Summary
Роман протокол сообщили в настоящем исследовании, позволяет избирательно обнаружения метастазов в легких в одной резолюции клетки у мышей, комбинированные
Protocol
1. В месте перфузии легкого и фиксация
- Anesthetize мышей IP-инъекции ~ 150 мкл фосфатным буферным раствором (PBS), содержащего 112,5 мг / кг (масса тела) кетамин, 16,5 мг / кг ксилазина и 15 мг / кг Ацепромазин (или другой анестезии, содержащие соответствующие болеутоляющие средства).
- Когда рефлексы у мышей больше не наблюдается, зафиксировать его на операционный стол обратно вниз и влажный мех с 70% этанола, чтобы пятно волосы вниз.
- Откройте кожу от живота до шеи и потяните ее в сторону или удалить его.
- Откройте брюшины и грудной клетки с достаточным размером. Предотвращение разрывов крупных сосудов (например, jugularis пола), чтобы избежать снижения эффективности последующей перфузии.
- Вырезать полой вены caudalis под печенью.
- Используйте 20 мл шприц оснащен 21G - 24G иглу вводят медленно 10-15 мл PBS в правый желудочек бьющегося сердца, пока легкие полностью белый исердце перестает биться (асистолия).
- Повышение от кровеносных сосудов на печени и диафрагмы с сосудистым зажимом.
- Используйте в 10 мл шприц оснащен 21G - 24G иглу вводят ~ 2 мл 3% параформальдегидом (PFA) в PBS в правый желудочек.
- Раскройте трахею снаружи грудной клетки. Используйте тот же шприц для введения ~ 3 мл 3% PFA в PBS черепа (за пределами грудной клетки) в трахею до легкого завышены. Сразу же после удаления игл, отщипывать трахеи хвостового из прокола с сосудистым зажимом и ждать 10 минут, чтобы позволить фиксации.
- Разрез кровеносных сосудов выше сосудистый зажим, снимите зажим и вводят ~ 2 мл PBS в правый желудочек, чтобы удалить излишки PFA.
- Прокол нижней части всех долей легких с помощью иглы, удалить сосудистый зажим на трахею и вводить 3-5 мл раствора PolyFreeze вложения средне / PBS 1:01 в трахею хвостового первого прокола до PFA в легкоедолей заменяется решением.
- Снимите легких, осторожно потянув сердце с щипцами и пересекающих соединительной ткани связок, кровеносных сосудов и трахеи. Держите сердце связан с легкими.
- В зависимости от того, как приступить к анализу легочной ткани продолжить протоколы, описанные в разделах 2 и 3. Если вы хотите сделать и анализы, удалить одно легкое доли и действуйте, как описано в возрасте до 3. Процесс оставшихся долей подключен к сердцу, как описано в разделе 2.
2. Визуализация LacZ с метками метастатических опухолевых клеток в целых долей легких
- Поместите легких в пластиковой чашке с плотной крышкой закрытия и исправить ее с 2% формальдегида в PBS при комнатной температуре в течение 30-60 мин.
- Удалить фиксации решения и тщательно промойте 3 раза с PBS.
- Добавить по крайней мере, 10 мл свежеприготовленного 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозид (X-Gal) окрашивание раствора (X-Gal раствора [40 мг / мл вДиметилформамид] 1:40 разводят в Основной красящий раствор, рН 7,1 (табл. 1); защиты от света).
- Положите кусок марли в верхней части бассейна легкие, чтобы держать его полностью в растворе и положите крышку лишь в общих чертах на горшок, позволяющие осуществлять обмен воздуха.
- Инкубировать при 37 ° С в течение 3-5 часов в защищенном от света.
- Удалить X-Gal раствора, промойте один раз PBS для удаления остаточных X-Gal решение (по желанию) и добавить 4% PFA.
3. Визуализация LacZ с метками метастатических опухолевых клеток в легких Cryosections
- Prefill помечены вложения форму на 1/3 неразбавленным среднего вложения PolyFreeze. Положить доля легкого сверху и залейте вложения среде до лопасть полностью покрыта. Постарайтесь предотвратить пузыри.
- Инкубируйте встроенных легких при 4 ° С в течение 20 мин.
- Тогда заморозить встроенных легких медленно в смеси сухого льда и изопентана и хранить при температуре -80 ° C.
- Вырезать 7-10 мкм криоразделах, посвященных криостата и смонтировать их на SuperFrostPlus слайды микроскопом.
- Инкубируйте разделов сразу с X-Gal окрашивание раствора при 37 ° С в течение 24 ч во влажной камере.
