Summary
Bu makalede ayrıntılı olarak utero serebral korteks ve farelerde E14.5 de hipokampus electroporate bir protokol tanımlamaktadır. Biz de bu bu iki beyin bölgelerinde dendrit ve dikenler incelemek için değerli bir yöntem olduğunu göstermektedir.
Abstract
Utero elektroporasyon yılında (İEÜ) Embriyonik sinir sisteminden 1-5 farklı yörelerin kalkınmasına çalışmak için güçlü bir tekniği haline gelmiştir. Bu araç yaygın olarak hücresel çoğalma, farklılaşma ve özellikle gelişmekte olan serebral korteks 6-8 nöronal göçün düzenlenmesi incelemek için kullanılır olmuştur bugüne kadar. Burada detaylı bizim protokol utero serebral korteks ve hipokampus electroporate ve bu yaklaşımı, bu iki beyin bölgelerinde dendrit ve dikenler incelemek için kullanılabilir kanıt sağlamak.
Primer kültürlerinde nöronların Görselleştirme ve manipülasyon dendrit, omurga ve sinaps geliştirilmesinde rol süreçlerin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmuştur. Ancak in vitro büyüyen nöronların normal gelişim sırasında dendrit ve / veya omurga oluşumu ve bakım etkileyebilecek tüm fizyolojik ipuçları maruz değildir. Dendrit ve omurga yapıları bilgilerimiz
Son olarak, İEÜ dendrit, omurga ve / veya sinaps geliştirme ilgili genler arasında işlevsel etkileşimleri belirlemek için yararlı bir araç sağlar. Gerçekten de, bu tür virüsler gibi diğer yöntemler gen aktarımı aksine, bu hücrelerin, aynı popülasyon içinde birden çok RNAi ya transgenlerin birleştirmek için açıktır.
Özet olarak, zaten IUE beyin fonksiyonu ve hastalık moleküler mekanizmaları karakterizasyonu katkıda bulunan ve aynı zamanda dendritler ve omurga çalışması ve yardımcı olacaktır güçlü bir yöntemdir.
Protocol
Birleşik Krallık'ta, fareler, ev sahipliği yetiştirilen ve Hayvan (Scientific Procedures) Act 1986 kapsamında İçişleri Bakanlığı tarafından onaylanan yönergelere göre tedavi edilir.
1. Hazırlanışı: DNA Çözüm ve İğneler
- Bir Endotoksin ücretsiz Maxi hazırlık kiti ile plazmid DNA arındırın. Suda istenilen konsantrasyonda enjeksiyon için plazmid DNA çözeltisi hazırlayın ve enjeksiyonlar görselleştirmek için (% 0.05 final konsantrasyon) Fast Green ekleyin. Elektroporasyon verim DNA konsantrasyonu çok bağımlı olduğunu. 1 ug / ml arasında bir konsantrasyonda, genellikle kullanılır. Bu konsantrasyon onların gelişimini etkilemeden electroporated nöronlar görselleştirmek için yeterlidir. Bununla birlikte, plazmid vektörü olarak boyutu ve (sitomegalovirüs hızlandıncı / kuvvetlendirici, sitomegalovirüs acil erken geliştirici ve tavuk β-aktin promotör fusion (CAG) promotörü ile güçlü bir ifade ile düşük düzey ifade seviyesini) 'de kullanılan promotör göre ifade edilen protein stabilitesi, bu konsantrasyon (0,25 ug / ml ila 5 ug / ul) ayarlanabilir.
- Mikropipet çektirmenin kullanılarak cam iğneler çekin.
2. Cerrahi hazırlanması
- Cerrahi aletler ve fosfat tamponu (PBS) otoklavlayın.
- PBS (Buprenorfin, 30 ug / ml 'lik Vetergesic, son konsantrasyon) analjezik çözeltisi hazırlayın. Gebe fare tartılır ve en az 30 dakika ameliyattan önce Vetergesic deri altına 0.1 mg / kg enjekte. Bu süre boyunca, cerrahi alanı hazırlamak. Isıtma pedleri ve kurtarma odası açın. Sıcak su banyosu ve steril örtüler tüm steril alet ve malzemelerin steril PBS yerleştirin. PBS dolu behere platin elektrot yerleştirin ve elektroporatörün bağlanın. Bir Microloader ucunu kullanarak DNA solüsyonu ile iğne doldurun, kılcal sahibine iğne bağlamak ve bir forseps ile iğne ucu çimdiklemek.
