Lensfree On-chip tomographic Mikroskopi Ansette Multi-angle Belysning og Pixel Super-oppløsning

Summary

Lensfree optisk tomografi er et tredimensjonalt mikroskopi teknikk som gir en romlig oppløsning på <1 mikrometer × <1 mikrometer × <3 mikrometer i x, y og z dimensjoner, henholdsvis over et stort avbildning-volum 15-100 mm

Abstract

Tomographic avbildning har vært et mye brukt verktøy i medisin som det kan gi tredimensjonale (3D) strukturell informasjon om gjenstander av ulik størrelse skalaer. I mikrometer og millimeter skalaer, optiske mikroskopi modaliteter finne økende bruken på grunn av ikke-ioniserende natur synlig lys, og tilgjengeligheten av et rikt sett med belysning kilder (for eksempel lasere og light-emitting diodes-) og påvisning elementer (for eksempel stort format CCD og CMOS detektoren-arrays). Blant de nylig utviklede optiske tomographic mikroskopi modaliteter, kan man inkludere optisk koherens tomografi, optisk diffraksjon tomografi, optisk projeksjon tomografi og lys-ark mikroskopi. ^1-6 Disse plattformene gir sectional avbildning av celler, mikroorganismer og modell dyr som C. elegans, sebrafisk og mus embryoer.

Eksisterende 3D optiske kameraer generelt har relativt store og komplekse arkitekturer, begrenser the tilgjengeligheten av disse utstyr til avanserte laboratorier, og hindrer deres integrering med lab-on-a-chip plattformer og microfluidic chips. Å gi en alternativ tomographic mikroskop, vi nylig utviklet lensfree optisk tomografi (LOT) som en høy gjennomstrømning, kompakt og kostnadseffektivt optisk tomografi modalitet. ⁷ LOT forkaster bruk av linser og klumpete optiske komponenter, og i stedet avhengig av multi-vinkel belysning og digital beregning for å oppnå dybde-løst avbildning av mikro-objekter over et stort bildebehandling volum. Mye kan image biologiske prøven i en romlig oppløsning på <1 mikrometer x <1 mikrometer x <3 mikrometer i x, y og z dimensjoner, henholdsvis over et stort avbildning volum av 15-100 mm ^3, og kan være spesielt nyttig for lab-on-a-chip plattformer.

Protocol

1. Imaging Setup

Mye kan settes sammen i et kompakt og lett felt-bærbar arkitektur ^8, og alternativt som en optofluidic mikroskop med sectional bildebehandling evne. ⁹ I denne rapporten vil vi imidlertid beskrive grunnleggende bildebehandling oppsett for en benk-top implementering mot tomografi av statisk prøver.

1. Belysning Module: I LOT, kan delvis sammenhengende lyskilder som light-emitting diodes-(LED) benyttes. For eksperimentell fleksibilitet, brukte vi en monokromator med en Xenon lampe (Cornerstone T260, Newport Corp). Den monokromator ble justert for å gi en utgang med ~ 1-10 nm spektral bredde rundt et senter bølgelengde på f.eks 450-650 nm. Dette delvis sammenhengende produksjon er så koblet til en multimode optisk fiber (Thorlabs AFS105/125Y) for å levere delvis koherent lys til systemet.
   Den optiske fiber er montert på en motorisert rotasjon scene (ThorlabsPRM-1Z8 drevet av Thorlabs TDC001 controller) for å endre vinkelen på belysning. Den motoriserte scenen, med lyskilden festet, er montert på en to-dimensjonal lineær XY stadium (Newport ILS50CC drevet av Newport MFA-PPD-kontrollere), som ble brukt for å oppnå in-plane skift av lyskilde i en gitt vinkel.
2. Detection: Lensfree optisk tomografi er en skalerbar teknologi slik at detektoren matrisen kan velges i henhold til kravene i programmene uten vesentlig å endre bildet oppkjøpet trinn eller databehandling. I denne rapporten, benyttet vi en CMOS sensor array som har 5 megapiksler, med en pikselstørrelse på 2,2 mikrometer (IDS Imaging, UI-1485LE-M). Detektoren brukes til å registrere Wide Field-of-view (f.eks 24 mm ²⁾ holografiske bilder av prøver, som ble plassert direkte på toppen av det aktive området av detektoren. Hvis en dual-aksen tomografi oppsett skal gjennomføres ^7, detektoren bør enLSO være montert på en horisontal (med hensyn til den optiske tabellen) rotasjon scenen (f.eks Thorlabs RP-01) for å rotere prøven (sammen med detektoren) i planet normalt til den optiske aksen. ⁷

2. Prøvepreparering

Mens lensfree optisk tomografi kan bildet en rekke gjenstander som celler og mikroorganismer, vil vi illustrere de grunnleggende prinsippene ved å utføre tredimensjonal mikroskopi av en C. elegans prøven.

