Summary
在本研究中报道的新颖协议在小鼠经合并在单细胞分辨率允许选择性检测肺转移
Abstract
转移是主要死亡原因，在大多数类型的癌症，因此在癌症研究的一个主要焦点。然而，影像学和成功在他们的治疗消灭微小转移灶的检测仍然是有限的。
尽管动物模型已经被证明是非常宝贵的工具，用于癌症研究1，监视/微转移灶的可视化仍然是一个挑战和不准确的评价转移扩散的临床前研究，可能导致令人失望的结果在临床试验中2。因此，有极大的兴趣，在改进的方法，最终使重现性好，可靠的检测在正常组织中单个细胞水平上的转移。因此，主要的重点是对技术，它允许在体内的肿瘤细胞的检测，如微计算机断层扫描（微CT），正电子发射断层扫描（PET），生物发光或荧光成像<SUP> 3,4。目前，我们正在优化这些技术在原发肿瘤的生长和转移在不同的骨肉瘤模型体内监测。其中的一些技术也可以用于体外分析转移旁边类似的qPCR 5，流式细胞仪6或不同类型的组织学染色的经典方法。为基准，在本研究中，我们已经建立的稳定转染或转导的肿瘤细胞与 lacZ基因编码细菌的酶β-半乳糖苷酶代谢的显色底物5 -溴-4 -氯-3 -吲哚基-β-D -吡喃半乳糖苷（X-Gal的）一种不溶性靛兰染料7和允许高灵敏度和选择性的组织化学蓝染色的肿瘤细胞在小鼠组织体外单细胞水平，如下所示。这是一个低成本，而不是大量设备的工具，它允许转移8在研究的精确验证评估新ticancer疗法9-11。 X-gal染色的一个限制因素是低的对比度，以及血管化组织， 例如血液相关的红色染色。在肺组织中，这个问题是可以解决的原位灌注肺，Borsig 等12灌注小鼠的肺部麻醉下，他们从血液中清除，修复和嵌入在原地 ，这是最近成立的一个技术通过气管通胀。此方法可以防止肺崩溃，从而保持形态的功能，肺泡，从而提高了质量的组织进行组织学分析。在本研究中，我们描述了一种新的协议，它充分利用了X-gal染色的 lacZ表达的肿瘤细胞的结合， 在原位灌注，肺组织固定。这家精致的协议允许高灵敏度检测的细胞在肺单发转移，使我们在最近的研究为detect“冬眠”肺微转移的小鼠模型13，原本是描述非转移性14。
Protocol
1。 原位肺灌注和固定
- 麻醉小鼠通过腹腔注射〜150微升磷酸盐缓冲盐水（PBS）含112.5毫克/公斤（体重）氯胺酮，16.5 mg / kg的甲苯噻嗪，和15毫克/千克乙酰丙嗪（或由另一个麻醉含有适当的止痛药）。
- 当反射的鼠标不再观察到，在手术台上修复它背下来，并用70％的乙醇湿润的皮毛光滑的头发下来。
- 打开的颈部和腹部的皮肤，把它的侧面或删除它。
- 打开腹膜和胸部充足的大小。防止大血管破裂（ 如腔jugularis），以避免降低工作效率的后续灌注。
- 切下腔静脉的肝尾下。
- 用20毫升的注射器配备了一个21G - 24G针缓慢注入10〜15毫升PBS进入右心室跳动的心脏，直到肺完全是白色的，心脏停止跳动（心搏停止）。
- 用血管钳掐断肝脏和膜片的上述血管。
- 使用10毫升注射器装有用21G - 24G针注入〜2毫升在PBS中的3％多聚甲醛（PFA）到右心室。
- 揭开气管外的胸部。使用相同的注射器注入〜3毫升3％PFA中进气管在PBS颅（胸廓之外），直到肺膨胀。后立即除去针头，捏关闭气管尾端的穿刺用血管钳，等待10分钟，以允许固定。
- 横切血管上方的血管钳，移除夹具并注入〜2毫升PBS到右心室，以除去过量的PFA。
- 穿刺用针的所有肺叶的下部，取出气管和血管钳在PFA中的第一穿刺，直到进气管尾端嵌入介质/ PBS 1:1注入3-5的溶液PolyFreeze毫升肺裂片被替换的解决方案。
- 小心取出肺拉的心，用钳子和横断结缔组织韧带，血管和气管。保持心脏连接到肺部。
- 根据如何继续进行，肺组织分析继续在第2或3所述的协议。如果你想同时做分析，删除的肺叶并继续在3。处理剩余的连接到心脏的裂片2下所述。
2。在整个肺叶的lacZ的标签转移性肿瘤细胞的可视化
- 将肺紧闭盖在塑料杯中，并在室温下30-60分钟，用2％甲醛的PBS固定。
- 取出固定的解决方案，并彻底冲洗3次，PBS。
- 加入至少10毫升新鲜制备的5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-Gal的）染色溶液（X-Gal的原液[40毫克/毫升二甲基甲酰胺] 1:40稀释的基本染色液，pH值7.1（ 表1），避光）。
