Summary
Den nya protokollet beskrivet i föreliggande studie tillåter selektiv detektering av lungmetastaser vid en enda cell upplösning i möss genom kombinerad
Abstract
Metastas är den främsta dödsorsaken i de flesta cancertyper och därmed en huvudsaklig inriktning inom cancerforskningen. Men att upptäcka mikrometastaser av radiologiska bildbehandling och framgång i deras terapeutiska utrotning förblir begränsad.
Medan djurmodeller har visat sig vara ett ovärderligt verktyg för cancerforskning 1 förblir övervakning / visualisering av mikrometastaser en utmaning och felaktig bedömning av metastatisk spridning i prekliniska studier potentiellt leder till dåliga resultat i kliniska prövningar 2. Följaktligen finns ett stort intresse för att förfina metoderna för att slutligen låta reproducerbar och tillförlitlig detektering av metastaser ner till en enda cell nivån i normal vävnad. Tyngdpunkten ligger därför på teknik som gör det möjligt att upptäcka tumörceller in vivo, som mikro-datortomografi (mikro-CT), positronemissionstomografi (PET), bioluminescens eller fluorescens avbildning <sup> 3,4. Vi är för närvarande att optimera dessa tekniker för in vivo övervakning av primär tumörtillväxt och metastas i olika osteosarkomceller modeller. Vissa av dessa tekniker kan också användas för ex vivo-analys av metastas bredvid klassiska metoder som qPCR 5, 6 FACS eller olika typer av histologisk färgning. Som ett riktmärke, har vi etablerat i föreliggande studie stabil transfektion eller transduktion av tumörceller med lacZ-genen som kodar det bakteriella enzymet β-galaktosidas som metaboliserar det kromogena substratet 5-brom-4-klor-3-indolyl-beta-D- -galaktopyranosid (X-Gal) till en olöslig indigo blått färgämne 7 och tillåter mycket känslig och selektiv histokemisk blå färgning av tumörceller i musvävnad ex vivo ned till en enda cell nivå som visas här. Detta är en låg kostnad och inte utrustning-intensiva verktyg som möjliggör exakt validering av metastaser 8 i studier bedömer nya enticancer terapier 9-11. En begränsande faktor X-gal-färgning är den låga kontrast till exempel blod-relaterade rödfärgning av väl vaskulariserade vävnader. I lungvävnad detta problem kan lösas genom in situ lunga perfusion, en teknik som nyligen inrättades av Borsig et al. 12 som perfunderades lungorna hos möss under anestesi för att rensa dem från blod och att fixa och bädda in dem på plats enligt inflationen genom luftstrupen. Denna metod förhindrar även kollapsen av lungan och därigenom bibehåller morfologin hos funktionella lunga alveoler, vilket förbättrar kvaliteten av vävnaden för histologisk analys. I föreliggande studie beskriver vi ett nytt protokoll, som tar fördel av en kombination av X-gal-färgning av lacZ-uttryckande tumörceller och in situ perfusion och fixering av lungvävnad. Denna raffinerade protokoll möjliggör högkänslig detektering av enstaka metastaserande celler i lungan och aktiverat oss i en färsk studie till detect "vilande" lung mikrometastaser i en musmodell 13, som ursprungligen beskrevs som icke-metastaserad 14.
Protocol
1. In-situ Lung perfusion och fixering
- Söva möss genom ip-injektion av ~ 150 pl fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 112,5 mg / kg (kroppsvikt) ketamin, 16,5 mg / kg xylazin och 15 mg / kg acepromazin (eller av en annan anestesi innehållande lämpliga smärtstillande).
- När reflexer av musen inte längre observeras, fixa det på operationsbordet back-ner och fukta pälsen med 70% etanol till slick håren ner.
- Öppna huden från buken upp till halsen och dra den åt sidorna eller ta bort den.
- Öppna bukhinnan och bröstkorgen till en riklig storlek. Förhindra bristningar av stora fartyg (t.ex. vena jugularis) för att undvika minskad effektivitet av den efterföljande perfusion.
- Skär hålvenen caudalis under levern.
- Använd en 20 ml spruta med en 21G - 24G nål för att injicera långsamt 10-15 ml PBS i den högra ventrikeln av pulserande hjärta tills lungorna är helt vit ochhjärtat slutar slå (asystoli).
