Summary
Lensfree tomografía óptica es una técnica de microscopía tridimensional que ofrece una resolución espacial de <1 m × m <1 × menos de 3 micras x, y y z dimensiones, respectivamente, más una gran imagen-volumen de 15-100 mm
Abstract
Imágenes tomográficas ha sido una herramienta ampliamente utilizada en la medicina, ya que puede dar en tres dimensiones (3D) la información estructural de las escalas de los objetos de diferentes tamaños. En las escalas micrométricas y milimétricas, las modalidades de microscopía óptica encontrar un uso cada vez mayor debido a la naturaleza no ionizante de la luz visible, y la disponibilidad de un amplio conjunto de fuentes de iluminación (por ejemplo, los láseres y diodos emisores de luz) y los elementos de detección (por ejemplo, de gran formato CCD y CMOS de las matrices de detectores). Entre los recientemente desarrollados modalidades de microscopía óptica tomográficos, se puede incluir tomografía de coherencia óptica, la tomografía por difracción óptica, la tomografía por proyección óptica y microscopía de luz hojas. 1-6 Estas plataformas proporcionan imágenes de la sección de células, microorganismos y animales modelo como C. elegans, el pez cebra y embriones de ratón.
Existentes imágenes ópticas 3D en general, tienen arquitecturas relativamente voluminosos y complejos, lo que limita ªe la disponibilidad de estos equipos a los laboratorios avanzados, e impidiendo su integración con lab-on-a-chip plataformas y los chips de microfluidos. Para ofrecer una alternativa microscopio de tomografía, hemos desarrollado recientemente lensfree tomografía óptica (LOT) como una modalidad de la tomografía de alto rendimiento, compacto y rentable óptica. 7 descartes LOT el uso de lentes y componentes ópticos voluminosos, y en su lugar se basa en multi-ángulo la iluminación y la computación digital para alcanzar la profundidad de imagen con resolución de micro-objetos de más de un volumen de imágenes de gran tamaño. Mucho puede la muestra biológica de la imagen con una resolución espacial de <1 m X <1 m x menos de 3 m en la x, y y z dimensiones, respectivamente, sobre un volumen de imágenes de gran cantidad de 15-100 mm 3, y puede ser particularmente útil para lab-on-a-chip plataformas.
Protocol
1. Imágenes de instalación
Muchas cosas pueden ser montados en un compacto y ligero portátil de la arquitectura de campo 8, y, alternativamente, como un microscopio con la capacidad de formación de imágenes optofluídico sección 9. En este informe, sin embargo, vamos a describir la configuración de imagen básica para una aplicación de sobremesa hacia la tomografía de la electricidad estática muestras.
- Módulo de iluminación: en Lot, fuentes de luz parcialmente coherente, como emisores de luz de diodos (LED) se puede utilizar. Para una mayor flexibilidad experimental, se utilizó un monocromador con una lámpara de xenón (Cornerstone T260, Newport Corp.). El monocromador se ajustó para proporcionar una salida con ancho ~ 1-10 nm espectral alrededor de una longitud de onda central de, por ejemplo 450-650 nm. Esta salida parcialmente coherente se acopla entonces a una fibra óptica multimodo (Thorlabs AFS105/125Y) para entregar luz parcialmente coherente con el sistema.
La fibra óptica está montada en una etapa de rotación motorizada (ThorlabsPRM-1Z8 impulsado por Thorlabs TDC001 controlador) para cambiar el ángulo de iluminación. La etapa motorizada, con la fuente de luz adjunta, está montado en una etapa bidimensional lineal XY (Newport ILS50CC impulsado por Newport PPD AMF-controladores), que fue utilizado para alcanzar en el plano, los desplazamientos de la fuente de luz en un ángulo dado. - Detección: tomografía Lensfree óptica es una tecnología escalable de tal manera que el conjunto de detectores pueden ser elegidos de acuerdo con los requisitos de las aplicaciones sin cambiar significativamente los pasos de adquisición de la imagen o el procesamiento de datos. En este informe, se empleó un conjunto de sensores CMOS que tiene 5 megapíxeles, con un tamaño de píxel de 2,2 micras (IDS Imaging, IU-1485LE-M). El detector se utiliza para registrar los anchos de campo de visión (por ejemplo 24 mm 2) imágenes holográficas de muestras, que se colocan directamente sobre la parte superior de la zona activa del detector. Si una configuración tomografía de doble eje que se aplicará 7, el detector debe unaLSO ser montado en una etapa de rotación horizontal (con respecto a la mesa óptica) (por ejemplo Thorlabs RP-01) para girar la muestra (junto con el detector) en el plano normal al eje óptico. 7
2. Preparación de la muestra
Si bien la tomografía óptica lensfree pueden tomar imágenes de una variedad de objetos, tales como células y microorganismos, que se ilustran los principios básicos mediante la realización de la microscopía en tres dimensiones de un C. elegans muestra.
