Summary
Lensfree טומוגרפיה אופטית היא טכניקה תלת מימדי מיקרוסקופיה המציע רזולוציה מרחבית של <1 מיקרומטר × <1 מיקרומטר × <3 מיקרומטר ב X, Y ו-Z ממדים, בהתאמה, מעל נפח הדמיה גדול של 15-100 מ"מ
Abstract
הדמיה טומוגרפית היה כלי בשימוש נרחב ברפואה כפי שהוא יכול לספק תלת ממדי (3D) מידע מבניים לגבי אובייקטים של קשקשים בגדלים שונים. קשקשים מיקרומטר ו מילימטר, שיטות מיקרוסקופיה אופטית למצוא השימוש הגובר בשל האופי הלא מייננת של האור הנראה, ואת הזמינות של מערכת עשירה של מקורות תאורה (כגון לייזרים פולטות אור למוצרי דיודות) ואלמנטים זיהוי (כגון פורמט ה-CMOS CCD גדול גלאי למוצרי מערכים). בין שיטות אופטיים שפותחו לאחרונה טומוגרפית מיקרוסקופיה, ניתן לכלול טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית, טומוגרפיה עקיפה אופטי, טומוגרפיה אופטית הקרנת אור גיליונות במיקרוסקופ. 1-6 פלטפורמות אלו מספקות הדמיה המודולרית של תאים, מיקרואורגניזמים ובעלי חיים מודל כגון ג elegans, דג הזברה לבין עוברי עכברים.
קיימים הדמיה אופטית 3D בדרך כלל יש ארכיטקטורות מגושם יחסית ומורכב, הגבלת הדואר זמינות של ציוד למעבדות הללו מתקדמים, הפגיעה שילוב שלהם עם מעבדה על שבב פלטפורמות שבבי microfluidic. לספק אלטרנטיבה מיקרוסקופ טומוגרפית, אנו לאחרונה פיתחה lensfree טומוגרפיה אופטית (הרבה) כמו שיטת תפוקה גבוהה, קומפקטי וחסכוני טומוגרפיה אופטית. 7 מוחקת לוט השימוש של עדשות ורכיבים אופטיים מגושם, ובמקום זאת מסתמכת על רב זווית תאורה חישוב הדיגיטלי כדי להשיג עומק נפתרה הדמיה של מיקרו חפצים על נפח הדמיה גדול. הרבה יכול הדגימה הביולוגית התמונה ברזולוציה מרחבית של <1 מיקרומטר x <1 מיקרומטר x <3 מיקרומטר ב X, Y ו-Z ממדים, בהתאמה, מעל נפח הדמיה גדול של 15-100 מ"מ 3, והוא יכול להיות שימושי במיוחד עבור מעבדה על שבב פלטפורמות.
Protocol
1. הדמיה ההתקנה
הרבה ניתן להרכיב באדריכלות שדה נייד קומפקטי וקל משקל 8, ולחילופין כמו מיקרוסקופ optofluidic עם יכולת ההדמיה המודולרית. 9 בדו"ח זה, עם זאת, נתאר את ההגדרה הבסיסית הדמיה ליישום הספסל העליון כלפי טומוגרפיה של סטטי דוגמאות.
- מודול תאורה: במגרש, מקורות אור קוהרנטי חלקית כגון פולטות אור (LEDs למוצרי דיודות) יכול להיות מנוצל. גמישות ניסיוני, השתמשנו monochromator עם מנורת קסנון (הפינה T260, ניופורט קורפ). Monochromator הותאם לספק פלט עם רוחב ספקטרלי ~ 1-10 ננומטר סביב אורך גל של 450-650 ננומטר במרכז למשל. פלט זה קוהרנטי חלקית מצמידים מכן סיבים אופטיים multimode (Thorlabs AFS105/125Y), כדי לספק אור קוהרנטי חלקית למערכת.