- Bir indüksiyon odalarını kullanarak (oksijen 2 lt / dk) oksijen taşıyıcı izofluran ile hamile bir fare (E14.5-E15.5) uyuşturan. Hayvan refleks doğrulma kaybeder kadar bekleyin.
- Bir "ön-cerrahi" maskesi hayvan aktarın. Annenin genel anestezi altında iken gözler kornea ülseri önlemek için her göze göz jeli bir damla yerleştirin. Karın tıraş etmek için bir elektrik ustura kullanın. Uçan saç toplamak için clorhexidine ile bir kez traş alanı temizleyin.
- Cerrahi alanında ikinci bir maske için hayvan aktarın. Isıtma yastığı sırtını ile fare yerleştirin. Pedal refleks kesildi cerrahi başlayın.
- Maske ve steril eldiven giyin. Tıraş ve dezenfekte edilmemiş deri alanları ile kontamine olmaktan doku ve araçların önlemek için steril bir drape (karın üzerinde küçük bir delik ile) ile hayvan örtün. Bir traş alanı temizleyinen t clorhexidine ile 3 kez. Farklı bir steril pamuklu çubukla her zaman kullanın. Deri yoluyla orta hat (~ 1 inç uzunluğunda) boyunca dikey bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. Makas kullanarak, linea alba (beyaz çizgi kollajen bağ dokusu çoğunlukla oluşan) boyunca karın kaslarının benzer bir kesi yapmak.
- En erişilebilir embriyolar seçin ve iki embriyo arasında halka forseps yerleştirin ve dikkatlice karın boşluğu dışında embriyonik zinciri çekin. Bu noktadan itibaren, steril önceden ısıtılmış PBS ile embriyolar nemli tutar.
No mikroskop görüntülenmesi için gereklidir.
4. DNA ve Elektroporasyon Enjeksiyon
- Daha kolay embriyolar electroporated edildiği izlemek için yapım, en lateral embriyoların biriyle başlayın. Bu kanama riskini artıracak gibi embriyo üzerinde çok fazla çekmeyin. Halka ve forseps kullanılarak amniyon kesesi içinde embriyonun konumu manipülehalkaları arasındaki embriyoların başı sabitlemek. Embriyo yakın rahim duvarına kadar itmek hafifçe sıkın.
- Diğer elinizle kılcal tutucu almak ve lateral ventrikül hedef yarımkürenin orta dikkatlice iğneyi. Fast Green (dendritler okumaya az 1 ul) ile karışık DNA solüsyonu yaklaşık 1 mikrolitre enjekte etmek için pedal basın. Sen lateral ventrikül dolum yeşil boya gözetmelidir. Kritik adımlar: - iğne keskinliğini düzgün rahim duvarı delmek için çok önemlidir. Delikli bir genişleme amniyotik sıvı ve embriyo ölüm sızıntı neden olacaktır çünkü uterus duvar yüzeyinde ve ventrikül içine yerleştirildikten sonra iğne hareketi en aza indirmek için önemlidir. Bu kanama ve embriyo ölüme neden olacağı için, rahim duvarının delici kan damarları kaçının.
- Bu neden olacaktır çünkü lateral ventrikül içine DNA bir çok büyük hacimli enjeksiyon için önemli değildirhidrosefali (E14.5 az 2 ul aşmayın). DNA'yı hacminin deney amacına göre ayarlanır. 1μl, genellikle en deneyler için kullanıldığı takdirde, DNA (yaklaşık 0.5 ul) daha küçük bir hacim dendrit ve omurga analizi için gereklidir. Gerçekten de birkaç izole hücrelerin electroporated nöronların dendritik çardak görselleştirmek ve ölçmek için hedef gerekir. - Korteks elektroporasyon için enjekte ventrikül olarak veya hipokampus elektroporasyon için enjekte ventrikül (Şekil 2) karşı tarafta aynı tarafta pozitif (+) raket ile embriyonun baş tarafında elektrotlar yerleştirin. Daha sonra 1 sn aralıklarla beş 30V elektrik darbeleri (50 msn süreli) uygulanır. Kritik adım: Bu embriyo ölüme neden olacak gibi plasenta arasında geçerli uygulamaktan kaçının.
