Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een kwantitatieve evaluatie van celmigratie door de Phagokinetic Track Motiliteit Assay

Published: December 4, 2012 doi: 10.3791/4165

Summary

De phagokinetic motiliteit spoor assay is een methode om de beweging van cellen te beoordelen. Met name de test meet chemokinesis (random celmotiliteit) in de tijd op een kwantitatieve wijze. De assay maakt gebruik van het vermogen van cellen om een ​​meetbare spoor van de beweging van colloïdaal goud gecoate dekglaasjes maken.

Abstract

Cellulaire beweeglijkheid is een belangrijk biologisch proces voor zowel eencellige en meercellige organismen. Het is essentieel voor verplaatsing van eencelligen naar een bron van voedingsstoffen of weg van onjuiste wijze, en in meercellige organismen voor weefselontwikkeling, immune surveillance en wondheling, maar een paar rollen 1,2,3 noemen. Deregulering van dit proces kan leiden tot ernstige neurologische, cardiovasculaire en immunologische ziekten, evenals verergerd tumorvorming en verspreid 4,5. Moleculair hebben actine polymerisatie en receptor recycling aangetoond een belangrijke rol spelen bij het ​​cellulaire extensions (lamellipodia), dat de voorwaartse beweging van de cel 6,7,8 rijden. Echter, veel biologische vragen over de migratie van cellen blijven onbeantwoord.

De centrale rol voor cellulaire motiliteit in de menselijke gezondheid en ziekte onderstreept het belang van het begrijpen van de specifieke mechanisms bij dit proces en maakt nauwkeurige methoden voor het evalueren celmotiliteit bijzonder belangrijk. Microscopen worden meestal gebruikt om de beweging van cellen te visualiseren. De cellen gaan nogal langzaam, waardoor de kwantitatieve meting van celmigratie een resource-vend proces dat dure camera's en software kwantitatieve tijd lapsed films beweeglijke cellen. Daarom is de mogelijkheid om een ​​kwantitatieve meting van celmigratie die kosteneffectief, niet bewerkelijk en die gebruik gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur voeren is een grote behoefte aan veel onderzoekers.

De phagokinetic spoor motiliteit assay maakt gebruik van het vermogen van een bewegend cel gouddeeltjes zuiveren van de weg naar een meetbare spoor maken op een colloïdaal goud beklede glazen dekglaasje 9,10. Met het gebruik van vrij beschikbare software kunnen meerdere sporen worden geëvalueerd voor elke behandeling statistische vereisten bereiken. De assay kan worden gebruikt om te beoordelenmotiliteit van veel celtypen, zoals kankercellen 11,12, fibroblasten 9, neutrofielen 13, skeletspiercellen 14, keratinocyten 15, trofoblasten 16, 17 endotheelcellen en monocyten 10,18-22. Het protocol omvat het creëren van dia bekleed met goud nanodeeltjes (Au °) die worden gegenereerd door een vermindering van chloroauric acid (Au 3 +) door natriumcitraat. Deze methode is ontwikkeld door Turkevich et al.. In 1951 23 en verbeterd in de jaren 1970 door Frens et al.. 24,25. Als gevolg van deze chemische reductie stap gouddeeltjes (10-20 nm in diameter) precipiteren uit het reactiemengsel en kan worden toegepast op dekglaasjes, die dan klaar voor gebruik in cellulaire migratie analyse 9,26,27.

In het algemeen phagokinetic spoor beweeglijkheid assay is een snelle, kwantitatieve en eenvoudig meten van cellulaire motiliteit. Bovendienkan worden gebruikt als een eenvoudige high-throughput assay voor gebruik met celtypen die niet vatbaar zijn voor time-lapsed beeldvorming, evenals andere toepassingen afhankelijk van de behoeften van de onderzoeker. Samen het vermogen om cellulaire motiliteit van meerdere celtypen kwantitatief te meten zonder dure microscopen en software samen met het gebruik van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur en chemicaliën, maken het phagokinetic spoor motiliteit assay een goede keuze voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in het begrijpen van cellulaire motiliteit.