סיב אופטי הוא רכוב על הבמה סיבוב ממונע (Thorlabsפ.ר.מ.-1Z8 מונע על ידי Thorlabs TDC001 בקר) כדי לשנות את זווית ההארה. בשלב ממונע, עם מקור אור מחובר, הוא רכוב על הבמה דו מימדי XY ליניארי (Newport ILS50CC מונע על ידי בקרי ניופורט MFA-PPD), ששימש להשיג מטוס משמרות של מקור האור בזווית מסוימת. - זיהוי: טומוגרפיה Lensfree אופטית היא טכנולוגיית להרחבה כך מערך גלאי ניתן לבחור על פי הדרישות של יישומים ללא שינוי משמעותי רכישת התמונה צעדים או עיבוד נתונים. בדו"ח זה, אנו עובדים מערך חיישן CMOS בעל 5 מגה פיקסל, עם גודל פיקסל של 2.2 מיקרומטר (IDS הדמיה, ממשק משתמש-1485LE-M). גלאי משמש כדי להקליט את תחום רחב של נוף (למשל 24 מ"מ 2) תמונות הולוגרפיות של דגימות, שהונחו ישירות על האזור הפעיל של הגלאי. אם ההתקנה כפול ציר טומוגרפיה זו תיושם 7, גלאי צריךlso להיות מותקן על הבמה (ביחס לשולחן אופטי) סיבוב אופקי (למשל Thorlabs RP-01) כדי לסובב את המדגם (יחד עם הגלאי) במישור רגיל לציר האופטי. 7
2. לדוגמא הכנת
בעוד טומוגרפיה lensfree אופטי יכול תמונת מגוון של אובייקטים כגון תאים מיקרואורגניזמים, נוכל להמחיש את העקרונות הבסיסיים של ביצוע במיקרוסקופ תלת מימדי של C. elegans לדוגמה.
- באמצעות אזמל או מרית, לקחת חתיכה קטנה של אגר מצלחת פטרי המכילה ג elegans תרבות. חתיכת מעוקב של כמה מילימטרים לאורך ממד זה יכיל מאות נמטודות.
- מניחים את נתח קטן של אגר בבקבוקון המכיל פוליפרופילן 1 מ"ל דה מיונן (DI) מים.
- מערבולת בעדינות במשך 0.5-1 דקות, ולחכות 10-15 דקות עד התולעים לזחול החוצה היצירה אגר למים די.
- על מנתבאופן זמני לשתק את התולעים, הוסף 1 מ"ל של תמיסת levamisole 5-10 מ"מ (Sigma-Aldrich) ולחכות 10 דקות.
- פיפטה μl 5-10 של מדגם מקרב בקבוקון, ואת סנדוויץ' בין שני תלושי כיסוי. מדגם זה, המכיל מספר רב של תולעים חסרי יכולת תנועה באופן זמני (למשל 50-100 תולעים), ניתן להציב על הגלאי להתחיל רכישת נתונים.
3. רכישת נתונים
כאן, אנו מסכמים את רכישת התמונה שלבי הניסוי הרבה טיפוסי, אשר באופן אוטומטי באמצעות ממשק מותאם אישית שפותחה LabVIEW.
- כוון את זווית ראשונית של שלב הסיבוב ל -50 מעלות, כאשר 0 ° תואמת את העמדה אנכית של מקור האור.
- להתאים את המיקום הראשוני של הבמה כדי XY (0,0), המהווה את מיקום הבית.
- כוון את זמן החשיפה של הגלאי הטובה ביותר לנצל את הטווח הדינאמי שלה התמונה כך הוא בהיר ככל האפשר ללא כל שלaturated פיקסלים.
- מבלי לשנות את הזווית של שלב סיבוב, לתפוס 9 תמונות. עבור כל תמונה, להזיז את הבמה XY למיקום חדש ברשת ריבוע 3x3 כך כל תמונה עוברת על ידי כרבע של פיקסל לעומת קודמו. רכישת תמונות בזווית יותר מדי, למשל ברשת 6μ6, עשוי לשפר את הרזולוציה בהתאם לסוג של האובייקט ואת אות לרעש יחס (SNR). 10
- להתאים את המיקום הראשוני של הבמה כדי XY (0,0), המהווה את מיקום הבית.
- להגדיל את זווית בשלב סיבוב במרווחים של 2 מעלות, עד שמגיעים 50 °. לאחר כל תוספת, כלומר בזווית כל חדש, חזור על שלבים 3-5. את במרווחים זוויתי יכול להיות עדין או גס בהתאם אופטימיזציה של זמן הרכישה לעומת רזולוציית הדמיה.
- (צעד אופציונלי, אם ערכת כפול ציר טומוגרפיה היא להיות מנוצל) סובב את השלב האופקי שבו מותקן גלאי ב -90 °. לאחר מכן,חזור על שלבים 1-6.
