Summary
इस लेख में विस्तार से utero में मस्तिष्क प्रांतस्था और चूहों में E14.5 में हिप्पोकैम्पस electroporate प्रोटोकॉल का वर्णन है. हम यह भी पता चलता है कि यह एक मूल्यवान dendrites और कांटा के लिए इन दोनों क्षेत्रों में मस्तिष्क का अध्ययन विधि है.
Protocol
यूनाइटेड किंगडम में, चूहों रखे हैं, नस्ल, और पशु (साइंटिफिक प्रक्रिया) अधिनियम, 1986 के अंतर्गत गृह कार्यालय द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार इलाज किया.
1. तैयारी: डीएनए समाधान और सुई
- प्लास्मिड डीएनए एक endotoxin मुक्त किट मैक्सी प्रस्तुत करने के साथ शुद्ध. पानी में वांछित सांद्रता के इंजेक्शन के लिए प्लास्मिड डीएनए समाधान तैयार है और तेजी से ग्रीन (0.05% की अंतिम एकाग्रता) को इंजेक्शन कल्पना. electroporation की दक्षता उच्च डीएनए एकाग्रता पर निर्भर है. 1 μg / μl के एक एकाग्रता के आम तौर पर प्रयोग किया जाता है. यह एकाग्रता के लिए उनके विकास को प्रभावित किए बिना electroporated न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए पर्याप्त है. हालांकि, प्लाज्मिड वेक्टर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आकार और (cytomegalovirus प्रमोटर / बढ़ाने, cytomegalovirus तत्काल जल्दी बढ़ाने और चिकन β-actin के प्रमोटर संलयन (सीएजी) प्रमोटर के साथ मजबूत अभिव्यक्ति के स्तर के साथ अभिव्यक्ति के स्तर को कम) में इस्तेमाल किया प्रमोटर के अनुसार प्रोटीन व्यक्त की स्थिरता, यह एकाग्रता (0.25 μg μl / 5 / μg μl) समायोजित किया जा सकता है.
- गिलास एक micropipette डांड़ी का उपयोग कर सुई खींच.
2. सर्जरी की तैयारी
- सर्जिकल उपकरणों और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) आटोक्लेव.
- पीबीएस (Buprenorphine, Vetergesic, 30 / μg मिलीलीटर के अंतिम एकाग्रता) में एनाल्जेसिक समाधान के तैयार हो जाओ. गर्भवती माउस वजन और सर्जरी से पहले कम से कम 30 मिनट के 0.1 subcutaneously किलो मिलीग्राम / Vetergesic की सुई. इस समय के दौरान, शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार करते हैं. हीटिंग पैड और वसूली कक्ष पर बारी. गर्म पानी से स्नान और बाँझ बाँझ पर्दे पर सभी उपकरणों और सामग्री में बाँझ पीबीएस रखें. एक PBS भरे बीकर में प्लैटिनम इलेक्ट्रोड प्लेस और electroporator करने के लिए कनेक्ट. डीएनए एक microloader टिप का उपयोग कर समाधान के साथ सुई भरें, केशिका धारक के लिए सुई से कनेक्ट और एक संदंश के साथ सुई की नोक चुटकी.
- ऑक्सीजन वाहक में isoflurane (2 ऑक्सीजन एल / मिनट) एक संवेदनाहारी शामिल कक्ष का उपयोग कर के साथ एक गर्भवती माउस (E14.5 E15.5) बेहोश करना. रुको जब तक पशु प्रतिवर्त ठीक खो देता है.
- एक "पूर्व सर्जरी" मुखौटा जानवर स्थानांतरण. प्रत्येक आंख आँखों का कॉर्निया व्रणोत्पत्ति रोकने के लिए जब माँ सामान्य संज्ञाहरण के अंतर्गत है पर आँख जेल की एक बूंद रखें. एक बिजली के रेजर का उपयोग करने के लिए पेट के बाल दाढ़ी. मुंडा क्षेत्र एक बार साफ clorhexidine उड़ान बाल लेने के साथ.