Protocol

1. Bereiding van gelatine beklede dekglaasjes

  1. Place zuur gewassen dekglaasjes (15 mm in diameter) in een steriele plastic 100 mm schaal (es). Plaats acht-negen coverslips per schaal en zorg ervoor dat ze elkaar niet aanraken of de zijkanten van de schotel ..

Opmerking: dekglaasjes, naalden en pincet moeten steriel mogelijke verontreinigende micro-organismen en endotoxinen die invloed cellulaire functies, waaronder motiliteit elimineren.

  1. Weeg de gelatinepoeder en resuspendeer de poeder in gedeïoniseerd water met een gelatine-oplossing te maken met een eindconcentratie van 0,5 g/300 ml. Vervolgens wordt de gelatine oplossing worden geautoclaveerd.
  2. Pipetteer 2-3 druppels van gelatine (~ 100-150 ml) op elke dekglaasje aan.

Opmerking: Let erop dat de gelatine om de schotel aan te raken of je zal niet in staat zijn om de dekglaasjes te verwijderen uit de schotel.

    Bak de gelatine beklede dekglaasjes in de 100 mm schaal in een oven bij 90 ° C gedurende 10 minuten.
  1. Verwijder het teveel aan gelatine door zachte pipetteren.
  2. Droog de dekglaasjes in de 100 mm schaal in de oven bij 70 ° C gedurende 45 minuten.
  3. Eenmaal droog, verwijder de dekglaasjes van de 100 mm schaal met behulp van een steriele, endotoxine-vrij naald en pincet (de naald wordt gebruikt om voorzichtig duwtje de dekglaasje toegankelijk te maken voor de pincet om voorzichtig te verwijderen).
  4. Plaats individuele gelatine beklede dekglaasjes in afzonderlijke putjes van een 24-wells schaal.

2. Bereiding van colloïdaal goud beklede dekglaasjes

  1. Weeg een geschikte hoeveelheid chloroauric zuur (tetrachlorogoudzuur trihydraat; HAuCl4 · 3H 2 O) en resuspendeer in steriel gedeïoniseerd water om een uiteindelijke 14,5 mM oplossing (toxisch) te bereiden. Bereid 1,5 ml van de oplossing per 8-9 coverslips.

Waarschuwing: Chloroauric zuur is harmvol opname door de mond, veroorzaakt ernstige brandwonden en oogletsel en kan een allergische huidreactie veroorzaken. Giftig bij inslikken.

  1. Weeg een geschikte hoeveelheid natriumcitraat (trinatrium diwaterstof 2-hydroxypropaan-1 ,2,3-tricarboxylaat, Na 3 C 6 H 5 O 7) en resuspendeer de poeder in gedeïoniseerd water om een uiteindelijke 0,5% oplossing. Bereid 1 ml van de oplossing per 8-9 coverslips.

Waarschuwing: Natriumcitraat kan oog-en huidirritatie veroorzaken. Het kan ook irritatie van de luchtwegen en het spijsverteringskanaal irritatie.

  1. In een steriele, endotoxinevrij bekerglas combineren 1,5 ml van de steriele 14,5 mM HAuCl4-oplossing en 13,5 ml steriel gedeïoniseerd water, door deze maatregelen een lichtgele oplossing verkregen. Bovengenoemde volumes stellen voor 8-9 colloïdaal goud dekglaasjes worden gemaakt.
  2. Terwijl continu roeren verwarmen van de oplossing op een hete plaat tot het begint te bolie.

Waarschuwing: de verwarming van de oplossing moet worden uitgevoerd in de zuurkast als dampen kunnen schadelijk / giftig. De dampen zijn destructief voor het weefsel van de slijmvliezen en de bovenste luchtwegen.