- 把一块纱布上的游泳肺保持完全的解决方案，并把只有松散的盖子上锅，让空气交换。
- 在37°C孵育3-5小时，避光。
- 删除X-Gal的解决方案，一次与PBS冲洗，以除去残留的X-Gal的解决方案（可选）和4％PFA。
3。 lacZ的标签转移性肿瘤细胞在肺癌组织中冰冻切片的可视化
- 充液的标记嵌入模具到1/3，与未稀释的PolyFreeze灌封介质。把肺叶之上，填补了包埋剂，直到完全覆盖叶。尽量避免气泡。
- 嵌入式肺部，在4℃孵育20分钟。
- 然后冻结嵌入式的肺部慢慢在干冰和异戊烷和存储的混合物中，在-80℃下
- 切7-10微米低温部分在低温恒温器，将其安装在SuperFrostPlus显微镜幻灯片。
- 立即用的X-Gal染色溶液在37℃下孵育部分在一个加湿室中放置24小时。
- 冲洗5分钟，然后在蒸馏水中短暂的在PBS中2倍的幻灯片。
- 反污渍，核固红为10-30秒，在蒸馏水冲洗干净，并安装IMMU安装的幻灯片。
4。代表性的成果
浅井等报道在原始文章中的邓恩衍生的的LM8 OS鼠标模型，SC原发肿瘤来自父母邓恩细胞的，不同的那些来自高转移LM8子细胞，不自发地形成检测肺转移同系C3H小鼠14。在这里报道的技术，我们的一致性形成转移Dunn/LM8鼠标OS车型。我们利用了稳定LacZ基因转导的邓恩和LM8细胞s和在现场的小鼠肺灌注和固定的协议。 LacZ基因转导的和非转导控制Dunn和LM8细胞在图1中示出的代表图像的灌注和非灌注肺小鼠皮下注射。在小鼠注入与控制邓恩细胞中，宏观和微观转移仍无法检测到非灌注和灌注肺（ 图1A，I-IV）。但是，有趣的是，在唐恩-lacZ的细胞注射小鼠，X-gal染色显示蓝色的微小转移的非灌注肺的表面上（ 图1A，ⅵ）的单细胞或小的细胞簇（<0.1毫米）。原位灌注，固定的肺部，进一步提高了探测邓恩-lacZ的微小转移灶（ 图1A， 八 ）。然而，没有观察到生长到宏观灶（ 图1A，五， 七 ）。/ P>
大于在与对照LM8细胞的，半透明的，几乎检测不到macrometastatic灶小鼠注射的直径为0.1mm，非灌注肺（ 图1B，i）的确认。灌注的肺（ 图1B，ⅲ）未提高病灶的检测。然而，在小鼠注射LM8-lacZ的多个细胞的X-Gal染色蓝色宏（ 图1B，v）和微转移（ 图1B，ⅵ）进行检测的表面上的非灌注器官。此外，灌注肺进一步提高了探测性的宏观和微转移灶（ 图1B， 七 - 八 ）。因此，微型和巨转移成为可见的，主要是由于在更高的密度和较大的数字灶下方的器官表面的半透明，其中灌注组织也成为可见。
一个额外Histological分析，使用肺组织冰冻切片，证实了改进的可探测lacZ基因转导的邓恩和LM8细胞注入小鼠的肺转移。唐恩-lacZ或LM8-lacZ的细胞来自原发性肿瘤的小鼠，确认肺部分（ 图2）不同，在原发肿瘤的小鼠的各自的控制单元，微转移或即使是单细胞灶。此外，巨转移也LM8-lacZ的细胞相比，与对照动物注射LM8细胞（ 图2C，D）注射的小鼠中更清晰可见。
图1。检测自发转移的非转导（I-IV） 和 LacZ转导（V-VIII），邓恩（A）和LM8（B）细胞在非灌注（I，II，V，VI）和灌注（III，IV，VII，VIII）在C3H小鼠肺组织。代表转移的X-GAL-STA独立非执行董事全肺（Ⅴ，ⅦA和B）和各自的特写镜头（VI，VIII中的A和B）显示为蓝色。由星号表示Macrometastatic灶（0.1毫米）的非标记LM8细胞在B（I-IV）注射小鼠的器官。在近距离拍摄中所示的区域代表整个肺部。标尺显示图像全肺的1毫米和0.1毫米特写。 点击此处查看大图 。
图2。Dunn和LM8微转移的肺癌冰冻切片检测。 OCT嵌入式肺组织的部分的X-Gal染色溶液中在37℃下孵育24小时，在一个加湿室中，然后用核固红复染。箭头指向微小转移确认唐恩-lacZ的（B）或LM8-lacZ的细胞（D）注射的小鼠的肺切片。中号icrometastases仍然与非转导的邓恩（A）或LM8细胞（C）注入小鼠的肺切片中检测不到。比例尺表明0.1毫米。
Discussion