4. ניתוח נתונים
בעקבות צעדים 1-6 בסעיף 3, קבוצה של 459 תמונות נרכש, המכיל 9 תת פיקסלים תמונות שהוסטו עבור כל אחד 51 זוויות שונות של תאורה. ראשית, כל קבוצה של 9 תמונות מעובד באופן דיגיטלי, באמצעות פיקסל סופר ברזולוציה אלגוריתם 10, כדי להשיג אחד ברזולוציה גבוהה (HR), הקרנת ההולוגרמה לכל זווית. יש לציין כי פיקסל סופר רזולוציה מתייחס להתגבר על מגבלה של גודל פיקסל, ולא לגבול השתברות, על רזולוציה מרחבית של תמונות lensfree. הולוגרמות סופר לפתור פיקסל הן מכן שיחזר דיגיטלית 7-10 להשיג 51 תמונות הקרנת. זו קבוצה של 51 תמונות התחזית ואז חזרה, מוקרן באמצעות TomoJ, תוסף עבור ImageJ (קוד פתוח התמונה תוכנת ניתוח). 11 מבצע גב פלטי הקרנת תמונה תלת ממדית (tomograms) של המדגם. אם כי לא מיושם כאןערכת כפול ציר טומוגרפיה יכול גם להיות מנוצל כמתואר Ref. 7. לפי שיטה זו, קבוצה שנייה של tomograms מתקבל על ידי סיבוב מקור האור לאורך ציר מאונך ביחס לציר הסיבוב הראשון, אשר מספקת מידע מרחבי נוסף על המדגם, ומשפרת את הרזולוציה צירית.
5. נציג תוצאות
גדול בתחום של נוף (FOV) של טומוגרפיה lensfree אופטי מודגם באיור 1. כמו לדוגמה ממוקם ישירות על מערך גלאי, תמונות הולוגרפיות של האובייקטים ניתן להקליט על מ"מ FOV של 24 2, אשר ניתן להגדיל עוד יותר באמצעות מערכים גלאי המתעוררים עם אזורים פעילים יותר.
למרות גודל פיקסל של מערך גלאי מגביל את הרזולוציה של תמונות הולוגרפיות המוקלט, פיקסל סופר רזולוציה טכניקות מפחית את חומרת הבעיה. תרשים 2 מציג פיקסל סופר לפתור הולוגרמות יחדעם תמונות משוחזרות (כלומר תמונות הקרנת) המציעים משנה מיקרומטר ברזולוציה מרחבית, שלוש זוויות שונות של תאורה.
הקרנת התמונות ניתן לשלב באמצעות טכניקות שיחזור טומוגרפית תמונה (מסונן למשל גב הקרנת) לחשב tomograms (כלומר שלוש תמונות ממדי) של הדגימה. איור 3 מציג שלוש תמונות פרוסה במישור xy באמצעות הקדמי של התולעת, שם צינור בלוע גלוי רק פרוסה עד Z = 8 מיקרומטר, כצפוי ממבנה זה גלילי בערך בקוטר 5 מיקרומטר ~ החיצוני. יתר על כן, תמונת חתך במישור XZ (הבלעה באיור 3 הפאנל העליון) ניתן לראות בבירור את הגבולות של התולעת ואת הצינור בתוך בלוע (הצביע על החצים), הוכחת 3D הדמיה מוצלחת של הלוע.
תרשים 2 מציג את פיקסל סופר לפתור הולוגרמות (פאנל משמאל) תמונות הקרנת משוחזרים דיגיטלית (פאנל מימין) על C. תולעת elegans (קצוץ מ גדול בתחום של נוף) בשעה שלוש זוויות תאורה שונות. כל תמונה הקרנת מכיל מידע על זווית צפייה שונה, המאפשר חישוב של המבנה 3D באמצעות ניתוח גב הקרנת מסוננים.
