Summary
본 연구에서보고 된 소설 프로토콜 결합에 의한 마우스의 단일 셀 해상도로 폐 metastases의 선택적 검출 할 수 있습니다
Abstract
전이 암 유형의 대부분의 사망의 주요 원인과 암 연구에 따라서 주요 초점입니다. 그러나, radiologic 이미징 및 치료 퇴치의 성공에 의해 micrometastases의 검출이 제한 남아 있습니다.
동물 모델은 암 연구 1 귀중한 도구가 될 입증하고 있지만, 모니터링 / micrometastases의 시각화는 잠복기 연구의 도전과 전이성 확산의 부정확 한 평가를 잠재적으로 임상 실험 2에서 실망스러운 결과로 연결 남아 있습니다. 따라서, 마침내 정상 조직에있는 단일 세포 수준 metastases의 재현하고 안정적으로 감지 할 수 있도록 방법을 조정에 큰 관심이 있습니다. 주요 초점은 따라서 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로-CT), 양전자 방출 단층 촬영 장치 (PET), bioluminescence 또는 형광 이미징과 같은 생체에 종양 세포의 검출을 허용 기법,에 <> 3,4을 논의하게 될 것입니다. 현재 다른 osteosarcoma 모델의 기본 종양의 성장과 전이의 생체 모니터링에 대해 이러한 기술을 최적화하고 있습니다. 이러한 기술 중 일부는 qPCR 5, FACS 6 조직 학적 염색법의 다른 유형과 같은 고전적인 방법 옆에 전이의 예 생체 분석에 사용할 수 있습니다. 벤치 마크로서, 우리는 안정 transfection 또는 lacZ 유전자와 종양 세포의 형질 도입이 박테리아 효소 chromogenic 기판 5 - 브로 모 -4 - 클로로-3-인돌 릴 - 베타-D를 대사 β-갈 락토 인코딩 본 연구에서 설정 한 불용성 인디고 염료 7 여기에 표시된대로 단일 세포 수준에 마우스 조직 예를 생체 내 종양 세포의 매우 민감하고 선택 histochemical 파란 착색을 할 수 있습니다 투 - galactopyranoside (X-걸). 이 연구에 전이 8 정밀한 검증이 새로운 평가 할 수있는 저가의 장비를 많이 사용하지 도구입니다ticancer 요법 9-11. X-여자의 착색의 제한 요소는 잘 vascularized의 조직의 혈액 관련 붉은 얼룩을 지정할 수있는 낮은 콘트라스트입니다. 폐 조직에서이 문제가 인 시츄 폐 관류, 최근 Borsig 외 12. 혈액을 취소하고 아래 시츄에 문제를 해결하고 삽입 마취에서 마우스의 폐를 perfused에 의해 설립 된 기술로 해결 될 수 기관을 통해 인플레이션. 이 방법은 또한 폐의 붕괴를 방지함으로써 조직 학적 분석을위한 조직의 품질을 향상 기능 폐 폐포의 형태를 유지하고 있습니다. 본 연구에서 우리는 lacZ - 표현 종양 세포의 X-여자의 착색의 조합을 활용하고 인 시츄 살포 및 폐 조직의 고정. 새로운 프로토콜을 설명 이 세련된 프로토콜은 폐의 단일 전이성 세포의 높은 감도 감지 할 수 있습니다 및 D에 대한 최근의 연구에서 우리를 활성화원래 14 비 전이성로 설명 된 마우스 모델 13의 "휴지"폐 micrometastases를 etect.
Protocol
1.에서 시츄의 폐 관류 및 고정
- ~ 150 μl 인산염의 IP 주입하여 마우스를 마취는 생리가 (PBS) 112.5 밀리그램 / kg (체중) 케타민, 16.5 밀리그램 / kg xylazine, 15 밀리그램 / kg acepromazine (또는 적절한 진통제를 포함하는 다른 마취로).를 포함하는 버퍼
- 마우스 반사 신경이 더 이상 관찰되지 않을 때, 다시 다운 운영 테이블에 문제를 해결 아래로 매끄러운 머리카락에 70 %의 에탄올과 모피 젖었 어.
- 목으로 복부의 피부를 열고 측면에 당기거나 제거 할 수 있습니다.
- 충분한 크기로 복막과 가슴을 엽니 다. 이후 재관류의 감소 효율을 피하기 위해 큰 혈관의 파열 (예를 들면 베나의 jugularis) 방지합니다.
- 간 아래 대정맥 caudalis 잘라.