- Nyp utanför blodkärlen ovanför levern och membranet med en vaskulär klämma.
- Använd en 10 ml spruta utrustad med en 21G - 24G nål för att injicera ~ 2 ml 3% paraformaldehyd (PFA) i PBS i den högra ventrikeln.
- Avslöja luftstrupen utanför bröstkorgen. Använd samma spruta för att injicera ~ 3 ml 3% PFA i PBS kraniala (utanför bröstkorgen) in i luftstrupen tills lungan blåses. Omedelbart efter avlägsnande av nålen, nypa bort luftstrupen kaudala av punktering med en vaskulär klämma och vänta i 10 minuter för att tillåta fixering.
- Transekt blodkärlen ovanför Kärlklämma, ta bort klämman och injicera ~ 2 ml PBS i höger kammare att avlägsna överskott PFA.
- Punktering de nedre delarna av alla lunglober med en nål, ta bort Kärlklämma på luftstrupen och injicera 3-5 ml av en lösning av PolyFreeze inbäddningsmedium / PBS 01:01 i luftstrupen kaudala första punktering tills PFA i lungalober ersättas med lösningen.
- Avlägsna försiktigt lungan genom att dra hjärtat med en pincett och genom transecting bindväv ligament, blodkärl och luftstrupe. Hålla hjärtat ansluten till lungorna.
- Beroende på hur man ska gå vidare med lungorna analysen fortsätter med protokollen som beskrivs i avsnitt 2 eller 3. Om du vill göra båda analyserna, ta bort en lunga lob och fortsätt enligt beskrivningen i 3. Behandla de återstående loberna är anslutna till hjärtat som beskrivs i 2.
2. Visualisering av lacZ-märkta metastatiska tumörceller i hela lunglober
- Placera lungan i en plast cup med tätt stängning lock och fäst den med 2% formaldehyd i PBS vid rumstemperatur under 30-60 min.
- Ta fixering lösning och tvätta noggrant 3 gånger med PBS.
- Tillsätt minst 10 ml nyberedd 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktosid (X-Gal) färglösningen (X-Gal förrådslösning [40 mg / ml iDimetylformamid] 1:40 utspädd i Basic färgningslösning, pH 7,1 (tabell 1), skydda mot ljus).
- Lägg en bit gasbinda ovanpå simning lunga för att hålla det helt i lösningen och placera locket endast löst på potten för att möjliggöra utbyte av luft.
- Inkubera vid 37 ° C under 3-5 timmar skyddad från ljus.
- Ta X-Gal-lösning, skölj en gång med PBS för att avlägsna återstående X-Gal-lösning (tillval) och tillsätt 4% PFA.
3. Visualisering av lacZ-märkta metastatiska tumörceller i lunga kryosnitt
- Prefill en märkt inbäddning mögel att 1/3 med outspädd PolyFreeze inbäddningsmedium. Sätt lunglob ovanpå och fyll upp med inbäddningsmedium tills loben är helt täckt. Försök att undvika bubblor.
- Inkubera de inbäddade lungorna vid 4 ° C under 20 minuter.
- Sedan frysa de inbäddade lungorna långsamt i en blandning av torr is och isopentan och lagra vid -80 ° C.
- Skär 7-10 um Cryoavsnitt på en kryostat och montera dem på SuperFrostPlus objektglas.
- Inkubera sektionerna omedelbart med X-gal-färgning lösning vid 37 ° C under 24 timmar i en fuktad kammare.
- Skölj objektglasen i PBS 2 gånger under 5 min och sedan snabbt i destillerat vatten.
- Counter-fläcken med kärnkraft snabb röd för 10-30 sekunder, spola i destillerat vatten och montera bilderna med im-Mount.