  1. Neem het bekerglas van de kookplaat.
  2. Onder roeren, voeg 0,7 ml van de 0,5% natriumcitraatoplossing. Bovengenoemde volume zal voor 8-9 colloïdaal goud dekglaasjes worden gemaakt.
  3. Blijf roeren deze gecombineerde oplossing voor ongeveer 2 minuten (Let op: De kleur van de oplossing zal geleidelijk veranderen van licht geel, met, duidelijk uit grijs, paars, tot diep paars, voordat ze uiteindelijk het bereiken van een rode wijn of, bij voorkeur, roest kleur) . Dit product is uw colloïdaal goud-oplossing.
  4. Koel de oplossing colloïdaal goud in een 10 ml pipet voor 1-2 min (om de gelatinelaag op het dekglaasje houden van smelten wanneer het colloïdale goud oplossing toegevoegd) en voeg 1,0-2,0 ml colloidal goud oplossing op elk gelatine-gecoate dekglaasje eerder geplaatst in een 24-wells schotel (s) (het bedrag van de colloïdaal goud oplossing die u toevoegt aan de gelatine-gecoate dekglaasjes hangt af van hoe goed de gouddeeltjes neergeslagen in de oplossing - zie opmerkingen hieronder).

Opmerking: Omdat er misschien verschillen in de efficiëntie van gouddeeltje neerslag wordt geadviseerd om eerst toevoegen 0,5-1 ml van de oplossing colloïdaal goud aan de gelatine gecoate dekglaasjes en vervolgens de 24-well gerecht in de incubator gedurende 0,5 uur . Na deze incubatie tijd moet de dekglaasjes worden gecontroleerd onder de lichtmicroscoop voor de dichtheid van de gouddeeltjes op de dekglaasjes. Zie figuur 1 voor 20x microscopiebeelden voorbeelden van te lage en te hoge concentratie van gouddeeltjes. Zie figuur 2 voor 40x microscopiebeelden een ideale concentratie van gouddeeltjes (tenminste voor gebruik met monocyten). De optiMAL dichtheid van de gouden nanodeeltjes op de dia proefondervindelijk worden bepaald voor elke gebruikte celtype, de kenmerken van de verschillende cellen hun sterkte verkeer dicteren dekglaasjes. Indien de concentratie van gouddeeltjes onvoldoende, een extra 0,5-1 ml van het colloïdaal goud oplossing van het met gelatine beklede dekglaasjes.

Afhankelijk van de celgrootte, kunnen de juiste concentraties van gouddeeltjes variëren en dus uiteindelijk afhangen van de grootte van de cel onderzocht motiliteit. Bijvoorbeeld met humane monocyten zijn kleine cellen (~ 10-20 um 28) werd een hogere concentratie van goud deeltjes vereist in de analyses. De juiste verdeling van goud nanodeeltjes biedt de onderzoeker de mogelijkheid om eenvoudig en efficiënt te onderscheiden van de randen van cellulaire tracks. Een concentratie van gouddeeltjes te hoge belemmert het vermogen van cellen om daardoor bewegen en een nauwkeurige metinghun beweeglijkheid, terwijl een concentratie van gouddeeltjes te lage grenzen zijn dat men een nauwkeurig bij motiliteit bakenen.

Belangrijke opmerking: Als de synthese van goud nanodeeltjes is problematisch, gesynthetiseerd goud nanodeeltjes zijn commercieel verkrijgbaar in de maten van 5 nm tot 400 nm. Daarnaast zijn fluorescerende microbolletjes ook gebruikt in studies van celmotiliteit 29. Het gebruik van deze microsferen is een fluorescentiemicroscoop voor de analyse van celmigratie.

  1. Plaats de 24-well schaal met colloïdaal goud bedekte dekglaasjes in een incubator bij 37 ° C en incubeer 1 uur tot 's nachts.
  2. Na incubatie, spoelen / verwijderen ongebonden goud door dompelen de dekglaasjes (3x) in steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4).
  3. Plaats deze colloïdale goud beklede dekglaasjes in een schone 12-well schaal (es) met PBS.
  4. Bewaar deze dekglaasjes bij 4 ° C tot klaar tegebruiken (parafilm de plaat voor het plaatsen in de koelkast).

Belangrijk: altijd het colloïdale goud gecoate dekglaasjes houden in een soort van vloeibare / media als gouddeeltjes kan afschilferen van de dekglaasjes bij opdrogen. De colloïdaal goud dekglaasjes moet worden gebruikt binnen 2-3 maanden na de datum waarop ze werden gemaakt.