这里提出的结果，在Dunn/LM8鼠标操作系统模型展示的力量，新成立的方法，它结合了X-Gal染色LacZ基因标记的肿瘤细胞的原位灌注/肺组织固定。这两种技术的组合允许微转移病灶的高灵敏度检测到单细胞水平，也提高了肺表面（ 图1），以及在肺部（ 图2）上的可视化的巨转移。虽然在X-Gal染色也允许在其他器官， 原位灌注/固定的（微）转移的检测因为天然的血液和组织相关的颜色只是略有改善肺以外的组织中转移灶的可探测性这些器官13。即使灌注被定向到另一个器官， 例如肝脏，除去血液中仅部分地改善下注的对比度之间的X-Gal染色的天然颜色的器官。然而，该方法适用于任何类型的LacZ基因标记的肿瘤细胞，将显着改善的可探测性肺转移的电平下降到休眠状态的单细胞微转移，使宏观和微转移的一个简单的和可靠的定量。这种方法的一个限制是基于报告基因，包括荧光素酶和荧光蛋白质，和所有其他技术的转基因表达的稳定性。如在图2d所示，不是所有的肿瘤细胞内的macrometastatic灶被染成蓝色，表示缺乏β-半乳糖苷酶的活性。这可能是坏死，但它更可能是由于转基因表达的亏损。我们观察到，邓恩和LM8细胞中的表达lacZ和其他转基因的下调，即使在连续选择是非常有效的。因此，我们在近期的研究中切换到小鼠K12和K7M2和人力居屋，143B和SAOS-2骨肉瘤细胞株，都保持稳定的lacZ的表达在体外以及体内高达100％，随着时间的推移。
一旦保证稳定的lacZ的表达，这种技术可应用于研究基因操作的肿瘤细胞中， 例如 ，机械地调查过程中组织定植13以及用于开发和测试的新的治疗方法，旨在消除转移病灶15 ，16。此外，它可以作为一个基准放射成像技术，如PET，（微）CT和MRI，用于早期发现转移病灶的改善。在最近的PET研究（未出版），不同的示踪剂，我们验证在体内检测到肺转移随后的体外所描述的协议。在一个新的小动物微型CT（SKYSCAN）正在进行的研究是迄今为止AB文件在体内检测肺转移到的尺寸为0.5毫米，下降到0.3毫米的体外 ，但我们的目标是在一个分辨率为0.1毫米。有趣的是，这是宏观微转移的原位灌注，X-Gal染色相结合的方法，我们区分大小的限制。这再次彰显这个简单的和具有成本效益的技术的敏感性和有效性。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢他的意见，博士，Borsig Lubor（生理研究所，瑞士苏黎世大学）为肺灌注技术。这项工作是支持的Krebsliga的Kanton苏黎世，沃尔特·沃尔夫基金会和Johanna，苏黎世，的莉迪亚Hochstrasser基金会，苏黎世，瑞士国家科学基金会，SNF，瑞士法律组成的社团性质的Balgrist Schweizerischer，大学和补助苏黎世。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
| Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
| Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
| Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
| Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
| Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
| PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
| SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
| Nuclear-Fast Red - Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
| Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 | |
Table 1. Reagents and Equipment. |
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References
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