösterir elegans solucan of Şekil 2. (Üst sıra) z = 3 mikron altında olan tüm solucanın bir dilim görüntüsünü gösterir. Inset solucanın anterior bir kesitsel görüntüsünü gösterir. Inset Ölçeği bar 50 mikron olduğunu. (Alt satır) lensfree optik tomografi optik kesit alma yeteneğini gösteren, solucan ön üzerinden üç dilim görüntüleri gösterir. Rakam boyunca Oklar solucanın faringeal tüp üzerinde aynı noktaya işaret etmektedir. Bir mikroskop görüntünün (x40, 0.65-NA), aynı zamanda görsel karşılaştırma için verilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu lensfree on-chip holografik mikroskop eşsiz geometri piksel süper-çözünürlük ve tomografik görüntüleme sağlamak için kritik etkinleştiricidir olduğunu vurgulamak önemlidir. Kaydedilen görüntülerin 12 yaklaşımlar tutarsız temas görüntüleme gibi projeksiyon görüntüleri olarak kabul edilmez, ama projeksiyon hologramlar, iletilen ışık kırınım bu dedektör impinges kadar dijital holografik yeniden düzeltilebilir beri. Bu nedenle, örnek ile sensör mesafe varyasyonlar açıklanabilir. Işık kaynağı numuneden ~ 4-10 cm mesafe alınırken Ayrıca, numune ile sensör arasındaki mesafe bu yana genellikle büyük bir kaynak vardiya gerektirmez alt-piksel vardiya ulaşmada, 0.5-5 mm Resimler ~ edilir. Bunun sonucu olarak, sadece 50-100 um ile ışık kaynağı hareket alt-piksel i istenmeyen varyasyonlar önlenmesi detektörü düzlemde kaymalar,) aydınlatma yönü / perspektif bir sağlamak için yeterli olduğuHer kaynak konumunda nd ii) etkili bir örnek ile sensör arasındaki mesafe. Engel değilse, bu varyasyonlar piksel süper bağımlı görüntülerini önemli sapmaları neden olabilir. Bu nedenle, belirli bir açıda, her bir kaynak pozisyonu kaydedildi hologramlar, fiilen aynı holografik resmin alt-piksel kaydırılır versiyonları olarak kabul edilebilir. Ayrıca, lensfree optik tomografi neredeyse hizalama ücretsiz tasarım sadece bir ışık kaynağı 7,9 dönen veya 8 farklı açılarda çok ışık kaynağı (örneğin LED'ler gibi) kullanarak, farklı açılarda projeksiyon hologramlar kaydetmek için oldukça kolay hale getirir.
LOT örneklerinin çip üzerinde görüntüleme için büyük bir uzay-bant ürün sunan gelişmekte olan bir tekniktir. Önemlisi, büyük ölçüde yeni nesil algılayıcı dizileri yararlanacaktır ölçeklenebilir bir teknolojidir. Hızlı CMOS ve daha yoğun piksel CCD algılayıcı dizileri kullanılabilir hale Yani, LOT kıta olacaknuously çözünürlük, açılı alan görünümü ve hız açısından hem de geliştirmek. Bu görüntü performansı dijital teknolojinin de ilerlemesiyle birlikte görüntü kalitesini doğrudan ölçekleme engelleyen, alt sistemler birden tarafından belirlenir geleneksel ışık mikroskobu, üzerinde mikroskopi on-chip lensfree önemli bir avantajdır.
Özet olarak, kompakt bir mimaride büyük bir görüntüleme hacmi üzerinden örneklerin yüksek verimlilik 3D mikroskopi sağlayan lensfree optik laboratuvar tomografi-on-a-chip sistemleri için yararlı bir araç olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
- Schmitt, J. M. Optical coherence tomography (OCT): a review, J. Sel. Top. Quant. Elect. 5, 1205-1215 (1999).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sørensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sung, Y., Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Dasari, R. R., Feld, M. S. Optical diffraction tomography for high resolution live cell imaging. Opt. Exp. 17, 266-277 (2009).
- Debailleul, M., Simon, B., Georges, V., Haeberle, O., Lauer, V. Holographic microscopy and diffractive microtomography of transparent samples. Meas. Sci. Technol. 19, 074009 (2008).
- Charrière, F., Pavillon, N., Colomb, T., Depeursinge, C., Heger, T. J., Mitchell, E. A. D., Marquet, P., Rappaz, B. Living specimen tomography by digital holographic microscopy: Morphometry of testate amoeba. Opt. Exp. 14, 7005-7013 (2006).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Mavandadi, S., Yu, S. W., Feng, S., Lau, R., Ozcan, A. Lens-free optical tomographic microscope with a large imaging volume on a chip. Proc. Nat. Acad. Sci. 108, 7296-7301 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Sikora, U., Yaglidere, O., Yeah, J., Ozcan, A. Field-portable Lensfree Tomographic Microscope. Lab Chip. 11, 2222-2230 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Zhu, H., Ozcan, A. Optofluidic tomography on a chip. App. Phys. Lett. 98, 161109 (2011).
- Bishara, W., Su, T. W., Coskun, A., Ozcan, A. Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution. Opt. Exp. 18, 11181-11191 (2010).
- Messaoudi, C., Boudier, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Heng, X., Erickson, D., Baugh, L. R., Yaqoob, Z., Sternberg, P. W., Psaltis, D., Yang, C. Optofluidic Microscopy: A Method for Implementing High Resolution Optical Microscope On A Chip. Lab on a Chip. 6, 1274-1276 (2006).