- Промыть слайдов в PBS 2 раза в течение 5 мин, а затем кратко в дистиллированной воде.
- Counter-пятно с ядерными быстрым красным в течение 10-30 секунд, промыть в дистиллированной воде и смонтировать слайды с иммуно-горе.
4. Представитель Результаты
Асаи и соавт. Сообщили в оригинальной статье на Dunn-производные LM8 мышиной модели ОС, которая SC первичных опухолей, полученных от родительской клетки Данн, отличаются от тех, происходит от высокой метастатической LM8 к югу клеточной линии, не самопроизвольно образуют обнаружены метастазы в легких сингенных C3H мышей 14. С Здесь сообщил методы, мы переследованию образованию метастазов в Dunn/LM8 мышиных моделях ОС. Мы воспользовались стабильной LacZ-трансдуцированных Данн и LM8 клеткиы и протокол на месте перфузии легкого и фиксации у мышей. Представитель изображений перфузии и не перфузии легких мышей подкожно с LacZ-трансдуцированных и не трансдуцированных управления Данн и LM8 клетки показано на рисунке 1. В мышей, которым вводили контрольные клетки Данн, макроскопические и микроскопические метастазы остались обнаружить в не-перфузии и перфузии легких (рис. 1А, I-IV). Но, что интересно, в мышей, которым вводили Dunn-LacZ клеток, X-Gal окрашивание выявило синие микрометастазов очагов отдельных клеток или небольших скоплений клеток (<0,1 мм) на поверхность без перфузии легких (рис. 1А, VI). В месте перфузии и фиксации легких дальнейшее совершенствование выявляемости Dunn-LacZ микрометастазов (рис. 1А, VIII). Тем не менее, результат для макроскопических очагов не наблюдается (рис. 1А, V, VII). </ P>
В мышей, которым вводили управления LM8 клетки, полупрозрачные, едва уловимым macrometastatic очагов более 0,1 мм в диаметре, были признаны в не-перфузии легких (рис. 1б, г). Перфузии легкого (рис. 1б, в) не улучшает обнаружение очагов. Тем не менее, в мышей, которым вводили LM8-LacZ клеток нескольких X-Gal окрашен в голубой цвет макро-(рис. 1Б, В) и микрометастазов (рис. 1б, VI) были обнаружены на поверхности, не перфузии органов. Кроме того, перфузии легких улучшена выявляемость макро-и микрометастазов (рис. 1б, VII - VIII). Следовательно, микро-и macrometastases стал видимым при более высокой плотностью и большим числом, в основном за счет полупрозрачности перфузии тканей, в которых очаги под поверхностью орган также стал видимым.
Дополнительные чistological анализа с использованием cryosections легочной ткани подтвердили улучшенные возможности обнаружения метастазов в легких у мышей вводили LacZ-трансдуцированных Данн и LM8 клеток. У мышей с первичными опухолями, полученные из Dunn-LacZ или LM8-LacZ клеток, в отличие от мышей с первичными опухолями соответствующих контрольных клеток, микрометастазов или даже одной клетки очаги были признаны в легких секций (рис. 2). Кроме того, macrometastases также были более четко видны в мышей, которым вводили LM8-LacZ клеток, чем у животных, которым вводили управления LM8 клетки (рис. 2, D).
Рисунок 1. Обнаружение спонтанных метастазов, не трансдуцированных (I-IV) и LacZ-трансдуцированных (V-VIII), Данн (А) и LM8 (B) клеток в не-перфузии (I, II, V, VI) и перфузии (III, IV, VII, VIII), легкие в C3H мышей. Метастазы в представительных X-Gal-станцииINED целом легких (V, VII в А и B) и соответствующие крупным планом (VI, VIII в А и B) голубого цвета. Macrometastatic очагов (> 0,1 мм) в органах мышей, которым вводили, не отмеченных LM8 клеток (I-IV в B), обозначены звездочками. Районы показано в крупных планов являются репрезентативными для всей легких. Масштаб полоски указывают на 1 мм в образах целом легких и 0,1 мм крупным планом. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Обнаружение Данн и LM8 микрометастазов в легких cryosections. Разделы октября легочной ткани встроенный инкубировали в X-Gal красящий раствор при 37 ° С в течение 24 ч во влажной камере, а затем контрастно с ядерным быстрый красного цвета. Стрелки указывают на микрометастазов очагов признается в легких участков мышей, которым вводили Dunn-LacZ (B) или LM8-LacZ клеток (D). Micrometastases осталось обнаружить в легких участков мышей, которым вводили не-трансдуцированных Данн (A) или LM8 клеток (C). Масштаб полоски указывают на 0,1 мм.
