Summary
本文详细介绍了协议，在宫内electroporate大脑皮层和海马小鼠E14.5。我们还表明，这是一个有价值的方法来研究在这两个脑区的树突和刺。
Abstract
（IUE）为何在子宫内电已成为一个强大的技术来研究胚胎神经系统1-5不同地区的发展。迄今为止，这个工具已经被广泛用于研究调控细胞增殖，分化和神经细胞迁移，尤其是在发展中国家大脑皮层6-8。这里我们详细协议electroporate在子宫内的大脑皮质和海马和提供的证据表明，这种方法可以用来研究这两个脑区的树突和棘。
在原代培养神经元的可视化和操纵，有助于更好地理解到参与在树突棘和突触发展的进程。然而神经细胞在体外生长，没有接触到所有的生理线索，期间可能会影响正常发育枝和/或脊柱的形成和维护。我们的知识枝和脊柱结构
最后，IUE位置提供了一个有用的工具，以确定枝，脊椎和/或突触发育有关的基因之间的功能互动。事实上，在其他如病毒基因转移方法相比，它是直接结合多个RNA干扰或转基因细胞的相同人口。
总之，IUE位置是一个功能强大的方法，已经促成表征的脑功能和疾病背后的分子机制，也应该在树突棘的研究有用。
Protocol
在英国，老鼠被安置，繁殖，根据民政厅批准的指引下，动物（科学规程）行动1986年和治疗。
1。制备方法：DNA溶液和针头
- 马克西准备套件内毒素纯化质粒DNA。准备质粒DNA溶液注射到所需的浓度在水中，加快绿（终浓度为0.05％），可视化注射。电效率是高度依赖的DNA浓度。一般使用的浓度为1μg/μL。这个浓度是足够的可视化，而不会影响其发展的电穿孔神经元。然而，根据质粒载体使用的启动以及大小和（低表达水平与巨细胞病毒启动子/增强，较强的表达水平与巨细胞病毒立即早期增强子和鸡β-肌动蛋白启动子融合（CAG）启动）表达蛋白的稳定性，这个浓度可以调整（0.25微克/微升至5微克/微升）。
- 拉使用微量拔的玻璃针。
2。手术的制备
- 高压灭菌的手术器械和磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 准备在PBS（丁丙诺啡，Vetergesic的，终浓度为30微克/毫升）的镇痛解决方案。称重孕鼠注射手术前至少30分钟皮下注射0.1毫克/千克Vetergesic。在这段时间内，准备手术区。打开电热垫和恢复室。温水澡和无菌单上所有无菌文书和材料放置在无菌PBS。一个PBS填充烧杯放入铂电极和连接的electroporator。使用microloader尖端的DNA解决方案填补针，针连接毛细管人，和一个镊子掐针尖。
- 怀孕鼠标（E14.5-E15.5）麻醉与异氟醚氧载体中使用的麻醉诱导室（氧气2升/分钟）。等到失去翻正反射的动物。
- 动物转移到了“手术前”面具。每只眼睛上，以防止眼睛的角膜溃疡，而她的母亲是在全身麻醉下放置一个眼胶下降。使用电动剃须刀剃腹部的头发。清洁光头面积一次与clorhexidine收集飞行的头发。
- 转移动物在手术区的第二个面具。鼠标将其加热垫的背面。开始时，踏板的反射已经失去手术。
- 戴上口罩和无菌手套。覆盖无菌悬垂（用在腹部的小孔），以防止被污染的皮肤没有被剃光和消毒领域的组织和文书的动物。清洁光头区ţ至少与clorhexidine 3倍。每次使用不同的无菌棉签。使用手术刀，通过皮肤垂直切口，沿中线（1英寸长）。用剪刀沿白线（白线主要组成胶原蛋白的结缔组织），使类似的腹部肌肉的切口。
- 选择最方便的胚胎，并放置两个胚胎之间的环钳小心地拉出腹腔胚胎链。从这点上，用无菌预温PBS水合保持胚胎。
没有显微镜的可视化要求。
4。注射DNA和电
- 最外侧的胚胎开始，使其更容易追踪，其中胚胎进行电穿孔。不要拉太多的胚胎，因为这会增加出血的危险。内的羊膜囊使用环钳和操纵胚胎的位置稳定环之间胚胎头。轻轻挤推胚胎在子宫壁。
- 另一方面，采取毛细管持有人，并针对侧脑室半球的中间插入针仔细。按踏板注入约1μLDNA溶液混合，固绿（小于1μL研究树突）。你应该遵守的绿色染料，填补了侧脑室。关键步骤： - 锐利的针头刺破的关键正确的子宫壁。重要的是要尽量减少在子宫壁表面，入脑室后插入针的运动，因为孔的扩大将导致泄漏羊水和胚胎死亡。避免在子宫壁刺入血管，因为这会导致出血和胚胎死亡。
- 重要的是不要过大音量的DNA注入侧脑室，因为它会诱发脑积水（不超过2μL在E14.5）。根据实验的目的，调整的DNA量。如果1μL一般用于大多数实验使用，体积小的DNA（约0.5μL）枝和脊椎分析的需要。事实上，一些孤立的细胞都需要进行有针对性的，以可视化和测量电脉冲神经元的树突状乔木。 - 将胚胎头部两侧电极的正极（+）注射皮质电脑室或海马电注入脑室（ 图2）对面的同一侧的桨。然后申请在1秒的时间间隔电脉冲30V（持续时间为50毫秒）。关键的一步：避免应用电流通过胎盘，因为这将导致胚胎死亡。
在孕鼠的胚胎可以被电通常具有相同的DNA，构建以避免任何混淆。然而，长期以来手术减少 S的胚胎成活率。腹腔不应超过30分钟打开不再。
5。手术后的电
