Summary
phagokinetic蠕动轨道法是一种方法，用于评估细胞的运动。具体而言，测定测量化学增活现象（随机细胞运动性），以定量的方式随着时间的推移。该试验利用细胞的能力，以建立一个可测量其运动轨迹胶体金涂覆盖玻片。
Abstract
单细胞和多细胞生物体细胞的活力是一个重要的生物过程。它的来源的营养物或远离不适合的条件，以及在多细胞生物组织的发展，免疫监视和伤口愈合，只是提了几个角色1,2,3的单细胞生物向运动是必不可少的。撤销这个过程可能会导致严重的神经系统，心血管疾病和免疫系统疾病，以及加剧了肿瘤的形成和传播4,5。分子，肌动蛋白聚合和受体回收已被证明发挥了重要作用，在细胞的扩展名（片状伪足），即推动向前运动的细胞6,7,8。然而，许多生物细胞迁移的问题仍然没有答案。
在人类健康和疾病的细胞运动中的核心作用突出的重要性，了解具体的MEChanisms参与了这一过程，并作出准确的方法来评估细胞的运动，特别是重要。显微镜通常是用于可视化细胞的运动。然而，细胞移动相当缓慢，耗费资源的过程，需要昂贵的相机和软件创建时间的推移定量电影运动细胞的细胞迁移的定量测量。因此，进行定量测量细胞迁移，是符合成本效益的，不费力，而且采用了常见的实验室设备的能力是一个伟大的许多研究人员的需要。
phagokinetic轨道蠕动测定法利用能力的移动单元以清除金颗粒，从它的路径建立一个可测量的磁道上的胶体金涂覆的玻璃盖玻片9,10。使用的自由软件，可以评估多个音轨，每次治疗完成统计的要求。该试验可以用来评估许多类型的细胞，如癌细胞11,12，成纤维细胞9，嗜中性粒细胞13，骨骼肌细胞14，角质形成细胞15，的滋养层16，血管内皮细胞17，和单核细胞10,18-22能动性。该协议涉及创建由柠檬酸钠，氯金酸（互惠3 +）的减少所生成的金纳米粒子（互惠°）涂覆的幻灯片。这种方法的开发由Turkevich 等人于1951年23，然后在20世纪70年代的改善Frens 等。24,25。作为一个结果，该化学还原步骤中，金颗粒（10-20 nm直径）从反应混合物中沉淀，并可以应用到玻璃盖玻片，然后准备用于在细胞迁移分析9,26,27。
在一般情况下，phagokinetic轨道蠕动法是一种快速，定量和容易的细胞能动性的措施。此外，它可以用来作为一个简单的高通量的检测，使用的细胞类型，不适合时间推移的成像，以及其他用途，取决于需要的研究员。一起，定量地测量多种细胞类型的细胞运动，而不需要昂贵的显微镜和软件的能力，以及常见的实验室设备和化学品的使用，作出的phagokinetic的轨道活力测定了坚实的选择，有兴趣的科学家了解细胞蠕动。
Protocol
1。明胶涂层的盖玻片的制备
- 放置酸洗玻璃盖玻片（15毫米直径），在无菌塑料100mm皿（晚餐）。将每道菜8-9盖玻片，并确保他们不接触对方或双方的菜..