- Con un bisturí o una espátula, tomar un pequeño trozo de agar de la placa de Petri que contiene el C. elegans cultura. Un trozo cúbico de varios milímetros a lo largo de cada dimensión contendrá cientos de nematodos.
- Coloque el pequeño trozo de agar en un vial de polipropileno que contiene 1 ml desionizada (DI).
- Suavemente vórtice durante 0,5-1 minutos, y esperar durante 10-15 minutos hasta que los gusanos se arrastran fuera de la pieza de agar en el agua desionizada.
- Parainmovilizar temporalmente los gusanos, añadir 1 ml de solución 5.10 mM levamisol (Sigma-Aldrich) y esperar durante 10 minutos.
- Pipetear l 5-10 de la muestra desde el fondo del vial, y emparedado entre dos cubreobjetos. Esta muestra, que contiene un gran número de gusanos temporalmente inmovilizada (por ejemplo, 50-100 gusanos), se puede colocar en el detector para iniciar la adquisición de datos.
3. Adquisición de Datos
Aquí, un resumen de los pasos de adquisición de imágenes para un experimento de lote típico, que fue automatizado mediante el uso de una costumbre desarrollada LabView interfaz.
- Ajustar el ángulo inicial de la fase de rotación a -50 °, donde 0 ° corresponde a la posición vertical de la fuente de luz.
- Ajuste la posición inicial de la fase XY para (0,0), que es la posición inicial.
- Ajustar el tiempo de exposición del detector de utilizar mejor su rango dinámico de tal manera que la imagen es tan brillante como sea posible sin ningún tipo de saturated píxeles.
- Sin cambiar el ángulo de la fase de rotación, la captura de imágenes 9. Para cada imagen, mover la etapa XY para una nueva posición en una cuadrícula de 3x3 cuadrado de tal manera que cada imagen se desplaza por aproximadamente una cuarta parte de un pixel en comparación con la anterior. La adquisición más imágenes en cada ángulo, por ejemplo, en una rejilla 6μ6, podría mejorar la resolución en función del tipo del objeto y de señal a ruido (SNR). 10
- Ajuste la posición inicial de la fase XY para (0,0), que es la posición inicial.
- Aumentar el ángulo de la fase de rotación en incrementos de 2 °, hasta llegar a 50 °. Después de cada incremento, es decir, en cada nuevo ángulo, repita los pasos 3-5. Los incrementos angulares pueden ser más fino o más gruesa en función de la optimización de tiempo de adquisición de imágenes de resolución vs.
- (Paso opcional si un régimen de tomografía de doble eje se va a utilizar) Girar la etapa horizontal sobre el que está montado el detector en 90 °. Entonces,repetir los pasos 1-6.
4. Análisis de Datos
Siguiendo los pasos 1-6 en la sección 3, un conjunto de 459 imágenes que se adquiere, que consta de 9 sub-pixel para imágenes desplazadas cada una de las 51 diferentes ángulos de iluminación. En primer lugar, cada grupo de 9 imágenes se procesan digitalmente, utilizando píxeles algoritmos de super resolución 10, para obtener una alta resolución (HR) holograma de proyección por ángulo. Cabe señalar que píxel de super-resolución se refiere a la superación de la limitación del tamaño de pixel, en lugar del límite de difracción, en la resolución espacial de imágenes lensfree. Pixel hologramas super resueltos luego se reconstruyó digitalmente 7-10 para obtener 51 imágenes de la proyección. Este conjunto de 51 imágenes de proyección se encuentra de nuevo-proyectaron a partir de TomoJ, un plug-in para ImageJ (una imagen de código abierto de software de análisis). 11 Esta operación de retroproyección genera una imagen en tres dimensiones (tomografías) de la muestra. Aunque no se han aplicado aquí,un régimen de tomografía de doble eje también podría ser utilizado como se describe en la referencia. 7. En este esquema, un segundo conjunto de tomogramas se obtiene haciendo girar la fuente de luz a lo largo de un eje ortogonal con respecto al eje de rotación primero, que proporciona información más espacial con respecto a la muestra, y mejora la resolución axial.
5. Los resultados representativos
El gran campo de visión (FOV) de la tomografía lensfree óptico se demuestra en la Figura 1. A medida que la muestra se coloca directamente sobre la parte superior del detector de matriz, las imágenes holográficas de los objetos se pueden grabar sobre una mm FOV de 24 2, que puede incrementarse aún más utilizando emergentes conjuntos de detectores con grandes áreas activas.