- 电穿孔的胚胎后，加入腹腔PBS及使用环钳，子宫角，以取代原来的位置。 Vicryl可吸收缝合线缝合腹壁及皮肤。
- 将在恢复室中的动物，直到它唤醒（通常5-10分钟），然后转移在笼子放置在加热垫。
6。手术后
检查小鼠的行为，以评估疼痛，痛苦或困扰，体重在手术后24小时和48小时的动物。如果需要，止痛药，可管理，以减少疼痛和不适。
7。组织处理
实验所需的胚胎或产后阶段收集的电穿孔胚胎或幼崽。
ove_content“ - 在萌芽阶段（例如，研究细胞增殖或迁移）分析：安乐死的母亲通过颈椎脱位，收集胚胎。斩首后，选择已妥善电穿孔的大脑，通过荧光信号的数量和位置，可视化整个使用荧光双眼的头骨。解剖的头骨和大脑修复一夜之间在4％的煤灰，然后在20％蔗糖/ PBS过夜的地方。在-80°C和部分使用恒温器嵌入华侨城化合物，冻结。
- 在产后阶段（例如，研究树突和刺）分析：
麻醉幼仔或成年小鼠腹腔注射戊巴比妥（40-60毫克/千克）和执行transcardial灌注PBS，4％，在PBS PFA。大脑解剖的头骨和修复后，在4％的煤灰隔夜。洗涤在PBS节的大脑后，使用vibratome（100微米的部分为Dendrite分析）。安装在Aqua聚/安装的部分，用0.16-0.19毫米厚的盖玻片形象树突和刺。
8。代表结果
图3显示了电穿孔细胞在CA1区（ 图3C，D）的齿状回海马（ 图3E，F）的，在大脑皮质（ 图3A，B）的例子。野生型小鼠在E14.5与GFP的构造（PCA-B-EGFPm5消音器3），并在产后天（P）14收获的大脑电穿孔。注射1 DNA溶液的小体积（0.5μL或解决方案少1微克/微升），少数细胞被标记，允许在孤立的绿色荧光蛋白+细胞（ 图3）以及他们的棘树突状树枝状的可视化在更高的放大倍率（ 图4）。
<强>图1。电协议，可以用来研究树突和棘示意图。 （一）建设GFP的电穿孔，比较野生型和突变小鼠的树突棘。 （二）绿色荧光蛋白基因的shRNA（GFP是从相同的结构表示）电穿孔比较电穿孔用的shRNA的小鼠树突和棘建设的具体利益的基因（X）或控制的shRNA。 （三）IUE位置可以用Cre重组酶诱导系统一起，以限制的shRNA表达可取一段时间。在这个实验中，表达载体形式的Cre重组酶可以激活4 -羟基（CAG-ER T2 CreER T2的 ; 1微克/微升）10，被用在Cre重组酶依赖特异性shRNA表达载体电穿孔方式（1微克/微升，与重组指标（CALNL-GFP结构，绿色荧光蛋白表达诱导的Cre; 1微克/微升）10效率CY的击倒shRNA的浓度增加，以及增加造影-ER T2 CreER T2的浓度可以提高。
图2。电空间的控制。这个数字显示定位桨根据DNA注射部位的电极，以针对大脑皮层或海马。
图3。 在子宫内的树突状乔木可视电穿孔细胞在大脑皮层和海马。 （甲，乙）显示绿色荧光蛋白+在大脑皮质锥体细胞，海马CA1锥体细胞（光盘版）和（，E，F），在齿状回颗粒细胞在P14的日冕部分。 GFP的构造（PCA-B-EGFPm5消音器3）在E14.5电穿孔。高放大倍率的照片（B，D F）的显示IUE位置，是一种有效的方法来可视化的树突。比例尺（B，D和F）的代表50微米，150微米（A，C）。
图4。可视化表达构建绿色荧光蛋白在E14.5 在子宫内 ，进行电穿孔的P14的神经元的树突棘。 （甲，乙）从基础的海马锥体神经元树突棘的高倍率图像。标尺代表5微米（A）和2微米（乙）。
Discussion
IUE位置是一个功能强大的工具来操纵基因的表达，不仅在空间上，而且在时间。在这里，我们表明，这种技术可以用于可视化和基因操纵树突棘在小鼠大脑皮层和海马。除了前面提到的优点，值得一提的是，IUE位置，在高尔基方法的对比，可以用免疫组化或原位杂交，例如电穿孔细胞型允许结合。同样重要的是提到，此过程不会引起明显脑畸形，尽管它相对的侵袭。此外，在细胞水平上，IUE位置不修改13神经元的电穿孔的电生理特性。虽然我们的枝和脊椎形态的可视化示范重点，在E14.5皮质或海马神经元IUE位置也用于研究其他发展活动，如轴突的形成和指导。在添加ition，同一种协议，可以实现在胚胎发育的其他阶段，针对不同的人群。例如，在E18.5发育很晚皮质电范式可以驾驶1星形细胞祖细胞中的表达。同样，而在E14.5海马电允许同时针对海马CA1-CA3区锥体神经元祖细胞和齿状回颗粒细胞祖，后期海马电（E18.5或产后早期）将允许针对不同的齿状回祖14。在这种情况下，DNA的注射量可以增加以及电流强度。
IUE位置由引进的转基因似乎仍然附加体式，并因此失去了连续的细胞分裂后的细胞。然而，在分裂后的细胞，如神经元，附加体式转基因保持活跃后电击使长期研究13个月15。在我们的研究中，我们已经观察到明亮的绿色荧光蛋白+细胞7周后出生（我们分析了最新的时间点），表明胚胎针对使用IUE位置从早期发育时间点的结果，在转基因持续表达的皮质或海马神经元前体到成年。
目前的技术限制，这是很难施加罚款的电穿孔细胞总数控制。然而，我们的DNA溶液注入量减少，表明它是可能标注少数细胞和树突状树枝状可视化的孤立的GFP +细胞以及他们的刺。转染面积的尺寸，也可以通过修改如电流和脉冲数或电桨直径强度的电参数调整。