注：盖玻片，针和镊子必须是无菌的，以消除可能的污染的微生物，以及内毒素，这将影响细胞功能，包括蠕动。
- 称量明胶粉末，并重新悬浮在去离子水中的粉末，使明胶溶液的最终浓度为0.5 g/300毫升。接着，将明胶溶液需要以进行高压灭菌。
- 移取2-3滴明胶（约100-150毫升），每个盖玻片上。
注意：请小心不要让明胶触摸盘，否则您将无法从盘子里取出盖玻片。
- 烘烤10分钟在90℃下在烘箱中在100毫米培养皿明胶包衣的盖玻片。
- 删除多余的，食用明胶温柔的移液。
- 45分钟，在100毫米的培养皿在烘箱中在70℃下干燥盖玻片。
- 一旦干时，取出盖玻片100毫米的盘使用无菌，无内毒素针和镊子（针是用来轻轻上调盖玻片，使其访问的镊子轻轻取出）。
- 将个人明胶包被盖玻片的24孔板到单独的井。
2。制备胶体金涂层盖玻片的
- 称取适量的氯金酸（四氯金酸三水合物; HAuCl 4·3H 2 O），然后重新悬浮于无菌的去离子水，以制备最终的14.5 1mM溶液（毒性）。准备1.5毫升的溶液每8-9盖玻片。
警告：氯金酸为h抱吞咽，引起严重的皮肤灼伤和眼睛损伤，并可能导致皮肤过敏反应。吞食有毒。
- 称取适量的柠檬酸钠（磷酸三钠二氢2 -羟基丙烷-1，2,3 -三甲酸三乙酯;的Na 3 C 6 H 5 O 7），然后重新悬浮在去离子水中的粉末作最后的0.5％的溶液。准备1毫升的溶液每8-9盖玻片。
警告：柠檬酸钠可能会引起眼睛和皮肤有刺激性。它也可能导致呼吸道和消化道的刺激。
- 在无菌的，无内毒素的烧杯中的1.5毫升的无菌14.5 mM的HAuCl 4溶液和13.5毫升的无菌去离子水相结合;结果应该得到淡黄色溶液。上述量将允许8-9胶体金盖玻片。
- 在连续搅拌的同时，在热板上加热该溶液，直到它开始到b油。
警告：加热该溶液应在通风橱中进行，如可以是蒸气的有害/有毒。蒸气组织的粘膜和上呼吸道有破坏性的。
- 删除从热板的烧杯中。
- 在搅拌的同时，加入0.7毫升的0.5％柠檬酸钠溶液中。上述量将允许8-9胶体金盖玻片。
- 保持这种组合的解决方案搅拌约2分钟（注：溶液颜色会逐渐改变，从淡淡的黄色，清除，灰色，紫色，深紫色，最后才到达红葡萄酒，最好是铁锈色） 。该产品是您的胶体金溶液。
- 冷却的10毫升移液管的胶体金溶液中1-2分钟（为了保持盖玻片的明胶层上时，从熔化的胶体金溶液中加入），然后加入1.0-2.0毫升的colloida升金溶液到每个明胶包被的盖玻片放置在24孔板（ES）（您添加量的胶体金溶液的明胶包被的盖玻片上取决于如何以及在溶液中的金颗粒沉淀 - 下面的评论）。
注意：因为有可能会对在金颗粒沉淀的效率的变化，它是表示第一次添加的胶体金溶液的明胶包衣盖玻片0.5-1毫升，0.5小时，然后放置在24孔培养皿中孵化器。此温育时间后，应检查盖玻片，在光学显微镜下，适当的密度的金颗粒上的盖玻片。过低和过高的浓度的金颗粒的实施例的20倍的显微镜图像，参见图1。请参阅图2为一个理想的浓度的金颗粒（至少用于与单核细胞）的40倍的显微镜图像。巴勒斯坦被占领土IMAL在幻灯片上的金纳米粒子密度应使用每种细胞类型的实验确定的，作为不同的细胞的特性将决定他们的运动的强度上的盖玻片。如果金颗粒的浓度是不足的，增加一个额外的胶体金溶液的明胶包衣盖玻片0.5-1毫升。
根据细胞的大小，适当浓度的金颗粒可以不同，从而将最终依赖于细胞的大小检查蠕动。例如，与人单核细胞是小尺寸的细胞（〜10-20微米28），需要更高浓度的金颗粒在我们的分析。黄金纳米粒子的适当分配为研究人员提供了简单而有效的区分边缘细胞的轨道。甲金颗粒浓度太高会妨碍细胞的能力，移动，因此，准确地测量他们的蠕动，而金颗粒的浓度过低限制的能力划定一个准确的跟踪蠕动。
重要注意事项：如果是有问题的黄金纳米粒子的合成，合成的纳米金是市售的尺寸从5纳米到400纳米。此外，荧光微球也被用来研究细胞运动29。但是，这些微球的使用需要分析细胞迁移的荧光显微镜。
- 与胶体金覆盖的盖玻片的培养箱中放置24孔培养皿，在37℃下孵育1小时至过夜。
- 孵育后，冲洗/通过浸渍到无菌的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中的的盖玻片（3×），除去未结合的金。
- 将这些胶体金涂层盖玻片，在一个干净的12孔板（ES）的PBS。
- 将这些盖玻片，在4°C，直到准备（封口膜板放置在冰箱前）。
重要注意：始终保持在某种类型的液体/介质的胶体金涂覆盖玻片作为金颗粒剥落从盖玻片，如果让其干燥。胶体金盖玻片，应使用之日起，他们在2-3个月内。
质量控制：在一个单一的phagokinetic轨道蠕动测定，它是由一个类似的浓度的金颗粒，其特征在于使用的盖玻片的关键。这个简单的点，将允许在蜂窝蠕动样品之间的定量差异的性质的处理，而不是胶体金涂层盖玻片的物理性质是纯粹由于。我们赞成使用只在个别的实验中在同一时间所作的盖玻片，虽然我们已经表明，只要金纳米粒子的密度是相等的，使用盖玻片从不同的制剂是适当的。