1. Ved hjelp av en skalpell eller en spatel, ta en liten bit av agar fra petriskål inneholder C. elegans kultur. En kubikk stykke flere millimeter langs hver dimensjon vil inneholde hundrevis av nematoder.
2. Plasser den lille bit av agar i en polypropylen hetteglass inneholder 1 ml de-ionisert (DI) vann.
3. Forsiktig vortex for 0,5 til 1 min, og vente i 10-15 min før ormer krype ut av agar stykke inn i DI vann.
4. For åmidlertidig immobilize ormene, tilsett 1 ml 5-10 mm levamisole løsning (Sigma-Aldrich) og vent i 10 min.
5. Pipettering 5-10 mL av prøven fra bunnen av flasken, og sandwich mellom to forsider slips. Dette utvalget, som inneholder et stort antall midlertidig immobilisert Worms (f.eks 50-100 ormer), kan plasseres på detektoren for å starte datainnsamling.

3. Datainnsamling

Her oppsummerer vi bildet oppkjøpet trinnene for en typisk MYE eksperiment, som ble automatisert ved hjelp av en egendefinert utviklet LabView grensesnitt.

1. Juster den første vinkelen rotasjonen scenen til -50 °, hvor 0 ° tilsvarer den vertikale plasseringen av lyskilden.
2. Juster den første plasseringen av XY scenen til (0,0), som er utgangsposisjonen.
3. Juster eksponeringstid av detektoren for å best utnytte sin dynamiske området slik at bildet er så lyst som mulig uten saturated piksler.
4. Uten å endre vinkelen på rotasjon scenen, ta 9 bilder. For hvert bilde, flytt XY scenen til en ny posisjon i et 3x3 kvadrat rutenett slik at hvert bilde flytter med omtrent en fjerdedel av en piksel i forhold til den forrige. Innhente flere bilder på hver vinkel, for eksempel i en 6μ6 rutenett, kan forbedre oppløsningen avhengig av objekt og signal-til-støy-forhold (SNR). ^Ti
5. Juster den første plasseringen av XY scenen til (0,0), som er utgangsposisjonen.
6. Øk vinkelen på rotasjon scenen ved å øke med 2 °, inntil nå 50 °. Etter hvert inkrement, dvs. ved hver ny vinkel, gjenta trinn 3-5. De kantede intervaller kan være finere eller grovere avhengig optimalisering av oppkjøpet tid vs imaging oppløsning.
7. (Valgfritt trinnet hvis en dual-aksen tomografi ordningen er å bli utnyttet) Roter den horisontale fasen hvor detektoren er montert 90 °. Derettergjenta trinn 1-6.

4. Data Analysis

Følge trinnene 1-6 i § 3, et sett av 459 bilder er kjøpt, som inneholder 9 underpiksel flyttet bildene for hver av de 51 forskjellige vinkler av belysning. Først blir hvert sett av 9 bilder digitalt behandlet, bruker piksel super-oppløsning algoritmer ^10, for å oppnå en høy oppløsning (HR) projeksjon hologram per vinkel. Det bør bemerkes at pixel super-oppløsning viser til overvinne begrensning av pixel størrelsen, snarere enn diffraksjon grensen, på romlig oppløsning av lensfree bilder. Pixel super-løst hologrammer blir deretter digitalt rekonstruert ^7-10 for å få 51 projeksjon bilder. Dette settet av 51 projeksjon bildene er da tilbake anslått hjelp TomoJ, en plug-in for ImageJ (en open source bildeanalyse programvare). ^11. Dette back-projeksjon drift ut et tredimensjonalt bilde (tomograms) av prøven. Selv om det ikke gjennomføres her,en dual-aksen tomografi ordningen kan også brukes som beskrevet i Ref. 7. I denne ordningen, er et ekstra sett tomograms oppnådd ved å rotere lyskilden langs en ortogonal akse med hensyn til den første rotasjonsaksen, som gir mer romlig informasjon om prøven, og forbedrer aksial oppløsning.

5. Representative Resultater

Det store felt-of-view (FOV) av lensfree optisk tomografi er demonstrert i Figur 1. Som prøven plasseres direkte på toppen av detektor-array, kan holografiske bilder av objektene bli registrert over en FOV på 24 ² mm, som kan økes ytterligere ved hjelp av nye detektor arrays med større aktive områder.

Selv pikselstørrelse på detektoren-matrisen begrenser oppløsningen av de registrerte holografiske bilder, Pixel super-oppløsning teknikker redusere dette problemet. Figur 2 viser pixel super-løst hologrammer langsmed de rekonstruerte bildene (dvs. projeksjon bilder) som tilbyr sub-mikrometer romlig oppløsning, for tre forskjellige vinkler av belysning.