- 폐 완전히 흰색이며 때까지 뛰는 심장의 우심실로 천천히 10-15 ML PBS를 주입 24G 바늘 - 21G를 갖춘 20 ML의 주사기를 사용하여마음 (심장 수 축제) 박동을 멈 춥니 다.
- 혈관 클램프로 간, 횡경막 위의 혈관을 찔러.
- 오른쪽 심실로 PBS에 3 % paraformaldehyde의 ~ 2 ML (PFA)를 삽입 24G 바늘 - 21G를 갖춘 10 ML의 주사기를 사용합니다.
- 가슴 이외의 기관을 발견. 폐는 증가 될 때까지 기관에 PBS 두개골 (가슴 이외의)에 3퍼센트 PFA의 ~ 3 ML를 삽입 할 때 동일한 주사기를 사용합니다. 즉시 바늘을 제거 후 혈관 클램프로 펑크의 기관 꼬리를 찔러 및 고정 할 수 있도록 10 분 기다립니다.
- 혈관 클램프 위의 혈관을 가로로 쪼개다, 클램프를 제거하고 초과 PFA를 제거 할 수 우심실로 ~ 2 ML PBS를 삽입.
- 찔린 바늘이있는 모든 폐 엽 (叶)의 하단 부분은 기관에서 혈관 클램프를 제거하고의 PFA까지 첫 번째 구멍의 기관 꼬리에 중간 / PBS 1:1 삽입 PolyFreeze의 솔루션 3-5 ML를 삽입 공기가 신선한 빈터엽은 솔루션으로 대체됩니다.
- 집게로 마음을 당겨와 결합 조직 인대, 혈관 및 기관을 끊어 버렸네하여주의 깊게 폐를 제거합니다. 폐에 연결된 마음을 유지.
- 폐 조직 분석을 진행하는 방법에 따라 섹션 2 또는 3에 명시된 프로토콜로 진행합니다. 이 두 분석을 수행하려는 경우, 한 폐 엽을 제거하고 3에서 설명 된대로 진행합니다. 이 아래 설명 된대로 마음에 연결된 나머지 엽 (叶)을 처리합니다.
2. 전체 폐 엽 (叶)에 lacZ 태그 전이성 종양 세포의 시각화
- 단단히 닫는 뚜껑이있는 플라스틱 컵에 폐를 놓고 30-60 분 동안 실온에서 PBS에 2 %의 포름 알데히드로 해결할 수 있습니다.
- 고정 솔루션을 제거하고 PBS로 철저하게 3 회 씻는다.
- 갓 5 - 브로 모 -4 - 클로로-3-인돌 릴-β-D-galactoside (X-걸) 착색 솔루션 (X-걸 주식 솔루션 [40 MG / ML에서 조리 적어도 10 ML을 추가Dimethylformamide] 1시 40분 기본 착색 솔루션에 희석, pH를 7.1 (표 1), 빛으로부터 보호).
- 솔루션에 완전히 유지하고 공기의 교환을 허용하도록 포트에만 느슨하게 뚜껑을 배치 할 수있는 수영 폐의 상단에 거즈 조각을 놔.
- 빛으로부터 보호 3-5 시간에 37 ° C에서 알을 품다.
- X-걸 솔루션을 제거 잔류 X-걸 솔루션을 (선택 사항) 제거하고 4% PFA를 추가 할 수 PBS로 한 번 씻어.
3. 폐 Cryosections에 lacZ 태그 전이성 종양 세포의 시각화
- undiluted PolyFreeze 퍼가기 매체와 3분의 1에 미리 기입 표시 퍼가기 금형. 상단에있는 폐 엽을 넣고 엽이 완전히 덮여 때까지 매체를 삽입 따라 작성하십시오. 거품을 억제하기 위하여 노력하고 있습니다.
- 20 분에 4 ° C에 포함 된 폐를 품다.
- 그런 다음 -80 ° C.에 천천히 드라이 아이스와 이소 펜탄 및 매장의 혼합물에 포함 된 폐를 고정
- 7-10 μm cryo 잘라그라 이오 스탯에 섹션 및이 SuperFrostPlus 현미경 슬라이드에 올려 탑재합니다.
- humidified 챔버에서 24 시간에 ° C 37 X-걸의 착색 솔루션을 즉시 절을 품다.
- 증류수에 잠시 후 5 분에 있고 PBS 2 회에서 슬라이드를 씻어.
- , 10-30 초에 대한 핵 빠른 붉은 색과 반대 얼룩은 증류수에 씻어 Immu 마운트와 슬라이드를 탑재합니다.