3。细胞运动分析
- 将胶体金涂层盖玻片放置在一个适当的蜂窝媒体所关注的细胞。
- 适当的处理后的细胞转移到胶体金涂层的盖玻片放置在24孔培养皿（晚餐）
注：转移到单井细胞的数目，需要确定每种细胞类型的研究。理想的情况下，细胞需要平均分布在胶体金涂层盖玻片，这反过来将允许创建的单个单元格的唯一的磁道的统计分析。如果细胞接种于浓度太高，它变得很可能发生的，将要看到的多个小区的重叠轨道。重叠的轨迹不能准确地定量，因此，它们不能被考虑在最后的分析测试细胞的移动。作为一个结果，重叠轨道参与多个细胞通常是很容易观察到，作为合并或划线的轨迹（在分析领域内的），其中两个或更多的细胞中可以观察到相同的连续清除区域。
- 孵育在37℃，C / 5％CO 2的24小时（或任何合适的时间， 例如，我们已经分析在6小时和24小时的后处理和血管内皮细胞在12小时后处理）之间的单核细胞蠕动。会随着研究的细胞类型，因此应通过实验确定了不同的细胞类型（一个很好的起点，但是，是6 - 12小时后处理）的确定和测量细胞运动的最佳时间框架。
注：如果实验胶体金涂覆盖玻片需要将被存储和/或分析在稍后的时间，将细胞和金纳米粒子需要被固定在盖玻片。要做到这一点固定步骤;以下步骤3.3，先洗盖玻片仔细的2倍，1倍PBS（浸渍盖玻片是可取的，因为，从盖玻片必须避免的黄金纳米粒子的去除），然后使用标准的细胞固定方法，如3％的多聚甲醛室温孵育。孵育15分钟后，被删除的3％的多聚甲醛和盖玻片仔细洗3次，用1×PBS。可以保存在冰箱中的固定盖玻片。
- 使用光学显微镜，拍摄图像创建一个移动单元格（注：用于细胞的轨道拍照，放大倍率肯定会有所不同的细胞类型根据调查）的轨道。在图2中所示的实施例的蜂窝轨道创建的非能动和能动的细胞对胶体金涂层盖玻片。
注：phagokinetic轨道蠕动测定中使用的大小的金纳米粒子已被发现是完全无毒的细胞30。如果有必要进行评估的可行性研究细胞台盼蓝染色或其他标志物检测细胞活力。人们必须考虑到需要为固定，固定型等，如果需要进行这一步。
- 使用免费的软件，如ImageJ软件（ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）或NIH图像（ http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ）的，无论是发达国家在美国国立卫生研究院（ http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ） ，或ImageTool的大学，得克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥，清除胶体金的平均面积（任意单位） 10-20或更多的细胞（每个样品）确定为每个实验臂从所捕获的图像。在T就可以进行统计他收集的结果。例如，结果可以绘制为意味着±的标准误差的装置（SEM）与学生的 t测试执行，和一个P值，<0.05作为统计意义样品之间的措施。 图3和4展示的步骤在清除由该单元的胶体金的区域分析。
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Representative Results
所示出的是示出了轨道区清零由一个单一的细胞（单核细胞从我们的实验是在图2中所示）在光学显微镜下拍摄的图像的一个例子。非运动细胞创建特征的小，椭圆形或圆形大片自己周围指示低基础水平的运动为这些未刺激的细胞（ 图2A和2B）。高度运动细胞[在我们的系统中，人巨细胞病毒（HCMV）感染的细胞]与此相反，其特征在于由作为细长的轨道区图2C和2D中示出的定向运动。获得使用倒置显微镜用40倍的目标的多个图像的轨道区后，总的轨道区标记用ImageJ软件（图3）;与其他软件应用程序，可以得到类似的结果。我们看好的的ImageJ软件，因为它是免费的，易于使用的。运动细胞不创建标准，几何形轨道杜响他们的运动，因此，方便快捷地进行分析，以纪念该地区的ImageJ软件中选择手绘工具，是为了纪念的形状轨迹的运动细胞（ 图3）。在划定的轨道区域进行分析，进行定量测量的数据通过点击ImageJ的菜单栏上的“分析”，从下拉菜单中选择“测量”。我们的结果中得到的从图3中所给出的数据收集分析蜂窝轨道区的任意单位的样品是在图4A中所示。 ImageJ软件从收集的结果，然后可以在电子表格中给出的分析，以允许计算的平均轨道区域，如在图4B中所示，每个单元格清零。
在我们的经验中，最容易出问题的步骤的协议是生产的胶体金涂层盖玻片关注的问题是Generation盖玻片的黄金纳米粒子的均匀覆盖（有关这方面的关注问题的讨论在2.8以上）。适当的，均匀的覆盖coveslip金纳米粒子上的在图2中给出。过于密集（ 图1A和1B）或过于稀疏（ 图1C和1D）的覆盖范围，将防止细胞迁移或改变的重放的轨道区的大小和形状的分析。第二个关键点在3.2以上所讨论的，是镀敷细胞的密度和需要，以防止重叠或合并来自多个小区的轨道。