- पशु शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में एक दूसरे का मुखौटा करने के लिए स्थानांतरण. हीटिंग पैड पर अपनी पीठ के साथ माउस रखें. सर्जरी जब पेडल पलटा खो गया है शुरू करो.
- मुखौटा और बाँझ दस्ताने पर रखो. एक बाँझ कपड़ा (पेट के ऊपर एक छोटे छेद के साथ) के लिए त्वचा के क्षेत्रों कि और मुंडा नहीं है कीटाणुरहित द्वारा दूषित होने से रोकने के ऊतकों और उपकरणों के साथ पशु कवर. मुंडा क्षेत्र साफ एककम से कम clorhexidine साथ 3 बार. एक अलग बाँझ कपास झाड़ू से साफ़ करना हर समय का उपयोग. एक स्केलपेल का उपयोग त्वचा के माध्यम से midline (~ 1 इंच लंबे) के साथ एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाने के लिए. कैंची का प्रयोग, linea अल्बा (सफेद लाइन कोलेजन संयोजी ऊतक के ज्यादातर से बना) के साथ पेट की मांसपेशियों की एक समान चीरा बनाते हैं.
- सबसे सुलभ भ्रूण चुनें और दो भ्रूण के बीच अंगूठी संदंश जगह है और ध्यान से उदर गुहा के बाहर भ्रूण चेन खींच. इस बिंदु पर से, भ्रूण बाँझ पूर्व गर्म पीबीएस के साथ hydrated रखने के.
कोई माइक्रोस्कोप दृश्य के लिए आवश्यक है.
4. डीएनए और electroporation इंजेक्शन
- सबसे पार्श्व भ्रूण के साथ शुरू करो, यह आसानी से ट्रैक जिसमें से भ्रूण electroporated गया रखने के लिए बना. भ्रूण पर बहुत ज्यादा नहीं खींच के रूप में इस रक्तस्राव का खतरा बढ़ जाएगा. एमनियोटिक थैली का उपयोग अंगूठी संदंश और अंदर भ्रूण की स्थिति में हेरफेरके छल्ले के बीच भ्रूण के सिर को स्थिर. धीरे निचोड़ करने के लिए भ्रूण गर्भाशय की दीवार के करीब धक्का.
- दूसरी ओर, केशिका धारक और सुई को पार्श्व निलय लक्ष्य गोलार्द्ध के बीच में ध्यान से सम्मिलित है. पेडल प्रेस डीएनए फास्ट ग्रीन (1 कम से कम dendrites के अध्ययन μl) के साथ मिश्रित समाधान के लगभग 1 μl इंजेक्षन. आप हरे रंग की डाई पार्श्व निलय भरने का पालन करना चाहिए. महत्वपूर्ण कदम: सुई के तीखेपन बेध करने के लिए महत्वपूर्ण ठीक से गर्भाशय की दीवार है. यह गर्भाशय की दीवार की सतह पर और निलय में प्रविष्टि के बाद सुई के आंदोलन को कम महत्वपूर्ण है क्योंकि छेद के एक इज़ाफ़ा amniotic द्रव और भ्रूण मौत के रिसाव में परिणाम देगा. भेदी गर्भाशय की दीवार में रक्त वाहिकाओं से बचें, के रूप में यह खून बह रहा है और भ्रूण मृत्यु में परिणाम देगा.