Hamile bir farenin tüm embriyolar herhangi bir karışıklığı önlemek için inşa genellikle aynı DNA ile, electroporated edilebilir. Bununla birlikte, uzun bir cerrahi azalma embriyoların hayatta kalma oranı nedir. Karın boşluğuna 30 dakika daha uzun açılmamalıdır.
5.. Cerrahi sonrası elektroporasyon
- Embriyoların electroporating sonra, karın boşluğuna PBS ekleyin ve özgün konumunda uterin horn yerine halka forseps kullanabilir. Vicryl emilebilir dikişlerle karın duvarı ve cilt dikin.
- Bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirilen bir kafese aktarabilir sonra uyanır (genellikle 5-10 dk) ve kadar bir kurtarma odasında hayvan yerleştirin.
6. Post-cerrahi
Ağrı, acı veya sıkıntı değerlendirmek ve cerrahi sonrası hayvanların 24 saat ve 48 saat tartmak farelerin davranışlarını kontrol edin. Gerekirse, analjezikler ağrı ve rahatsızlığı azaltmak için uygulanabilir.
7. Doku İşleme
Deney için gerekli embriyonik ya da doğum sonrası aşamalarında electroporated embriyo veya yavrular toplayın.
ove_content "> - embriyonik aşamalarında (örneğin hücre çoğalması veya göç çalışma) de analiz için:Servikal dislokasyon ile anne Euthanize ve embriyolar toplamak. Baş kesilerek, düzgün bir şekilde electroporated edilmiştir beyinleri seçmek gibi floresan sinyal miktarını ve konum ile belirtilen, bir floresan binoküler kullanılarak kafatası boyunca görüntülenmiştir. Kafatası beyin dışarı inceleyin ve% 20 sakkaroz / gece PBS içinde% 4 PFA gecede düzeltmek ve tekrar yerine. ° C ve bölüm kriyostat kullanarak -80 OKT bileşik, dondurucuda Embed.
- Doğum sonrası aşamalarında (örneğin dendrit ve dikenler incelemek için) de analiz için:
Pentobarbitone intraperitoneal (40-60 mg / kg) ile yavru veya yetişkin farelerin uyuşturmak ve PBS içinde% 4 PFA takiben PBS ile transcardial perfüzyon, gerçekleştirebilir. % 4 PFA gece içinde kafatası ve post-düzeltmenin beynini parçalara ayır. Bir vibratome (d için 100 mikron bölümlerini kullanarak PBS, bölüm beyinleri yıkamadan sonraendrite analizi). Görüntü dendrit ve dikene 0.16-0.19 mm kalınlığında lamelleri kullanarak Aqua Poly / mount bölümler monte edin.
8. Temsilcisi sonuçları
Şekil 3 CA1 (Şekil 3C, D) ve hipokampus (Şekiller 3E, F) dentat gyrus'ta serebral kortekse (Şekil 3A, B) 'de electroporated hücrelerinin örnekleri gösterilmektedir. Wild-tip fareler GFP yapı (PCA-b-EGFPm5 susturucu 3) ve beyinleri postnatal gün (P) 14 hasat edildi ile E14.5 az electroporated edildi. DNA solüsyonu bir küçük hacimli (1 ug / ml bir çözeltiden 0.5 ul veya daha az) enjekte edilerek, bir kaç hücreleri izole GFP + hücreleri (Şekil 3) ve aynı zamanda bunların omurga dendritik arborization görselleştirilmesi olanak sağlayan, etiketli yüksek büyütmede (Şekil 4).