图1。密度的盖玻片上的胶体金的潜在问题。该图中所示的例子的胶体金涂层盖玻片，要么太高（事务委员会
图2。创建的非能动的磁道（组件的实施例A和B）和运动（组件C和D）细胞上胶体金涂覆盖玻片。病毒无介质（模拟感染）或媒体含有病毒颗粒的病毒（HCMV感染）添加到孤立外设中人外周血单核细胞10,18-22。单核细胞在37℃孵育1小时，然后镀到胶体金涂层盖玻片24小时在37℃/ 5％CO 2的 C / 5％CO 2的 。照片是使用40倍的目标。白色箭头标记的单核细胞，在它们的最终位置。正如我们以前已经证实10,18-22，未感染的单核细胞的特征在于由一个低基础水平的蠕动，而人巨细胞病毒感染的细胞中显示的高动力的特性。大小栏对应的长度为25微米。
图3。标记区使用ImageJ软件蜂窝曲目。实施例图中所示的快照的磁道，在分析过程中由非能动（组件A和 B）和运动（创建的轨道中，使用Image J软件组件C和D）细胞胶体金涂层的盖玻片（注：轨道盘旋的白线，使用ImageJ的手绘工具）。样品图片， 图2中所示的那些相同的，在该图中被用来测量由一个单一的细胞清除的轨迹区域。然而，这些是具有代表性的图像，模拟和人巨细胞病毒感染的单核细胞，通常为10-20图像进行分析每个样品。大小栏对应的长度为25微米。
图4。使用ImageJ软件和电子表格的细胞运动的定量评价。 A）的细胞清除的测量轨迹区域，样品中的照片（ 图2和图3）所示，使用ImageJ软件。的计算结果＃1，＃2，＃3和＃4对应于组件甲 >，B，C和D在图2和图3，分别为B）的图形表示的平均面积（装置;以任意单位）清零由细胞和ImageJ软件分析。在这个例子中，未示出的平均值的标准误差，因为在本例中的重复数不足分析。注：ImageJ软件提供在任意单位的测量区域的轨道，因此，它是用来比较的轨道相同的放大倍数下拍摄的照片的关键。从单独的实验比较结果的最简单的方法是用来比较的褶皱之间的变化检测的样本。
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Discussion
轨道活力的phagokinetic在这篇文章中提出的分析是定量分析细胞迁移的一个简单而非常有效的方法。由于多种细胞类型可以分析9-17，这种方法有可能跨越多个学科的广泛使用。胶体金镀膜玻璃盖玻片的使用允许测量由移动的小区的轨道区清零。该法可衡量的效果，不同的刺激（ 如生长因子，纯化的ECM配体，病毒，细菌）对细胞活力。此外，缺乏监测细胞迁移的要求，进行细胞固定，允许在不同的实验时间点。此外，该法只需要一个标准的光学显微镜，使用CCD（电荷耦合器件）图像传感器和可自由查看软件的一个标准的相机。因此，先进的显微镜和数码相机是没有必要的，也不是特殊的软件套件。即使屁股AY设计简单，它是一个功能强大的工具，众多的实验条件下进行统计研究多种细胞类型的运动性。例如，在这方面，检测可以用来有效地研究一个小数量的实验样品，以及有效地作为一种高通量筛选测定。可以检查由于盖玻片未定影的，该法还可以允许移动的显微镜，而不需要与一个封闭的加湿，加热的CO 2培养箱中培养的细胞随着时间的推移的分析。此外，phagokinetic轨道蠕动检测是有助益在研究一种蠕动的细胞不适合的时间延时成像，荧光染色的细胞作为一个光漂白的关注较少是在胶体金为主，蠕动测定。由一个单一的细胞清除的轨迹区域的定量评价是通过使用可自由查看ImageJ软件实现的，虽然可以使用其他软件。此外，整体graphica，l和统计分析得到，只需要计算的基础知识，电子表格和统计。
应当注意的是，原来的方法描述了使用牛血清白蛋白（BSA），以覆盖盖玻片9。然而，发现使用BSA作为代理以允许均匀的金胶体单层27是不可靠的。 BSA，明胶替代的盖玻片的涂层，增加了坚持的黄金纳米粒子的盖玻片。补充修改，由Scott 等人 27日的协议的黄金纳米粒子涂层的质量大大提高。然而，我们发现，基于上Turkevich 等23，柠檬酸钠作为还原剂，使用创建的金纳米粒子的最均匀的单层。因此，我们赞成这种方法，因此，它在我们的协议。
为了让啊室内运动场程度的再现性，重要的是要严格按照体积和温度在协议中表示，偏差可以强烈地影响最终的结果。正如上面所讨论的，在使用phagokinetic轨道蠕动测定的技术障碍之一涉及生产的黄金纳米粒子在溶液中，然后在获得适当的均匀浓度的黄金纳米粒子上的盖玻片。因此，即使金纳米粒子沉淀步骤是可重复的，我们把重点放在评估的最终溶液中析出的金纳米粒子的颜色。此外，这是我们的理由只添加到每个盖玻片的最终溶液的正常体积的一半，然后经过0.5小时，评价的盖玻片上的金颗粒（与标注添加额外的溶液的密度和均匀性，如果以后需要）。这些预防措施，以避免建立一个国家其中t他盖玻片显示太高（ 图1A和1B）或过低（ 图1C和1D）盖玻片上的金纳米粒子的浓度。