4. Representativa resultat
Asai et al. Rapporteras i den ursprungliga artikeln på Dunn-härledda LM8 OS-musmodell som sc primära tumörer härrörande från de parentala cellerna Dunn, skiljer sig från dem som härrör från den mycket metastatiska LM8 sub cellinje, inte spontant bildar detekterbara lungmetastaser i syngena C3H-möss 14. Med de här rapporterade teknikerna, förnyad undersökning vi bildningen av metastaser i de Dunn/LM8 mus OS modeller. Vi drog fördel av en stabil lacZ-transducerade Dunn och LM8 cells och ett protokoll för in-situ lung perfusion och fixering i möss. Representativa bilder av perfunderade och icke-perfuserade lungor hos möss subkutant injicerats med lacZ-transducerade och icke-transducerade kontroll Dunn och LM8 celler visas i figur 1. I möss som injicerats med kontroll Dunn celler förblev makroskopiska och mikroskopiska metastaser detekteras i icke-perfuserade och perfusion lungorna (figur 1A, I-IV). Men intressant, i möss som injicerats med Dunn-lacZ-celler, avslöjade X-gal-färgning blå mikrometastatiska foci av enskilda celler eller små kluster av celler (<0,1 mm) på ytan av icke-perfuserade lungor (figur 1A, VI). I situ perfusion och fixering av lungorna förbättrades ytterligare detekterbarheten av Dunn-lacZ mikrometastaser (Figur 1A, VIII). Emellertid utväxt till makroskopiska härdar observerades inte (Figur 1A, V, VII). </ P>
I möss som injicerats med kontroll LM8 celler, genomskinliga, knappt detekterbar macrometastatic foki större än 0,1 mm i diameter redovisades i icke-perfuserade lungor (figur 1B i). Perfusion av lungan (figur 1B, iii) inte förbättra upptäckten av fokus. I möss som injicerats med LM8-lacZ-celler flera X-Gal färgade blå makro-(Figur 1B, v) och mikrometastaser (figur 1B, VI) detekterades på ytan av icke-perfunderade organ. Dessutom förbättrades perfusion i lungorna vidare detekterbarheten av makro-och mikrometastaser (Figur 1B, VII - VIII). Följaktligen blev mikro-och macrometastases synlig vid en högre densitet och ett större antal, främst på grund av translucens av den perfunderade vävnaden, i vilken fokus under organytan blev också synliga.
En ytterligare timistological analys med kryosnitt av lungvävnad bekräftade den förbättrade detekterbarheten av lungmetastaser hos möss injicerade med lacZ-transducerade Dunn och LM8 celler. Hos möss med primära tumörer härrörande från Dunn-lacZ eller LM8-lacZ-celler, var till skillnad från i möss med primära tumörer respektive kontrollcellerna, mikrometastaser eller ens enstaka cell brännpunkter redovisas i lungsektioner (figur 2). Dessutom var macrometastases också mer tydligt i möss injicerade med LM8-lacZ-celler än hos djur som injicerats med kontrollen LM8 celler (Figur 2C, D).
Figur 1. Detektion av spontana metastaser av icke-transducerade (I-IV) och lacZ-transducerade (V-VIII) Dunn (A) och LM8 (B) celler i icke-perfuserade (I, II, V, VI) och perfunderades (III, IV, VII, VIII) lungor i C3H-möss. Metastaser i representativa X-Gal-staINED hela lungor (V, VII i A och B) och respektive närbilder (VI, VIII i A och B) visas i blått. Macrometastatic foci (> 0,1 mm) i organen hos möss injicerade med icke-märkta celler LM8 (I-IV i B) anges med asterisker. Områden som visas i närbild är representativa för hela lungorna. Skala staplar indikerar 1 mm i bilder av hela lungor och 0,1 mm i närbilder. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Detektion av Dunn och LM8 mikrometastaser i lung kryosnitt. Sektioner som ULT inbäddade lungvävnad inkuberades i X-gal-färgning lösning vid 37 ° C under 24 timmar i en fuktad kammare och därefter motfärgades med nukleärt snabb röd. Pilarna pekar på mikrometastatiska härdar redovisas i lungsektioner hos möss injicerade med Dunn-lacZ (B) eller LM8-lacZ-celler (D). Micrometastases förblev odetekterbar i lungsektioner hos möss injicerade med icke-transducerade Dunn (A) eller LM8 celler (C). Skala staplar indikerar 0,1 mm.