共有IUE位置是很容易实现，快速的方法，高效和体内研究树突棘。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
笔者想感谢他们的帮助凯瑟琳·马瑟斯博士，博士让-菲利普·Mocho和约兰达·萨维德拉托雷斯博士在宫内电执行无菌程序下，海莉木对她的帮助下准备的图纸。
支持的EP是由长期的欧洲生化学会联合会（FEBS）奖学金和医学研究理事会（MRC）的职业发展奖学金，MAH的威康信托基金赠款到伊丽莎白费舍尔和维克多Tybulewicz（080174/B/06/Z） ，硬件由欧洲分子生物学长短期奖学金和RA MRC的助学金。这项工作得到了从威康信托基金会（086947/Z/08/Z）项目赠款，由格兰特在急救医学研究理事会（U117570528）福源
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of needles and DNA solution for injection | |||
| Endofree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Fast Green | Sigma | F-7258 | |
| Borosilicate glass capillaries 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D. |
Harvard Apparatus | 30-0016 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For Eppendorf pipettes 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl |
| Material for surgery | |||
| Extra thin Iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Vicryl absorbable suture | Ethicon Inc (Johnson Johnson) | W9074 | |
| Sterile drapes 30cm x 45 cm | Buster | 141765 | |
| Sterile swabs | Shermond | HUBY-340 | |
| Cotton buds | Clean Cross Co., Ltd | 1860 | |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Alstoe Animal Health | ||
| Clorhexidine | Vetasept | XHG007 | |
| Eye gel Viscotears | Novartis | ||
| Isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | |
| Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20% | Animalcare | ||
| Electroporation | |||
| Electroporator | BTX | ECM830 | |
| Platinum Tweezertrode 5mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0489 | |
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 5247000030 | |
| Foot Control for Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5247623002 | |
| Capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | |
| Tissue processing | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Sucrose | VWR (Prolabo) | 27480.294 | |
| Microscope slides | ThermoScientific (Menzel-Gläser) | J1800AMNZ | |
| Coverslips | Menzel-Gläser | 22 x 50 mm #1,5 | |
| Aqua Poly/mount | Polysciences, Inc | 18606 | |
References
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