总体而言，phagokinetic的轨道蠕动法是一种简单的方法来分析细胞的运动。它提供了一个快照的距离（通过最后的轨道区域），在定义的时间帧中提出一个细胞。此外，该法是非常适合于多种刺激，也就是说，研究细胞可以测试下的各种治疗方案的选择。例如，在我们的单核细胞的实验中，我们已经测试过的病毒感染，细胞因子治疗，生长因子处理后，丝裂原处理，LPS处理单核细胞的活力。此外，我们还测试了这些被激活的单核细胞抑制剂/抑制条件下的各种功能检查各种生化/分子途径发挥在单核细胞活力的作用。与伤口愈合测定31，measurin不同GA累积效应细胞增殖和迁移，或迁移实验32 Boyden小室（反井），允许大量分析细胞趋化运动性，phagokinetic轨道运动性分析评估单个细胞的迁移。然而，如果有一个需要堆积的趋化作用，以进行测量，一个三维的迁移/入侵以进行评估，蜂窝式运动的更详细的分析，或在体内条件下的细胞运动的分析，该协议会是不够的，使用其他方法，如反式孔迁移实验，基底膜侵袭实验33，活的时间推移显微镜/摄影34,35等将需要考虑。
phagokinetic轨道蠕动测定是一个简单的，定量评价/比较的能力，细胞迁移，而不需要使用昂贵的显微镜和分析软件。这是给RESE弓箭手需要一个快速和容易的，但可靠的方法来量化细胞的活力，提供了一个简单的高通量检测的可能性。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国家卫生研究院（AI050677，HD-051998，GM103433），马尔科姆·费斯特心血管研究奖学金，和美国心脏协会博士前的奖学金（10PRE4200007）的补助支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Coverslips (15mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| Gelatin 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| Tetrachloroauric Acid Trihydrate | Fisher Chemical | G54-1 | 14.5 mM (a final working solution) |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | BP327-500 | 0.5% (a final working solution) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 3% (a final working solution) |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Sarstedt | 83.1802 | |
| 12-Well Plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Oven Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | The standard laboratory oven will suffice |
| 10 ml Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-Aid Filler/Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 Single-Channel Manual Pipette | Rainin | PR-200 | |
| 200 ml Barrier Tips | CLP | BT200 | |
| ImageJ software | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | License: Public Domain | |
| Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera | Nikon | Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes. | |
| Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications. | |||
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