Discussion
De här presenterade resultaten i Dunn/LM8 mus OS modell visar kraften i det nybildade metod som kombinerar X-Gal färgning av lacZ-märkta tumörceller med in situ perfusion / fixering av lungvävnad. Denna kombination av de två teknikerna tillåter hög känslighet detektering av mikrometastatiska lesioner ned till enstaka cellnivå och även förbättrar visualisering av macrometastases på lungytan (figur 1) såväl som i lungsektioner (figur 2). Medan X-gal-färgning tillåter också detektering av (mikro) metastaser i andra organ, in situ perfusion / fixering förbättrar detekterbarheten av metastatiska härdar i andra vävnader än lungan endast något på grund av den naturliga blod-och vävnads-relaterad färg av dessa organ 13. Även om perfusionen riktas till ett annat organ, t.ex. lever, skulle avlägsnandet av blodet endast delvis förbättra kontrasten satsninglan X-Gal-färgning och den naturliga färgen på organet. Emellertid är metoden tillämpbar på varje typ av lacZ-märkta tumörceller, kommer att dramatiskt förbättra detekterbarheten av lungmetastas ned till nivån för vilande encelliga mikrometastaser och möjliggör en enkel och tillförlitlig kvantifiering av makro-och mikrometastaser. En begränsning av denna metod och alla andra tekniker som är baserade på reportergener, inklusive luciferas och fluorescerande proteiner, är stabiliteten hos transgen expression. Som visas i figur 2d, inte alla tumörceller inom macrometastatic fokus färgas blå, vilket indikerar en brist på beta-galaktosidasaktivitet. Detta kan vara relaterat till nekros, men det är mer sannolikt beror på en förlust av transgen expression. Vi observerade att Dunn och LM8 celler är mycket effektiva i nedreglering av lacZ och andra transgener även under kontinuerlig selektion för uttryck. Vi bytte därför nya studier till murina K12och K7M2 och de mänskliga HOS, 143B och Saos-2 osteosarkom cellinjer, som alla upprätthålls stabilt lacZ-uttryck in vitro såväl som in vivo upp till 100% över tiden.
När stabilt lacZ-uttryck garanteras, kan denna teknik användas i studier med gen-manipulerade tumörceller, t.ex. att mekanistiskt undersöka processen av vävnad kolonisering 13 samt för utveckling och testning av nya terapier som syftar till utrotning av metastaser 15 , 16. Dessutom kan det fungera som ett riktmärke för förbättringar av nuvarande radiologiska avbildningstekniker, såsom PET, (mikro) CT och MR, som används för tidig upptäckt av metastaser. I en nyligen PET-studie (opublicerad) med olika spårämnen vi verifierat in vivo detekterade lungmetastaser därefter ex vivo med den beskrivna protokollet. I en pågående studie med en ny liten djur mikro-CT (SkyScan) vi är så långt able att detektera lungmetastaser in vivo ned till en storlek av 0,5 mm och ex vivo ner till 0,3 mm, men vi strävar med en upplösning på 0,1 mm. Intressant nog är detta den storlek gräns som vi satt för att skilja makro-från mikrometastaser med den kombinerade metoden för in-situ perfusion och X-gal-färgning. Detta understryker återigen känslighet och nyttan av denna enkla och kostnadseffektiva teknik.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Lubor Borsig (Institutet för fysiologi vid universitetet i Zürich) för hans råd om teknik lungan perfusion. Detta arbete har finansierats med bidrag från Krebsliga i Kanton Zürich, Walter L. och Johanna Wolf Foundation, Zürich, Lydia Hochstrasser Foundation, Zürich, Swiss National Science Foundation, SNF, Schweiz, Schweizerischer Verein Balgrist, och universitetet i Zürich.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
| Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
| Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
| Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
| Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
| Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
| PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
| SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
| Nuclear-Fast Red - Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
| Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 | |
Table 1. Reagents and Equipment. |
|||
References
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature. 7, 645-658 (2007).
- Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. Science (New York, N.Y.). 295, 2387-2392 (2002).
- Fass, L. Imaging and cancer: a review. Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).
- Puaux, A. L. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538 (2011).
- Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models. Clinical & experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).
- Schmidt, C. M. Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry. Clinical & experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).
- Horwitz, J. P. Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides. J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).
- Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies. Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).
- Arlt, M. Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model. Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).
- Arlt, M. J. Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment. Cancer research. 66, 936-943 (2006).
- Banke, I. J. Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity. Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).
- Borsig, L. Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).
- Arlt, M. J. LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis. J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).
- Asai, T. Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung. International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).
- Arlt, M. J. The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity. International journal of cancer. , (2011).
- Steinmann, P. Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma. Cancer. , (2011).