Kwaliteitscontrole: In een phagokinetic spoor motiliteit assay, is het essentieel om dekglaasjes die worden gekenmerkt door een vergelijkbare concentratie van gouddeeltjes gebruikt. Deze eenvoudige punt zal de kwantitatieve verschillen in cellulaire motiliteit tussen monsters als uitsluitend door de aard van de behandeling en niet de fysische eigenschappen van het colloïdale goud gecoate dekglaasjes. Wij geven de voorkeur met alleen dekglaasjes die tegelijkertijd in afzonderlijke experimenten, hoewel we hebben aangetoond dat zolang de dichtheid van de gouden nanodeeltjes gelijk zijn, het gebruik van dekglaasjesuit verschillende preparaten geschikt.

3. Analyse van de Cellulaire Motiliteit

  1. Plaats de colloïdale goud gecoate dekglaasjes in een geschikte cellulaire media voor de cellen van belang.
  2. Breng passende behandelde cellen aan de colloïdale goud gecoate dekglaasjes in een 24-wells schaal (es)

Opmerking: Het aantal cellen overgeheveld naar de put moet worden bepaald voor elk celtype onderzocht. Idealiter cellen moeten gelijkelijk verdeeld over de colloïdale goud gecoate dekglaasje, die op hun beurt zorgen voor de statistische analyse van slechts sporen die door een enkele cel. Als cellen worden uitgeplaat bij een te hoge concentratie, wordt zeer waarschijnlijk dat overlappende fragmenten van meerdere cellen worden gezien. Overlappende titels niet nauwkeurig kunnen worden gekwantificeerd en dus kunnen zij niet worden meegenomen in de analyses van de beweging van de geteste cellen. Overlappende sporen als gevolg vanbetrokkenheid van meerdere cellen zijn meestal gemakkelijk waargenomen, zoals samengevoegd of gepasseerd tracks (in het gebied van analyse) waarin twee of meer cellen worden waargenomen in dezelfde aaneengesloten open plek.

  1. Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 24 uur (of elke geschikte tijd, bijvoorbeeld we hebben geanalyseerd monocyte beweeglijkheid tussen 6 uur en 24 uur na behandeling en endotheelcellen op 12 uur na de behandeling). De optimale tijd voor het bepalen en het meten van cellulaire motiliteit zal variëren met het celtype onderzocht en derhalve proefondervindelijk worden bepaald voor elk celtype (een goed uitgangspunt, echter is 6 - 12 uur na behandeling).

Opmerking: Als experimentele colloïdaal goud beklede dekglaasjes moeten worden opgeslagen en / of geanalyseerd op een later tijdstip, de cellen en goud nanodeeltjes moeten worden vastgesteld op dekglaasjes. Om dit te bereiken fixatie stap; volgende stap 3.3, eerste wasbeurt dekglaasjes voorzichtig 2 keer met 1xPBS (onderdompelen van dekglaasjes de voorkeur, als verwijdering van goud nanodeeltjes uit coverslips moet worden vermeden), gebruik dan een standaard mobiele fixatiemethode zoals incubatie met kamertemperatuur 3% paraformaldehyde. Na 15 min incubatie dient de 3% paraformaldehyde worden verwijderd en de dekglaasjes gewassen voorzichtig 3 maal met 1 x PBS. De vaste coverslips kunnen worden opgeslagen in een koelkast.

  1. Met behulp van een lichtmicroscoop, foto's maken van de tracks die door een enkele bewegende cel (Opmerking: De vergroting wordt gebruikt om foto's van cellulaire tracks te nemen zal zeker afhankelijk van het celtype in onderzoek). Voorbeelden van cellulaire tracks gecreëerd door niet-beweeglijke en beweeglijke cellen van colloïdaal goud gecoate dekglaasjes worden getoond in Figuur 2.