- यह महत्वपूर्ण है पार्श्व निलय में डीएनए के एक बहुत बड़ी मात्रा इंजेक्षन नहीं है क्योंकि यह प्रेरित करेगाजलशीर्ष (2 μl E14.5 में अधिक नहीं). डीएनए की मात्रा के प्रयोग के प्रयोजन के अनुसार समायोजित किया गया है. यदि 1μl आम तौर पर ज्यादातर प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है, डीएनए (लगभग 0.5 μl) की एक छोटी मात्रा dendrite और रीढ़ की हड्डी विश्लेषण के लिए आवश्यक है. वास्तव में कुछ अलग कोशिकाओं के लिए आदेश में करने के लिए कल्पना और उपाय electroporated न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान कुंज लक्षित करने की आवश्यकता है. - भ्रूण सिर के पक्षों पर इलेक्ट्रोड निलय प्रांतस्था electroporation के लिए इंजेक्शन के रूप में या हिप्पोकैम्पस electroporation के लिए इंजेक्शन वेंट्रिकल (चित्रा 2) के विपरीत पक्ष पर एक ही पक्ष पर सकारात्मक चप्पू (+) के साथ रखें. तब 1 सेकंड के अंतराल पर पांच 30V बिजली दालों (50 मिसे अवधि) लागू. महत्वपूर्ण कदम: नाल भर में वर्तमान लागू करने से बचें के रूप में इस भ्रूण की मौत में परिणाम होगा.
एक गर्भवती माउस में सभी भ्रूण आम तौर पर एक ही डीएनए के साथ, electroporated किसी भी भ्रम से बचने के लिए निर्माण कर सकते हैं. हालांकि, एक लंबे सर्जरी कमी भ्रूण के जीवित रहने की दर है. उदर गुहा अब 30 मिनट से अधिक नहीं खोला जाना चाहिए.
5. पोस्ट electroporation सर्जरी
- बाद भ्रूण electroporating, उदर गुहा में पीबीएस जोड़ने और अंगूठी संदंश का उपयोग करने के लिए अपने मूल स्थान में गर्भाशय सींग की जगह. पेट और Vicryl absorbable sutures के साथ दीवार त्वचा सीवन.
- वसूली कक्ष में पशु रखें जब तक यह उठता है (आमतौर पर 5-10 मिनट) और फिर एक हीटिंग पैड पर रखा पिंजरे में स्थानांतरण.
6. सर्जरी के बाद
चूहों के व्यवहार की जाँच के लिए दुख, दर्द या संकट का आकलन करने के लिए और सर्जरी के बाद 24 घंटे और 48 घंटे के जानवरों को तौलना. यदि आवश्यक हो, दर्दनाशक दवाओं दर्द और परेशानी को कम करने के लिए प्रशासित किया जा सकता है.
7. ऊतक प्रसंस्करण
Electroporated भ्रूण या पिल्ले भ्रूण या प्रसव के बाद प्रयोग के लिए आवश्यक चरणों में ले लीजिए.
ove_content "> - भ्रूण चरणों में (उदाहरण के लिए सेल प्रसार या प्रवास का अध्ययन करने के लिए) में विश्लेषण के लिए:Euthanize गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था के माध्यम से माँ और भ्रूण इकट्ठा. कत्ल के बाद, दिमाग है कि ठीक से electroporated का चयन करें, के रूप में राशि और फ्लोरोसेंट संकेत के स्थान से संकेत, एक फ्लोरोसेंट द्विनेत्री का उपयोग कर खोपड़ी भर में कल्पना. खोपड़ी के मस्तिष्क काटना और 4% पीएफए में रात को ठीक करने के लिए और फिर 20% sucrose / रातोंरात पीबीएस में जगह. -80 अक्टूबर यौगिक, फ्रीज में एम्बेड डिग्री सेल्सियस और अनुभाग एक cryostat का उपयोग कर के.