<strong> Şekil 1. dendrit ve dikenler incelemek için kullanılabilir elektroporasyon protokolleri şematik. (A) bir GFP arasında Elektroporasyon vahşi tip ve mutant farelerde dendritler, omurilikteki karşılaştırmak için yapı. (B) GFP-shRNA (GFP aynı yapı ile ifade edilir) ve Elektroporasyon oluşturmak dendritler ve bir shRNA ile electroporated farelerde omurga karşılaştırmak için bir ilgi genindeki (X) ya da bir kontrol shRNA için spesifik. (C) IUE arzu edilir bir süre için shRNA ifade kısıtlamak için bir Kre indüklenebilen sistemi ile birlikte kullanılabilir. Bu deneyde, bir vektör 4-hydroxytamoxifen ile aktive edilebilir Kre rekombinazı bir biçimi ifade (CAG-ER T2 CreER T2; 1 ug / ul) 10, bir Kre bağlı olarak, belirli bir shRNA eksprese eden bir vektör ile birlikte electroporated edilir şekilde (1 mcg / ml ve rekombinasyon göstergesi (Kre tarafından CALNL-GFP yapı, GFP indüklenebilir ile;. 1 mcg / ml) 10 Verimdevirme ve cy shRNA konsantrasyonu artırmanın yanında CAG-ER T2 CreER T2 konsantrasyonu artırarak geliştirilebilir.
Şekil 2. Elektroporasyon Mekansal kontrolü. Bu şekil serebral korteksteki veya hipokampus hedeflemek için DNA enjeksiyon göre paddle elektrotlar konumlandırmak için burada gösterir.
Şekil 3. Utero ve dendritik çardak Görselleştirme serebral korteks ve hipokampus hücrelerinin electroporated. (A, B) GFP + serebral korteksteki piramidal hücre, (CD) piramidal hipokampusun CA1 hücreleri ve (E, F), P14 azından dentat gyrus'ta granül hücreleri gösteren koronalde. Bir GFP yapı (PCA-b-EGFPm5 susturucu 3) E14.5 de electroporated edildi. Yüksek büyütme resimleri (B, D, F) İEÜ dendritler görselleştirmek için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir. Ölçek çubukları 50 mikron (B, D ve F), 150 mikron (A, C, E) temsil eder.
Şekil 4. Inşa ifade eden bir GFP E14.5 az utero electroporated edildi P14 nöronlar dendritik dikenler Görselleştirilmesi. (A, B) hipokampal piramidal nöronların bazal dendritler gelen dikenlerin Yüksek büyütme görüntüler. Ölçek çubukları 5 um (A) ve 2 um (B) temsil eder.
Discussion
İEÜ uzayda değil, zaman sadece gen ekspresyonu işlemek için güçlü bir araçtır. Biz bu tekniğin serebral korteks ve farelerin hipokampus dendrit ve dikenleri görselleştirmek ve genetik işlemek için kullanılabileceğini burada göstermektedir. Daha önce anılan avantajları yanında, İEÜ, yöntem Golgi aksine, immünhistokimya ile veya fenotip electroporated hücreleri örneğin sağlar situ hibridizasyon, kombine edilebilir dikkati çekiyor. Bu prosedür göreceli invaziv rağmen belirgin beyin anormallikleri neden olmadığını belirtmeyi de önemlidir. Buna ek olarak, hücresel seviyede, IUE electroporated nöronların 13 elektrofizyolojik özelliklerini değiştirmek değildir. Bizim gösteri dendrit ve omurga morfolojilerinin görselleştirme odaklanırken, E14.5 kortikal veya hipokampal nöronların İEÜ ayrıca akson oluşumu ve rehberlik gibi diğer gelişimsel olayları incelemek için kullanılabilir. Ekleyinition, protokol aynı tür farklı toplumlarda hedef embriyonik gelişimin diğer aşamalarında uygulanabilir. Örneğin, E18.5 bir developmentally çok geç kortikal elektroporasyon paradigma astrositik progenitörlerin 1 ifade sürmek için gerçekleştirilebilir. E14.5 de hipokampus bir elektroporasyon aynı zamanda CA1-CA3 piramidal nöron ataları ve dentat granül hücre progenitör hedef sağlar Benzer şekilde, bir geç hipokampal elektroporasyon (E18.5 veya erken doğum sonrası) farklı dentat granül hedef için izin verecek progenitörlerin 14. Bu durumda, DNA enjekte hacmi akım yoğunluğu yanı sıra arttırılabilir.
İEÜ tarafından tanıtıldı transgenlerin epizomal kalması görünür ve bu nedenle ardışık hücre bölünmeleri takip hücrelerinden kaybolur. Bu nöronların olarak postmitotik hücreleri ise, epizomal transgenlerin uzun vadeli çalışma 13 izin elektroporasyon sonra ay için aktif kalması, 15. Bizim çalışmamızda, erken gelişimsel zaman noktalarından transgen ısrarla ifade İEÜ sonuçlarını kullanarak kortikal ve hipokampal nöron öncüleri hedefleme embriyonik belirten doğumdan sonra 7 hafta (biz analiz en son saat noktası) parlak GFP + hücreler kadar gözlemledim yetişkinliğe.