Opmerking: De gouden nanodeeltjes van de grootte in de phagokinetic spoor motiliteit assay is gebleken volledig toxisch voor cellen 30. Eventueel, De levensvatbaarheid van de cellen onderzocht worden beoordeeld door kleuring met trypan blauw of onderzocht op andere markers van cellulaire levensvatbaarheid. Zou men rekening houden met de noodzaak voor fixatie, soort bevestiging enz., indien deze stap moet worden uitgevoerd.

  1. Door de vrij beschikbare software, zoals ImageJ software ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) of NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ), beide ontwikkeld op National Institutes of Health, of ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ) ontwikkeld aan de Universiteit van Texas Health Science Center in San Antonio, de gemiddelde oppervlakte (in willekeurige eenheden) van colloïdaal goud gewist door 10-20 of meer cellen (per monster) wordt per experimentele arm van de vastgelegde beelden. Statistieken kunnen dan worden uitgevoerd op thij verzamelde resultaten. Bijvoorbeeld, kunnen de resultaten worden uitgezet als gemiddelden ± de standaardfout van de middelen (SEM) met de uitgeoefende Student's t test, en een P-waarde van <0,05 als de mate van statistische significantie tussen de monsters. Figuren 3 en 4 tonen stappen in de analyse van het gebied van colloïdaal goud vrijgegeven door de cel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Getoond is een voorbeeld van beelden die onder een lichtmicroscoop met een trackgebied gewist door een cel (een monocyt van onze experimenten is getoond in figuur 2). Niet-beweeglijke cellen te creëren karakteristieke kleine, ovale of cirkelvormige stukken rond zichzelf wijst op een laag basaal niveau van verkeer van deze gestimuleerde cellen (Figuren 2A en 2B). Daarentegen zijn zeer beweeglijke cellen [in ons systeem, menselijk cytomegalovirus (HCMV)-geïnfecteerde cellen] gekenmerkt door een gerichte beweging getoond in Figuren 2C en 2D als langwerpige baan gebieden. Na meerdere foto spoor gebieden met een omgekeerde microscoop met 40x objectief werden de totale spoor gebieden gemarkeerd met de ImageJ software (figuur 3) vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen met andere toepassingen. Wij geven de voorkeur de ImageJ software want het is gratis en gemakkelijk te gebruiken. Beweeglijke cellen maken geen standaard, geometrische gevormde sporen during hun beweging, dus een handige manier om de te analyseren teken is dat de losse hand in de ImageJ software selecteren om de vorm van het spoor die door de bewegende cel (figuur 3) markeren. Na afgebakend het spoor gebied dat moet worden geanalyseerd, de kwantitatieve meting van de gegevens wordt uitgevoerd door te klikken op "Analyse" in de ImageJ menubalk en te kiezen voor "Measure" uit het pull-down menu. Een monster van onze resultaten in willekeurige eenheden verkregen door analyse van de cellulaire spoor gebieden vanuit de gegevens in figuur 3 is weergegeven in Figuur 4A. De resultaten vanuit het ImageJ software kan vervolgens worden geanalyseerd in een spreadsheet keuze, teneinde de berekening van de gemiddelde trackgebied gewist per cel zoals weergegeven in figuur 4B.

In onze ervaring, het meest problematische stap van het protocol is de productie van colloïdaal goud gecoate dekglaasjes, het punt van zorg is de gENERATIE van dekglaasjes met een uniforme dekking van goud nanodeeltjes (met betrekking tot deze zorg worden besproken in 2.8 hierboven). Geschikte, gelijkmatig over goud nanodeeltjes op coveslip is weergegeven in figuur 2. Dekking die te dicht (Figuren 1A en 1B) of te dun (figuren 1C en 1D) voorkomt celmigratie of verandering van de reproduceerbare analyse van de grootte en de vorm van het spoor gebied. Het tweede belangrijke punt zoals in 3.2 hierboven, is de dichtheid van de geplateerde cellen en de noodzaak overlapping of samengevoegd tracks uit meerdere cellen voorkomen.