: प्रसवोत्तर चरणों (उदाहरण के लिए dendrites और कांटा का अध्ययन करने के लिए) पर विश्लेषण के लिए
चतनाशून्य करना intraperitoneal इंजेक्शन pentobarbitone (40-60 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ पिल्ले या वयस्क चूहे और पीबीएस, पीबीएस में 4% पीएफए के बाद के साथ transcardial छिड़काव करते हैं. दिमाग और 4% पीएफए रात भर में परसर्ग खोपड़ी के टुकड़े करना. पीबीएस, अनुभाग दिमाग में धोने (vibratome घ के लिए 100 माइक्रोन वर्गों का उपयोग करने के बादविश्लेषण endrite). एक्वा पाली / माउंट में वर्गों माउंट छवि dendrites और कांटा करने के लिए 0.16-0.19 मिमी मोटी coverslips के का उपयोग कर.
8. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 3 electroporated कोशिकाओं के मस्तिष्क प्रांतस्था (आंकड़े 3A, बी) में CA1 (आंकड़े -3 सी, डी) में और हिप्पोकैम्पस की दांतेदार गाइरस (3E आंकड़े, एफ) में, उदाहरण दिखाता है. प्रकार के जंगली चूहों E14.5 GFP (पीसीए-B-EGFPm5 रवशामक 3) का निर्माण और दिमाग प्रसव के बाद (पी) दिन में 14 पर काटा गया के साथ electroporated गया. डीएनए समाधान की एक छोटी मात्रा (0.5 μl या 1 μg / μl में एक समाधान के कम) इंजेक्शन लगाने के द्वारा, कुछ कोशिकाओं को लेबल कर रहे हैं, जो अलग GFP + कोशिकाओं (चित्रा 3) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उनके spines के वृक्ष के समान द्रुमायण के दृश्य की अनुमति देता है उच्च बढ़ाई (चित्रा 4).
<मजबूत> 1 चित्रा electroporation प्रोटोकॉल है कि dendrites और कांटा अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (ए) GFP की electroporation जंगली और प्रकार उत्परिवर्ती चूहों में dendrites और कांटा तुलना निर्माण. (बी) GFP shRNA (GFP ही निर्माण से व्यक्त किया है) के की electroporation dendrites और एक shRNA साथ electroporated चूहों में कांटा की तुलना करने के लिए निर्माण ब्याज की एक जीन (एक्स) या नियंत्रण shRNA के लिए विशिष्ट. (सी) IUE Cre inducible प्रणाली के साथ एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है क्रम में करने के लिए वांछनीय समय अवधि के लिए shRNA की अभिव्यक्ति को सीमित. इस प्रयोग में, एक सदिश Cre recombinase जो 4 hydroxytamoxifen द्वारा सक्रिय किया जा सकता है की एक फार्म व्यक्त (सीएजी ईआर CreER टी 2 टी 2, 1 μg / μl) 10, एक साथ एक Cre निर्भर में एक विशिष्ट shRNA व्यक्त वेक्टर के साथ electroporated है (1 μg / μl, एक पुनर्संयोजन (CALNL GFP का निर्माण, GFP अभिव्यक्ति inducible Cre द्वारा सूचक साथ और तरीके से, 1 μg / μl) 10 efficien.पछाड़ना की cy shRNA की एकाग्रता में वृद्धि के रूप में अच्छी तरह के रूप में सीएजी ER-टी 2 CreER टी 2 एकाग्रता बढ़ाने के द्वारा सुधार किया जा सकता है.
चित्रा 2 electroporation की स्थानिक नियंत्रण. यह आंकड़ा से पता चलता है जहां डीएनए इंजेक्शन साइट के अनुसार क्रम में मस्तिष्क प्रांतस्था या हिप्पोकैम्पस लक्ष्य चप्पू इलेक्ट्रोड की स्थिति है.