Tekniğin bir akım sınırlama electroporated hücrelerin sayısı üzerinde ince bir kontrol uygulamak zor olmasıdır. Ancak DNA solüsyonu enjekte hacmi azaldığı için, bunun birkaç hücre etiketlemek ve izole GFP + hücrelerin yanı sıra dikenler dendritik arborization görselleştirmek mümkün olduğunu göstermiştir. Transfekte alan boyutu ve aynı zamanda, mevcut darbelerinin sayısı ya elektroporasyon kolları çapı yoğunluğu olarak elektroporasyon parametreleri değiştirerek ayarlanabilir.
Toplamda İEÜ, uygulanması kolay hızlı bir yöntem vein vivo olarak dendrit ve dikenler incelemek için verimli.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar aseptik prosedürleri kapsamında utero elektroporasyon gerçekleştirmek için yardım ettikleri için Dr Kathleen Mathers, Dr Jean-Philippe Mocho ve Dr Yolanda Saavedra Torres teşekkür etmek istiyorum, ve onun yardım için Hayley Ahşap çizimler hazırlamak için.
EP Elizabeth Fisher ve Victor Tybulewicz için Wellcome Vakfı bursu ile Avrupa Biyokimya Dernekleri uzun vadeli Federasyonu (FEBS) burs ve Medical Research Council (MRC) kariyer geliştirme bursu, MAH (080174/B/06/Z) tarafından desteklenmiştir , HW, MRC Öğrencilik tarafından EMBO uzun vadeli dostluk ve RA tarafından. Bu çalışma Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) bir proje hibe ile ve Grant-Aid yılında Tıbbi Araştırma Konseyi (U117570528) den FG tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of needles and DNA solution for injection | |||
| Endofree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Fast Green | Sigma | F-7258 | |
| Borosilicate glass capillaries 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D. |
Harvard Apparatus | 30-0016 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For Eppendorf pipettes 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl |
| Material for surgery | |||
| Extra thin Iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Vicryl absorbable suture | Ethicon Inc (Johnson Johnson) | W9074 | |
| Sterile drapes 30cm x 45 cm | Buster | 141765 | |
| Sterile swabs | Shermond | HUBY-340 | |
| Cotton buds | Clean Cross Co., Ltd | 1860 | |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Alstoe Animal Health | ||
| Clorhexidine | Vetasept | XHG007 | |
| Eye gel Viscotears | Novartis | ||
| Isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | |
| Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20% | Animalcare | ||
| Electroporation | |||
| Electroporator | BTX | ECM830 | |
| Platinum Tweezertrode 5mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0489 | |
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 5247000030 | |
| Foot Control for Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5247623002 | |
| Capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | |
| Tissue processing | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Sucrose | VWR (Prolabo) | 27480.294 | |
| Microscope slides | ThermoScientific (Menzel-Gläser) | J1800AMNZ | |
| Coverslips | Menzel-Gläser | 22 x 50 mm #1,5 | |
| Aqua Poly/mount | Polysciences, Inc | 18606 | |
References
- Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. Front Mol. Neurosci. 4, 37 (2011).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev. Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 507-511 (2008).
- Castro, D. S. A novel function of the proneural factor Ascl1 in progenitor proliferation identified by genome-wide characterization of its targets. Genes Dev. 25, 930-945 (2011).
- Pacary, E. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69, 1069-1084 (2011).
- Marteau, L. Angiopoietin-2 regulates cortical neurogenesis in the developing telencephalon. Cereb Cortex. 21, 1695-1702 (2011).
- Ramon Moliner, E. Comparative Methods in Neuroanatomy. , Springer. New york. (1970).
- Banks, G. T. Behavioral and other phenotypes in a cytoplasmic Dynein light intermediate chain 1 mutant mouse. J. Neurosci. 31, 5483-5494 (2011).
- Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20953-20958 (2008).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. ong-term selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).
- Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. J. Heterotopia formation in rat but not mouse neocortex after RNA interference knockdown of DCX. Cereb Cortex. 16, 1323-1331 (2006).