Figuur 1
Figuur 1. Potentiële problemen met de dichtheid van colloïdaal goud op de dekglaasjes. Getoond in deze figuur zijn voorbeelden van colloïdaal goud beklede dekglaasjes met ofwel een te hoge (Panels B) of te laag (Panels C en D) dichtheid van goud nanodeeltjes. Beide voorbeelden zal leiden tot slechte verzamelen van gegevens en statistische analyses. Opmerking: Ongepast concentraties chloroauric zuur of natriumcitraat, als langdurig koken van de reactieoplossing, kan deze ongewenste resultaten. Plaatjes werden met een 20x objectief. Opmerking: Paneel D ook toont ongewenste aggregaten van goud nanodeeltjes op het glas dekglaasjes. Grootte balk komt overeen met 50 urn in lengte.

Figuur 2
Figuur 2. Voorbeelden van sporen die door niet-beweeglijke (Panels A en B) en beweeglijk (Panels C en D) cellen van colloïdaal goud gecoate dekglaasjes. Virus-vrij medium (mock-geïnfecteerde) of media die virusdeeltjes (HCMV-geïnfecteerde) werden toegevoegd geïsoleerd randapparatenal bloedmonocyten 10,18-22. Monocyten werden geïncubeerd bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 1 uur en uitgeplaat op colloïdaal goud beklede dekglaasjes gedurende 24 uur bij 37 ° C / 5% CO 2. Foto's zijn gemaakt met behulp van een 40x objectief. Witte pijlen geven monocyten in hun definitieve plaats. We hebben aangetoond eerder 10,18-22 worden geïnfecteerde monocyten gekenmerkt door een laag basaal niveau van motiliteit, terwijl HCMV-geïnfecteerde cellen vertonen kenmerken van hoge motiliteit. Grootte balk komt overeen met 25 pm in lengte.

Figuur 3
Figuur 3. Markering het gebied van de cellulaire fragmenten met ImageJ software. Getoonde voorbeelden snapshots sporen, waarbij de Image J software werd gebruikt bij de analyse van de sporen die door niet-beweeglijke (Panels A en B) en beweeglijk (Panels C enD) cellen van colloïdaal goud gecoate dekglaasjes (Opmerking: Tracks worden omringd door een witte lijn met de ImageJ uit de losse hand). Het monster's, dezelfde als die getoond in Figuur 2, werden in dit figuur spoor gebieden verwijderd door een cel te meten. Dit zijn representatieve beelden van mock-en HCMV-geïnfecteerde monocyten zijn echter gewoonlijk 10-20 beelden per monster geanalyseerd. Grootte balk komt overeen met 25 pm in lengte.

Figuur 4
Figuur 4. De kwantitatieve evaluatie van celbeweeglijkheid gebruik ImageJ Software en Spreadsheet. A) Gemeten spoor gebieden geklaard door cellen, zoals afgebeeld in de testopnames (figuren 2 en 3) met behulp van de software ImageJ. De berekende resultaten # 1, # 2, # 3 en # 4 bevatten Panels A B, C en D in figuren 2 en 3 respectievelijk B) een grafische weergave van de gemiddelde gebieden (middelen;. in willekeurige eenheden) geklaard door cellen en geanalyseerd door de ImageJ software. In dit voorbeeld is de standaardfout van het gemiddelde niet getoond omdat in het voorbeeld een onvoldoende aantal herhalingen wordt geanalyseerd. Opmerking: De ImageJ software biedt de gemeten oppervlakte van tracks in willekeurige eenheden, daarom is het essentieel om foto's van de tracks die op grond van dezelfde vergroting te vergelijken. De eenvoudigste methode om resultaten te vergelijken van afzonderlijke experimenten is te vergelijken voudig veranderingen tussen onderzochte monsters.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De phagokinetic spoor beweeglijkheid test die in dit artikel is een eenvoudige en zeer effectieve methode voor de kwantitatieve analyse van cel migratie. Omdat meerdere celtypen kunnen worden geanalyseerd 9-17, deze werkwijze heeft het potentieel brede gebruik over meerdere disciplines. Het gebruik van colloïdaal goud beklede dekglaasjes maakt de meting van een trackgebied gewist door een bewegende cel. De test kan van het effect van verschillende stimuli (bijvoorbeeld groeifactoren, gezuiverd ECM liganden, virussen, bacteriën) op celmotiliteit. Bovendien, een gebrek aan de vereiste cel bevestiging maakt controle van celmigratie op verschillende experimentele tijdstippen. Bovendien is de test vereist slechts een standaard lichtmicroscoop, een standaard camera met een CCD (Charge Coupled Device) beeldsensor en vrij beschikbare software. Daarom worden de geavanceerde microscopen en camera's niet nodig, noch speciale software pakketten. Hoewel de kontay is eenvoudig in ontwerp, het is een krachtig hulpmiddel om de beweeglijkheid van meerdere celtypen statistisch onderzoek onder een groot aantal experimentele condities. Bijvoorbeeld, in dit opzicht, kan de test worden gebruikt om effectief te studeren een klein aantal experimentele monsters, alsook effectief als een high throughput screening assay. Omdat de dekglaasjes worden onderzocht losgemaakt, kan de test ook mogelijk voor de analyse van bewegende cellen tijd zonder een microscoop met een omsloten bevochtigde verwarmd CO 2 incubator. Bovendien, de phagokinetic spoor motiliteit assay is nuttig in het bestuderen van een motiliteit van cellen niet lenen voor een time-lapse imaging, als fotobleken van fluorofoor-gekleurde cellen is minder groot probleem in het colloïdale goud-gebaseerde assay motiliteit. De kwantitatieve evaluatie van het spoor gebieden gewist door een cel mogelijk door de vrij beschikbare ImageJ software, hoewel andere software kan worden gebruikt. Bovendien is de totale Graphical en statistische analyses verkregen vereisen slechts een basiskennis van berekeningen, spreadsheets en statistieken.