4. 대표 결과
아사이 외. 높은 전이성 LM8 하위 세포 라인에서 파생 된 것과 다른 부모 던 세포에서 파생 된 SC 기본 종양, 저절로에서 감지 폐 metastases를 형성하지 않는 것이 던 - 파생 LM8 OS 마우스 모델에있는 원본 문서에보고 syngeneic C3H 마우스 14. 여기에보고 된 기술을, 우리는 Dunn/LM8 마우스 OS 모델의 metastases의 형성을 reinvestigated. 우리는 안정적인 lacZ-transduced 던과 LM8 셀을 이용했다s와 쥐의 시츄 폐 관류 및 고정을위한 프로토콜. 피하에 주입 쥐 perfused 및 비 perfused 폐의 대표 이미지 lacZ는 - transduced 및 제어 던과 LM8 세포를 그림 1에 표시됩니다 비 transduced. 제어 던 세포를 주입 생쥐에서 매크로 및 미세 metastases은 비 perfused와 perfused 폐 (그림 1A, I-IV)에 탐지가 남아 있었다. 그러나, 흥미롭게도, 던 - lacZ 세포와 함께 주입 마우스에 X-여자의 얼룩은 비 perfused 폐 (그림 1A, 누나)의 표면에 단일 세포 또는 작은 세포 클러스터 (<0.1 mm)의 푸른 micrometastatic foci을 공개했다. 인 폐의 현장 재관류와 고정 더욱 던-lacZ micrometastases (그림 1A, VIII)의 detectability을 개선. 그러나, 매크로 foci로 가지 (그림 1A, V, VII) 관찰되지 않았습니다. <이/ P>
반투명 제어 LM8 세포, 거의 감지 macrometastatic foci로 주입 마우스에 직경 0.1 mm보다 큰이 아닌 perfused 폐 (그림 1B, 난)에서 인정되었다. 폐의 재관류 (그림 1B, III)는 foci의 검출이 향상되지 않았다. 그러나, 쥐에서 여러 LM8-lacZ 세포를 주입 X-걸 스테인드 푸른 매크로 (그림 1B, V)와 micrometastases (그림 1B, 누나)가 아닌 perfused 장기의 표면에 발견되었다. 또한, 폐의 재관류는 추가의 detectability 매크로 및 micrometastases을 (- VIII 그림 1B, VII) 개선. 따라서, 마이크로 및 macrometastases은 주로 인해 장기의 표면 아래에 foci도 보게되었습니다 된 perfused 조직의 투명도에, 높은 밀도 및 더 많은에 표시되었다.
추가 H폐 조직의 cryosections를 사용하여 istological 분석 lacZ-transduced 던과 LM8 세포를 주입 쥐 폐 metastases의 개선 detectability을 확인했습니다. 던 - lacZ 또는 LM8-lacZ 세포에서 파생 된 주요 악성 종양으로 마우스에서 각각의 제어 세포, micrometastases 또는 단일 셀 foci의 주요 악성 종양으로 쥐와 달리 폐 섹션 (그림 2)에서 인정되었다. 또한, macrometastases 또한 제어 LM8 세포 (그림 2C, D)으로 주입 동물보다 LM8-lacZ 세포를 주입 쥐에 더 명확하게 볼 수 있었다.
그림 1.의 자연 metastases의 검색이 아닌 transduced (I-IV)와 lacZ는 - transduced (V-VIII) 던 (A)와 LM8 (B) 비 perfused (I, II, V, VI)와 perfused의 셀 C3H 마우스의 (3, 4, VII, VIII) 폐. 대표 X-걸 - 역에서 Metastasesined 전체 폐 (V, A와 B의 VII)와 각각의 클로즈업 (바이올렛에서 VIII A와 B) 파란색 표시됩니다. 비 태그 LM8 세포 (B에 I-IV)에 주입 쥐 기관의 Macrometastatic foci가 (> 0.1 mm) 별표로 표시됩니다. 클로즈업에 표시된 영역은 전체 폐에 대표입니다. 스케일 바는 전체 폐의 이미지에서 1 mm와 클로즈업의 0.1 mm를 표시합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 던과 폐 cryosections에 LM8 micrometastases의 감지. 10월 임베디드 폐 조직의 섹션은 humidified 챔버에서 24 시간에 37 ° C에서 X-걸의 착색 솔루션에 incubated하고 핵 빠른 빨간색으로 counterstained했다. 화살표 던-lacZ (B) 또는 LM8-lacZ 전지 (D)와 함께 주입 마우스의 폐 섹션에서 인정 micrometastatic foci를 가리 킵니다. 엠icrometastases가 아닌 transduced 던 (A) 또는 LM8 셀 (C)와 함께 주입 마우스의 폐 섹션에서 탐지가 남아 있었다. 스케일 바는 0.1 mm를 나타냅니다.