चित्रा utero में वृक्ष के समान कुंज की 3. विज़ुअलाइज़ेशन मस्तिष्क प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस में कोशिकाओं electroporated. (ए, बी) कोरोनल वर्गों + GFP प्रमस्तिष्क प्रांतस्था में पिरामिड कोशिकाओं, CA1 हिप्पोकैम्पस में (सीडी) पिरामिड कोशिकाओं और (ई, एफ), ग्रेन्युल कोशिकाओं दांतेदार गाइरस में p14 पर दिखा. एक GFP निर्माण (पीसीए-B-EGFPm5 3 रवशामक) E14.5 electroporated किया गया था. उच्च बढ़ाई (चित्रबी, डी, एफ) बताते हैं कि IUE dendrites कल्पना करने के लिए एक कुशल तरीका है. स्केल सलाखों 50 (बी, डी और एफ) माइक्रोन 150 माइक्रोन (ए, सी, ई) का प्रतिनिधित्व करते हैं.
चित्रा 4 p14 न्यूरॉन्स में वृक्ष के समान spines कि utero में E14.5 पर निर्माण व्यक्त GFP साथ electroporated थे विज़ुअलाइज़ेशन. (ए, बी) hippocampal pyramidal न्यूरॉन्स की बेसल dendrites से कांटा के उच्च बढ़ाई छवियों. स्केल सलाखों 5 (ए) माइक्रोन और 2 माइक्रोन (बी) का प्रतिनिधित्व करते हैं.
Discussion
IUE अंतरिक्ष में ही नहीं बल्कि समय में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. हम यहाँ दिखाने के लिए कि इस तकनीक के लिए कल्पना और आनुवंशिक हेरफेर और dendrites चूहों के मस्तिष्क प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस में कांटा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पहले से उद्धृत लाभ के अलावा, यह ध्यान देने योग्य बात है कि IUE, विधि Golgi करने के लिए इसके विपरीत में, immunohistochemistry साथ या स्वस्थानी संकरण जो फेनोटाइप करने के लिए electroporated कोशिकाओं उदाहरण के लिए अनुमति देता है में जोड़ा जा सकता है लायक है. यह भी महत्वपूर्ण है उल्लेख है कि इस प्रक्रिया स्पष्ट मस्तिष्क विरूपताओं को उसके रिश्तेदार के invasiveness के बावजूद प्रेरित नहीं करता. इसके अलावा, सेलुलर स्तर पर, IUE electroporated 13 न्यूरॉन्स की electrophysiological गुण संशोधित नहीं करता है. हालांकि हमारे प्रदर्शन dendrite और रीढ़ morphologies के दृश्य पर ध्यान केंद्रित, E14.5 पर cortical या hippocampal न्यूरॉन्स की IUE भी अक्षतंतु गठन और मार्गदर्शन के रूप में इस तरह के अन्य विकासात्मक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जोड़ने मेंition, प्रोटोकॉल के एक ही प्रकार के भ्रूण के विकास के अन्य चरणों में लागू किया जा सकता है विभिन्न आबादी को लक्षित है. उदाहरण के लिए, एक developmentally बहुत देर cortical E18.5 में electroporation प्रतिमान को astrocytic 1 progenitors में अभिव्यक्ति ड्राइव किया जा सकता है. इसी प्रकार, जबकि E14.5 में हिप्पोकैम्पस के एक electroporation CA1 - CA3 पिरामिड, न्यूरॉन progenitors और दांतेदार ग्रेन्युल सेल पूर्वज एक ही समय में लक्षित करने की अनुमति देता है, एक देर hippocampal electroporation (E18.5 या जल्दी प्रसव के बाद) के लिए विभिन्न दांतेदार ग्रेन्युल लक्ष्य की अनुमति होगी 14 progenitors. इस मामले में, वर्तमान की तीव्रता के रूप में डीएनए की मात्रा इंजेक्शन के रूप में अच्छी तरह से बढ़ सकता है.