De projeksjon Bildene kan kombineres med tomographic bilde gjenoppbygging teknikker (f.eks filtrert back-projeksjon) for å beregne tomograms (dvs. tre dimensjonale bilder) av prøven. Figur 3 viser tre slice bilder i xy planet gjennom fremre av ormen, hvor svelget tuben er bare synlig i stykket gjennom z = 8 mikrometer, som forventet fra denne omtrent sylindrisk struktur med ~ 5 mikrometer ytre diameter. Videre viser tverrsnittsundersøkelse bildet i XZ planet (innfelt i Figur 3 toppanelet) klart grensene av ormen og svelg rør inni (påpekt av pilene), demonstrerer vellykket 3D avbildning av svelget.

2) holografisk bilde tatt med lensfree optisk tomografi (LOT) oppsett for vertikal belysning. På grunn av det store bildeområdet av LOT, kan mange ormer kan samtidig avbildes med et enkelt datainnsamling trinn.

Figur 2 viser pixel super-løst hologrammer (venstre panel) og digitalt rekonstruerte projeksjons Images (høyre panel) for en C. elegans orm (beskåret fra et stort felt-of-view) på tre forskjellige belysning vinkler. Hver projeksjon bildet inneholder informasjon om en annen synsvinkel, noe som muliggjør beregning av 3D struktur gjennom en filtrert back-projeksjon drift.

Figur 3 viser beregnede tomograms for C. elegans orm of Figur 2. (Øverste rad) viser en skive bilde av hele ormen ved z = 3 mikrometer. Det innfelte viser en tverrsnittsstudie bilde fra den fremre av ormen. Scale bar til det innsatte er 50 mikrometer. (Nederste rad) viser tre slice bilder via den fremre av ormen, som viser den optiske seksjonering evne lensfree optisk tomografi. Piler gjennom figuren angir den samme punkt på svelg tube av ormen. Et mikroskop bilde (x40, 0.65-NA) er også tilgjengelig for visuell sammenligning.

Discussion

Det er viktig å understreke at den unike geometrien lensfree on-chip holografisk mikroskopi er den kritiske tilretteleggerne for å oppnå pixel super-oppløsning og tomographic bildebehandling. Siden de lagrede bildene ikke antas å være projeksjon bilder som i usammenhengende kontakt bildebehandling nærmer ^12, men projeksjon hologrammer, diffraksjon av overført lys til den impinges på detektoren kan være digitalt korrigert av holografisk gjenoppbygging. Derfor kan variasjoner i utvalget-til-sensor avstand forklares. Videre er fordi prøven til sensor avstand typisk ~ for 0,5 til 5 mm, mens den lyskilden er plassert på ~ 4-10 cm avstand fra prøven, oppnå sub-piksel skift krever ikke stor kilde skift. Som et resultat, beveger lyskilden bare 50-100 mikrometer er tilstrekkelig for å oppnå sub-piksel skift på detektoren planet, hindre uønskede variasjoner i jeg) belysning retning / perspektiv, ennd ii) effektiv sample-til-sensor avstand på hver kilde posisjon. Hvis ikke forhindret, kan disse variasjonene føre til betydelige avvik i pixel super-løst bilder. Derfor kan hologrammer registrert ved hver kilde posisjon, i en gitt vinkel, faktisk anses å være sub-pixel forskjøvet versjoner av samme holografisk bilde. Videre gjør den nesten justeringen-fri design av lensfree optisk tomografi det ganske grei å spille projeksjon hologrammer i forskjellige vinkler, ganske enkelt ved å rotere en lyskilde ^7,9, eller bruker flere lyskilder (som LED) i forskjellige vinkler ^8.

LOT er en gryende teknikk som gir et stort rom-båndbredde produkt for on-chip avbildning av prøver. Viktigere er det en skalerbar teknologi som vil ha stor nytte av neste generasjons detektoren arrays. Det er, som raskere CMOS og CCD-detektor arrays med tettere piksler blir tilgjengelige, mye vil Continuously bedre både når det gjelder oppløsning, felt-of-view og hastighet. Dette er en viktig fordel av lensfree on-chip mikroskopi enn konvensjonell lysmikroskopi, hvor bildeytelse bestemmes av flere delsystemer, som hindrer direkte skalering av bildekvalitet med utviklingen innen digital teknologi.

I sammendraget, slik at høy gjennomstrømming 3D mikroskopi av prøver over et stort bildebehandling volum, i en kompakt arkitektur, kan lensfree optisk tomografi være en nyttig verktøysett for lab-on-a-chip systemer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Linear X-Y stages	Newport Corp.	MFA-PP	Miniature Linear Stage
Motorized rotation stage	Thorlabs	PRM1Z8	Motorized Precision Rotation Mount
Multimode optical fiber	Thorlabs	AFS105/125Y	Multimode Fiber
Light source	Newport Corp.	6255	Ozone-free Xenon Lamp
Monochromator	Newport Corp.	74100	Cornerstone 260 1/4 m Monochromator
CMOS sensor array	Aptina Inc.	MT9P031STC	5 Megapixels CMOS Sensor
C. elegans sample	Carolina Biosupply	173500	Wild-type C. elegans
Levamisole	Sigma Aldrich	L9756-5G	Tetramisole hydrochloride