Discussion
Dunn/LM8 마우스 OS 모델의 여기에 제시된 결과는 인 시츄 재관류 / 폐 조직의 고정와 lacZ 태그 종양 세포의 X-걸의 착색을 결합 새로 설립 방법의 힘을 보여줍니다. 두 기술의 조합은 단일 세포 수준 micrometastatic 병변의 고감도 검출을 할 수 있으며, 폐 표면 (그림 1)뿐만 아니라 폐 섹션에서 (그림 2)에 macrometastases의 시각화을 향상시킵니다. X-걸의 얼룩도 있기 때문에 자연 혈액 및 조직 관련 색 다른 기관에서 시츄 재관류 / 고정의 (마이크로) metastases의 검출은 약간 폐 이외의 조직에서 전이성 foci의 detectability을 향상 할 수 있지만 이러한 기관 13. 재관류가 다른 기관에 전달됩니다 경우에도 간을 예를 들어, 혈액의 제거는 부분적으로 대비 베팅을 향상시킬기대하다 X-걸의 착색과 장기의 자연 색상입니다. 그러나, 방법은 lacZ 태그 종양 세포의 모든 종류에 적용됩니다, 극적 휴지 단일 셀 micrometastases의 수준에 폐 전이의 detectability을 개선하고, 매크로 및 micrometastases의 쉽고 신뢰할 수있는 정량화 수 있습니다. 이 방법과 루시 페라와 형광 단백질을 포함한 기자 유전자를 기반으로하는 다른 모든 기술의 한계는 transgene 표현의 안정성입니다. 그림 2D에 도시 된 바와 같이, macrometastatic foci 내 모든 종양 세포는 베타 갈 락토 활동의 부족을 나타내는 파란색 얼룩이 있습니다. 이 괴사에 관련된 될 수 있지만, 더 많은 가능성이 transgene 표현의 손실 때문입니다. 우리는 던과 LM8 세포가 표현에도 지속적인 선택에 따라 lacZ와 다른 transgenes의 다운 규제에 매우 효과적인 것을 관찰했다. 따라서 우리는 손쥐 K12에 최근의 연구에서 전환그리고 K7M2 모든 체외뿐만 아니라 최대 시간이 지남에 따라 100 % 생체 내 안정성 lacZ 식을 유지 인간의 호수, 143B와 미친-2 osteosarcoma 세포 라인.
lacZ 표현되면 안정이 보장되고,이 기법은 mechanistically 조직 식민지 13뿐만 아니라 전이성 병변 (15)의 근절을 목표로 새로운 치료법의 개발과 테스트 과정을 조사 할 예를 들어 유전자 조작 종양 세포와 연구에 적용 할 수 16. 또한, 전이성 병변의 조기 발견을 위해 사용되는 등 PET (마이크로) 중부 표준시와 MRI 등 최신 방사선 이미징 기술,의 개선을위한 벤치 마크 역할을 할 수 있습니다. 다른 추적기와 최근 PET 연구 (게시되지 않은)에서 우리는 생체 감지 폐에서의 설명 프로토콜 이후 전 생체을 metastases 확인했습니다. 새로운 작은 동물 마이크로-CT와 지속적인 연구에서는 (SkyScan) 우리가 지금까지 AB입니다르 0.5 mm 및 예 생체 다운 0.3 mm까지의 크기로 생체에 폐 metastases를 감지 할 수 있지만, 우리는 0.1 mm의 해상도로 목표로하고 있습니다. 흥미롭게도, 우리가 인 시츄 재관류와 X-걸의 착색의 결합 방법에 micrometastases 매크로에서 구별 할 설정 한 크기 제한입니다. 이 다시 쉽게하고 비용 효율적인 기술의 감도와 유용성을 강조.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 폐 관류의 기술에 대한 그의 조언 박사 Lubor Borsig을 (생리학 연구소, 취리히 대학) 감사드립니다. 이 작품은 Kanton 취리히 (Zurich)의 Krebsliga, 월터 L.와 요한나 늑대 재단, 취리히, 리디아 Hochstrasser 재단, 취리히, 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation), SNF, 스위스, Schweizerischer Verein Balgrist, 그리고 대학에서 보조금에 의해 지원되었다 취리히 (Zurich).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
| Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
| Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
| Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
| Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
| Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
| PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
| SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
| Nuclear-Fast Red - Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
| Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 | |
Table 1. Reagents and Equipment. |
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References
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