Discussion
Здесь представлены результаты в Dunn/LM8 модель мыши OS продемонстрировать силу вновь созданный метод, который сочетает в себе X-Gal окрашивание LacZ с метками опухолевых клеток на месте перфузии / фиксации легочной ткани. Эта комбинация этих двух методов позволяет с высокой чувствительностью обнаружения микрометастазов поражения до одного уровня клеток, а также улучшает визуализацию macrometastases на поверхности легких (рис. 1), а также в легких секций (рис. 2). В то время как X-Gal окрашивание также позволяет обнаруживать (микро) метастазов в других органах, на месте перфузии / фиксации повышает выявляемость метастатических очагов в тканях, кроме легких незначительно из-за естественной крови и тканях связанных цвет этих органов 13. Даже если перфузии направлено на другого органа, например печени, удаление кровь лишь частично улучшить контрастность ставкуWeen X-Gal окрашивание и естественный цвет органа. Тем не менее, метод применим к любому типу LacZ с метками опухолевых клеток, значительно улучшить выявляемость легких метастазы до уровня спящих одноклеточных микрометастазов и позволяет легко и надежно количественного макро-и микрометастазов. Ограничение этого метода и все другие методы, основанные на репортера генов, в том числе люциферазы и флуоресцентные белки, является стабильность экспрессии трансгенов. Как показано на рисунке 2-й, не все опухолевые клетки в macrometastatic очаги окрашен в голубой цвет, что указывает на отсутствие бета-галактозидазы. Это может быть связано с некрозом, но это, скорее всего, в связи с потерей экспрессии трансгенов. Мы заметили, что Данн и LM8 клетки очень эффективны в понижающей регуляции LacZ и другие трансгены даже при непрерывной селекции для самовыражения. Поэтому мы переключается в недавних исследованиях с мышиным K12и K7M2 и человеческого HOS, 143В и Saos-2 линии остеосаркомы клетки, которые все поддерживали устойчивые выражения LacZ в пробирке, а также в естественных условиях до 100% в течение долгого времени.
После стабилизации LacZ-выражения гарантируется, этот метод может быть применен в исследованиях генов манипулировать опухолевых клеток, например, для механистически исследовать процесс колонизации тканей 13, а также для разработки и тестирования новых методов лечения, направленных на искоренение метастатических поражений 15 , 16. Кроме того, она может служить в качестве ориентира для совершенствования текущих методов визуализации радиологических, таких как ПЭТ, (микро) КТ и МРТ, используемых для раннего выявления метастазов. В недавнем исследовании ПЭТ (неопубликованные) с различными индикаторов мы убедились в естественных условиях обнаружены метастазы в легких впоследствии бывший естественных условиях с описанным протоколом. В продолжающемся исследовании с новым мелких животных микро-CT (SkyScan) мы так далеко ABле для выявления метастазов в легких в естественных условиях до размера 0,5 мм и экс естественных условиях до 0,3 мм, но мы нацелены на разрешение 0,1 мм. Интересно, что это предельный размер, что мы устанавливаем отличить от макро-микрометастазов с комбинированным методом на месте перфузии и X-Gal окрашивание. Это вновь подчеркивает чувствительность и полезность этой простой и экономически эффективной техники.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Lubor Borsig (Институт физиологии Цюрихского университета) за его советы по технике перфузии легких. Эта работа была поддержана грантами от Krebsliga в кантоне Цюрих, Walter L. и Йоханна Wolf Foundation, Цюрих, Лидия Хохштрассер фонда, Цюриха, Швейцарский национальный научный фонд, ОЯТ, Швейцарии, Schweizerischer Verein Балгрист, и университет Цюрих.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
| Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
| Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
| Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
| Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
| Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
| PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
| SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
| Nuclear-Fast Red - Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
| Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 | |
Table 1. Reagents and Equipment. |
|||
References
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature. 7, 645-658 (2007).
- Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. Science (New York, N.Y.). 295, 2387-2392 (2002).
- Fass, L. Imaging and cancer: a review. Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).
- Puaux, A. L. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538 (2011).
- Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models. Clinical & experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).
- Schmidt, C. M. Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry. Clinical & experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).
- Horwitz, J. P. Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides. J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).
- Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies. Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).
- Arlt, M. Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model. Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).
- Arlt, M. J. Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment. Cancer research. 66, 936-943 (2006).
- Banke, I. J. Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity. Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).
- Borsig, L. Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).
- Arlt, M. J. LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis. J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).
- Asai, T. Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung. International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).
- Arlt, M. J. The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity. International journal of cancer. , (2011).
- Steinmann, P. Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma. Cancer. , (2011).