Aunque el tamaño de pixel del detector de matriz limita la resolución de las imágenes holográficas grabados, píxel de super-resolución técnicas mitigar este problema. Figura 2 muestra super-pixel-resueltos a lo largo de hologramascon las imágenes reconstruidas (es decir, imágenes de proyección) que ofrecen sub-micrómetro resolución espacial, para tres diferentes ángulos de iluminación.
Las imágenes de la proyección se puede combinar con técnicas de reconstrucción tomográfica de imágenes (por ejemplo, de retroproyección filtrada) para calcular las tomografías (es decir, imágenes en tres dimensiones) de la muestra. La Figura 3 muestra tres imágenes de división en el plano xy a través de la parte anterior del gusano, donde el tubo faríngeo sólo es visible en el corte a través de z = 8 m, como se esperaba a partir de esta estructura más o menos cilíndrica con un diámetro de 5 micras ~ exterior. Además, la imagen de la sección transversal en el plano xz (inserto en la Figura 3 panel superior) muestra claramente los límites del gusano y el tubo interior faríngea (señalado por las flechas), demostrando exitosa de imágenes 3D de la faringe.
La Figura 2 muestra el pixel super-resueltos hologramas (panel izquierdo) y las imágenes de proyección reconstruidas digitalmente (panel derecho) para un C. gusano elegans (recortada de un gran campo de visión) a los tres ángulos de iluminación diferentes. Cada imagen de proyección contiene información relativa a un ángulo de visión diferente, que permite el cálculo de la estructura en 3D a través de una de retroproyección filtrada operación.
La Figura 3 muestra tomogramas calculadas para la C. elegans gusano of Figura 2. (Fila superior) muestra una imagen de corte del gusano entero en z = 3 m. El recuadro muestra una imagen de corte transversal de la parte anterior del gusano. Barra de escala de la inserción es de 50 micras. (Fila inferior) muestra tres imágenes de cortar a través de la parte anterior del gusano, lo que demuestra la capacidad óptica de seccionamiento de la tomografía óptica lensfree. Las flechas en toda la figura indican el mismo punto en el tubo faríngeo del gusano. Una imagen de microscopio (x40, 0.65-NA) también se proporciona para la comparación visual.
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Discussion
Es importante destacar que la geometría única de lensfree en el chip microscopio holográfico es el elemento crítico para lograr super-pixel de resolución y las imágenes tomográficas. Puesto que las imágenes grabadas no se supone que son imágenes de proyección de imagen como en contacto se aproxima a 12 incoherente, pero hologramas de proyección, la difracción de la luz transmitida hasta que choca con el detector puede ser corregida digitalmente por reconstrucción holográfica. Por lo tanto, las variaciones en la distancia de la muestra y el sensor puede ser explicada. Además, dado que la distancia de la muestra y el sensor está típicamente ~ de 0.5-5 mm, mientras que la fuente de luz se coloca a una distancia de 4-10 ~ cm de la muestra, el logro de sub-píxel turnos no requiere grandes cambios de código. Como un resultado, moviendo la única fuente de luz por 50-100 micras es suficiente para lograr sub-píxel se desplaza en el plano detector, evitando variaciones no deseadas en i) perspectiva iluminación dirección /, unnd ii) a partir de muestra y sensor de distancia en cada posición de la fuente. Si no se previene, estas variaciones pueden causar aberraciones significativas en las imágenes de píxeles súper resueltos. Por lo tanto, los hologramas registrados en cada posición de la fuente, en un ángulo dado, en realidad puede ser considerado como sub-píxel versiones desplazadas de la misma imagen holográfica. Además, el diseño de alineación casi libre de lensfree tomografía óptica hace que sea bastante sencillo para grabar hologramas de proyección en diferentes ángulos, simplemente haciendo girar una fuente de luz 7,9, o el uso de múltiples fuentes de luz (como LED) en diferentes ángulos 8.
LOT es una técnica emergente que ofrece un gran espacio de ancho de banda para el producto en el chip de imágenes de muestras. Es importante destacar que se trata de una tecnología escalable que se beneficiarán enormemente de los conjuntos de detectores de última generación. Es decir, como más rápido CMOS y CCD de detectores con arreglos de píxeles más densas que se disponga, LOT Continuously mejorar tanto en términos de resolución, el campo de visión y la velocidad. Esto es una ventaja importante de lensfree en el chip microscopía sobre microscopía óptica convencional, donde se determina un rendimiento de imagen por múltiples sub-sistemas, impidiendo la escala directa de la calidad de la imagen con los avances en las tecnologías digitales.
En resumen, lo que permite alto rendimiento 3D de microscopía de las muestras en un volumen grande de imágenes, en una arquitectura compacta, la tomografía óptica lensfree puede ser un conjunto de herramientas útiles para el laboratorio-en-un-chip de los sistemas.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
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