Opgemerkt dat de oorspronkelijke methode het gebruik van runderserumalbumine (BSA) aan de dekglaasjes 9 Deksel beschreven. Is echter het gebruik van BSA onbetrouwbaar blijken te zijn als een middel om de uniforme colloïdaal goud monolayer 27. De vervanging van gelatine voor BSA, als coating van de dekglaasje's, verhoogde de hechting van gouden nanodeeltjes op de dekglaasje aan. Extra wijzigingen die Scott et al.. Protocol 27 van de sterk verbeterde de kwaliteit van het goud nanodeeltjes coating. Niettemin vonden we, gebaseerd op Turkevich et al.. 23, dat het gebruik van natriumcitraat als reductiemiddel zo uniform monolaag van goud nanodeeltjes gemaakt. Daarom geven wij de voorkeur deze methode en als zodanig is beschreven in ons protocol.

Om rekening te houden ahoge mate van reproduceerbaarheid van de test, is het belangrijk om strikt de hoeveelheden en temperaturen in het protocol, zoals afwijkingen kunnen beïnvloeden de uiteindelijke resultaten. Zoals hierboven besproken, een van de technische obstakels het gebruik van het spoor phagokinetic motiliteit bepaling omvat de productie van de gouden nanodeeltjes in de oplossing en het verkrijgen van een geschikte uniforme concentratie van de gouden nanodeeltjes op het dekglaasje. Dus, hoewel de gouden nanodeeltjes neerslag stap is reproduceerbaar, plaatsen we de nadruk op de beoordeling van de kleur van de uiteindelijke oplossing van neergeslagen goud nanodeeltjes. Bovendien is onze reden voor het toevoegen van slechts de helft van het normale volume van de eindoplossing op elke dekglaasjes en vervolgens na 0,5 uur evaluatie van de dichtheid en uniformiteit van de gouddeeltjes op de dekglaasjes (met de mogelijkheid om extra oplossing toegevoegd, indien later nodig). Deze voorzorgsmaatregelen zijn genomen om te voorkomen dat een staat waar thij coverslips toon te hoog (Figuren 1A en 1B) of te laag (Figuren 1C en 1D) een concentratie van goud nanodeeltjes op dekglaasjes.