איור 3 מציג tomograms מחושבות עבור ג elegans תולעת Oו באיור 2. (שורה עליונה) מראה תמונה פרוסת תולעת כולו ב Z = 3 מיקרומטר. הבלעה מראה תמונת חתך מ הקדמי של התולעת. סרגל קנה המידה של השיבוץ הוא 50 מיקרומטר. (שורה תחתונה) מציג שלוש תמונות פרוסה דרך הקדמי של התולעת, הוכחת יכולת חתך אופטי של טומוגרפיה אופטית lensfree. חצים בכל דמות לציין את אותה נקודה על צינור בלוע של התולעת. תמונת מיקרוסקופ (X40, 0.65-NA) הוא גם סיפק לצורך השוואה ויזואלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חשוב להדגיש כי הגיאומטריה הייחודית של מיקרוסקופיה על שבב lensfree הולוגרפית הוא קריטי המאפשר להשיג פיקסל סופר רזולוציה הדמיה טומוגרפית. מאז התמונות המוקלטות אינם מניחים כי תמונות הקרנת כמו הדמיה קשר לא מובן 12 מתקרב, אבל הקרנת הולוגרמות, עקיפה של האור המועבר עד שהוא פוגע הגלאי ניתן לתקן באופן דיגיטלי על ידי שחזור הולוגרפית. לכן, שינויים במרחק מדגם אל החיישן ניתן להסביר. יתר על כן, מאז מרחק מדגם אל החיישן הוא בדרך כלל ~~~V 0.5-5 מ"מ, בעוד מקור האור ממוקם במרחק 4-10 ס"מ ~ מן המדגם, השגת תת פיקסלים משמרות אינה דורשת משמרות מקור גדול. כתוצאה מכך, להעביר את מקור האור היחיד של 50-100 מיקרון מספיקה כדי להשיג תת פיקסלים משמרות במישור גלאי, מניעת שינויים לא רצויים ב i) פרספקטיבה תאורה בכיוון /, כמהND II) מרחק יעיל מדגם אל חיישן במיקום זה המקור. אם לא למנוע, שינויים אלה עלולים לגרום סטיות משמעותיות התמונות סופר לפתור פיקסל. לכן, הולוגרמות את שנרשמו במיקום זה המקור, בזווית מסוימת, יכול למעשה להיחשב תת פיקסלים גרסאות שהוסטו של תמונה הולוגרפית אותו. יתר על כן, העיצוב כמעט ללא יישור של טומוגרפיה אופטית lensfree עושה את זה פשוט למדי להקליט הולוגרמות הקרנת בזוויות שונות, פשוט על ידי סיבוב מקור האור 7,9, או באמצעות מקורות אור מרובים (כגון נוריות) בזוויות שונות 8.
לוט הוא טכניקה המתעוררים, אשר מציעה מוצר גדול בחלל רוחב פס עבור הדמיה על שבב של דגימות. חשוב לציין, זוהי טכנולוגיה להרחבה כי תהיה תועלת רבה מן מערכים גלאי הדור הבא. כלומר, כמו מהר CMOS ו-CCD מערכים גלאי עם פיקסלים צפופה זמינים, הרבה יהיה קונטיnuously לשפר הן מבחינת, ברזולוציה השדה לאחר צפייה של ומהירות. זהו יתרון חשוב של lensfree על שבב במיקרוסקופ על מיקרוסקופ אור רגיל, שבו הביצועים הדמיה נקבעת על ידי מספר רב של תתי מערכות, הפגיעה דרוג ישירה של איכות תמונה עם ההתקדמות בטכנולוגיות דיגיטליות.
לסיכום, המאפשר תפוקה גבוהה מיקרוסקופיה 3D של דגימות על נפח הדמיה גדול, באדריכלות קומפקטית, טומוגרפיה lensfree אופטי יכול להיות ערכת כלים שימושיים מעבדה על שבב מערכות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
- Schmitt, J. M. Optical coherence tomography (OCT): a review, J. Sel. Top. Quant. Elect. 5, 1205-1215 (1999).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sørensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sung, Y., Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Dasari, R. R., Feld, M. S. Optical diffraction tomography for high resolution live cell imaging. Opt. Exp. 17, 266-277 (2009).
- Debailleul, M., Simon, B., Georges, V., Haeberle, O., Lauer, V. Holographic microscopy and diffractive microtomography of transparent samples. Meas. Sci. Technol. 19, 074009 (2008).
- Charrière, F., Pavillon, N., Colomb, T., Depeursinge, C., Heger, T. J., Mitchell, E. A. D., Marquet, P., Rappaz, B. Living specimen tomography by digital holographic microscopy: Morphometry of testate amoeba. Opt. Exp. 14, 7005-7013 (2006).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Mavandadi, S., Yu, S. W., Feng, S., Lau, R., Ozcan, A. Lens-free optical tomographic microscope with a large imaging volume on a chip. Proc. Nat. Acad. Sci. 108, 7296-7301 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Sikora, U., Yaglidere, O., Yeah, J., Ozcan, A. Field-portable Lensfree Tomographic Microscope. Lab Chip. 11, 2222-2230 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Zhu, H., Ozcan, A. Optofluidic tomography on a chip. App. Phys. Lett. 98, 161109 (2011).
- Bishara, W., Su, T. W., Coskun, A., Ozcan, A. Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution. Opt. Exp. 18, 11181-11191 (2010).
- Messaoudi, C., Boudier, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Heng, X., Erickson, D., Baugh, L. R., Yaqoob, Z., Sternberg, P. W., Psaltis, D., Yang, C. Optofluidic Microscopy: A Method for Implementing High Resolution Optical Microscope On A Chip. Lab on a Chip. 6, 1274-1276 (2006).