IUE द्वारा शुरू transgenes episomal रहना दिखाई देते हैं और इसलिए कर रहे हैं कोशिकाओं लगातार कोशिका विभाजन के बाद से खो दिया है. न्यूरॉन्स के रूप में postmitotic कोशिकाओं में, तथापि, episomal transgenes महीने के लिए सक्रिय electroporation के बाद लंबे समय तक अध्ययन 13 अनुमति रहना15,. हमारे अध्ययन में, हम उज्ज्वल + GFP कोशिकाओं मनाया जन्म के बाद 7 सप्ताह (नवीनतम समय बिंदु हम विश्लेषण) कि भ्रूण का संकेत cortical या hippocampal neuronal transgene की लगातार अभिव्यक्ति में IUE परिणाम जल्दी विकास के समय अंक से ऊपर का उपयोग कर व्यापारियों के लक्ष्य के लिए वयस्कता के लिए.
तकनीक का एक वर्तमान सीमा है कि यह मुश्किल है electroporated कोशिकाओं की कुल संख्या से अधिक ठीक नियंत्रण लागू है. हालांकि, डीएनए समाधान के इंजेक्शन की मात्रा कम करके, हम पता चला है कि यह संभव है कुछ कोशिकाओं लेबल और अलग GFP + कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से उनके spines के वृक्ष के समान द्रुमायण कल्पना. ट्रांसफ़ेक्ट क्षेत्र के आयाम भी वर्तमान और दालों की संख्या या electroporation paddles के व्यास की तीव्रता के रूप में electroporation की पैरामीटर संशोधित करके समायोजित किया जा सकता है.
कुल मिलाकर IUE एक तरीका है कि लागू करने के लिए आसान, तेजी से है औरकुशल और dendrites vivo में कांटा अध्ययन.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए उनकी मदद के लिए धन्यवाद डा. कैथलीन Mathers, डा. जीन फिलिप Mocho और डा. योलान्डा Saavedra Torres सड़न रोकनेवाला प्रक्रियाओं के तहत utero electroporation में प्रदर्शन चाहते हैं, और चित्र तैयार करने के लिए उसकी मदद के लिए हेली लकड़ी.
EP यूरोपीय बायोकेमिकल सोसायटी के एक लंबे समय तक संघ (FEBS) फैलोशिप और वेलकम ट्रस्ट अनुदान द्वारा एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद (MRC) कैरियर के विकास फैलोशिप, महिंद्रा से एलिजाबेथ फिशर और विक्टर Tybulewicz के (080174/B/06/Z) द्वारा समर्थित किया गया था , HW से एक EMBO दीर्घकालिक फैलोशिप और एक MRC छात्रावस्था द्वारा आरए द्वारा. यह काम वेलकम ट्रस्ट 086947/Z/08/Z () से एक परियोजना अनुदान और अनुदान सहायता के लिए चिकित्सा अनुसंधान परिषद (U117570528) से FG द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of needles and DNA solution for injection | |||
| Endofree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Fast Green | Sigma | F-7258 | |
| Borosilicate glass capillaries 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D. |
Harvard Apparatus | 30-0016 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For Eppendorf pipettes 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl |
| Material for surgery | |||
| Extra thin Iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Vicryl absorbable suture | Ethicon Inc (Johnson Johnson) | W9074 | |
| Sterile drapes 30cm x 45 cm | Buster | 141765 | |
| Sterile swabs | Shermond | HUBY-340 | |
| Cotton buds | Clean Cross Co., Ltd | 1860 | |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Alstoe Animal Health | ||
| Clorhexidine | Vetasept | XHG007 | |
| Eye gel Viscotears | Novartis | ||
| Isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | |
| Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20% | Animalcare | ||
| Electroporation | |||
| Electroporator | BTX | ECM830 | |
| Platinum Tweezertrode 5mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0489 | |
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 5247000030 | |
| Foot Control for Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5247623002 | |
| Capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | |
| Tissue processing | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Sucrose | VWR (Prolabo) | 27480.294 | |
| Microscope slides | ThermoScientific (Menzel-Gläser) | J1800AMNZ | |
| Coverslips | Menzel-Gläser | 22 x 50 mm #1,5 | |
| Aqua Poly/mount | Polysciences, Inc | 18606 | |
References
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