Over het geheel genomen de phagokinetic spoor beweeglijkheid test is een eenvoudige methode om celbeweging analyseren. Het biedt een momentopname van de afstand (via de laatste track gebied) dat een cel verplaatst over een bepaalde periode. Bovendien is de test is zeer vatbaar voor meerdere stimuli, die onderzocht cellen worden getest onder verschillende behandelingen. Bijvoorbeeld, in onze experimenten monocyten, hebben we getest beweeglijkheid van viraal geïnfecteerde, cytokine behandeld, groeifactor-behandelde, mitogeen-behandelde en LPS-behandelde monocyten. Verder hebben we getest deze geactiveerde monocyten onder een verscheidenheid van remmers / remmende voorwaarden om functioneel ingegaan op de rol verschillende biochemische / moleculaire pathways spelen in monocyten motiliteit. In tegenstelling tot een wondgenezing assay 31, measuringa cumulatieve effect van celproliferatie en migratie, of een Boyden-kamer (trans-well) migratie assay 32, waardoor een bulk analyse van cel chemotactische motiliteit de phagokinetic spoor motiliteit assay evalueert de migratie van cel. Echter, als er een behoefte aan een bulk chemotactisch effect te meten, een driedimensionaal migratie / invasie te beoordelen, een meer gedetailleerde analyse van een cellulaire beweging of de analyse van celbeweging onder in vivo omstandigheden dit protocol niet voldoende en het gebruik van aanvullende methoden, zoals een trans-well migratie assay, een matrigel invasie assay 33, live time-lapsed microscopie / photography 34,35, etc. zouden moeten worden overwogen.

De phagokinetic spoor beweeglijkheid assay is een eenvoudige kwantitatieve evaluatie / vergelijking van het vermogen van cellen om te migreren zonder de noodzaak van het gebruik van dure microscopen en software in de analyses. Het richt zich tot Reseboogschutters behoefte aan een snelle en eenvoudige, maar betrouwbare methode celbeweeglijkheid kwantificeren, met een mogelijkheid van een eenvoudige high-throughput assay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (AI050677, HD-051998, en GM103433), een Malcolm Feist cardiovasculair onderzoek gemeenschap, en een American Heart Association predoctorale gemeenschap (10PRE4200007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Coverslips (15mm) Fisher Scientific 12-545-83
Gelatin 300 Bloom Sigma-Aldrich G-1890
Tetrachloroauric Acid Trihydrate Fisher Chemical G54-1 14.5 mM (a final working solution)
Sodium Citrate Fisher Scientific BP327-500 0.5% (a final working solution)
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042 3% (a final working solution)
100 mm Tissue Culture Dish Sarstedt 83.1802
12-Well Plates Fisher Scientific 08-772-29
24-Well Plates Fisher Scientific 07-200-84
Techne Oven Hybridiser HB-1D LabPlanet 2040500 The standard laboratory oven will suffice
10 ml Serological Pipettes Sarstedt 86.1254.001
Pipet-Aid Filler/Dispenser Drummond 13-681-15
P200 Single-Channel Manual Pipette Rainin PR-200
200 ml Barrier Tips CLP BT200
ImageJ software http://rsb.info.nih.gov/ij/ License: Public Domain
Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera Nikon Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes.
Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
  2. Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
  3. Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
  4. Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
  5. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  6. Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
  7. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
  8. Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
  9. Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
  10. Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
  11. Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, Humana Press. 379-392 (2010).
  12. Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
  13. Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
  14. Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
  15. Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
  16. Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
  17. McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
  18. Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
  19. Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
  20. Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
  21. Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
  22. Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
  23. Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
  24. Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
  25. Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
  26. Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
  27. Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
  28. Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
  29. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).
  30. Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
  31. Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
  32. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  33. Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
  34. Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
  35. Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).

Tags

Immunologie Microbiologie Cellular Biology Moleculaire Biologie goud nanodeeltjes dekglaasjes celmigratie kwantitatieve cel beweging microscopie motiliteit test
Een kwantitatieve evaluatie van celmigratie door de Phagokinetic Track Motiliteit Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nogalski, M. T., Chan, G. C. T.,More

Nogalski, M. T., Chan, G. C. T., Stevenson, E. V., Collins-McMillen, D. K., Yurochko, A. D. A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay. J. Vis. Exp. (70), e4165, doi:10.3791/4165 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter