Summary
Die Motilität phagokinetic Spur Assay ist ein Verfahren verwendet, um die Bewegung von Zellen beurteilen. Insbesondere misst der Test Chemokinese (random Zellmotilität) über die Zeit in einer quantitativen Weise. Der Assay nutzt die Fähigkeit von Zellen, um eine messbare Spur ihrer Bewegung auf kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern erstellen.
Abstract
Cellular Motilität ist ein wichtiger biologischer Prozess für beide einzelligen und mehrzelligen Organismen. Es ist wichtig für die Bewegung der einzelligen Organismen zu einer Quelle von Nährstoffen oder weg von ungeeigneten Bedingungen, als auch in vielzelligen Organismen für Tissue Entwicklung, Immunüberwachung und Wundheilung, nur um ein paar Rollen 1,2,3 erwähnen. Deregulierung dieses Prozesses kann zu schweren neurologischen, Herz-Kreislauf-und immunologischen Erkrankungen, sowie verschärfte Tumorbildung führen und zu verbreiten 4,5. Molekular sind Aktin-Polymerisation und Rezeptor-Recycling erwiesen wichtige Rollen bei der Schaffung zellulären Verlängerungen (Lamellipodien), die die Vorwärtsbewegung der Zelle 6,7,8 anzutreiben spielen. Allerdings bleiben viele biologische Fragen zu Zellmigration unbeantwortet.
Die zentrale Rolle für die zelluläre Motilität menschlicher Gesundheit und Erkrankungen unterstreicht die Bedeutung des Verständnisses der spezifischen mechanisms an diesem Prozess beteiligt und macht genaue Methoden zur Bewertung Zellmotilität besonders wichtig. Mikroskope werden üblicherweise verwendet, um die Bewegung von Zellen visualisieren. Allerdings bewegen Zellen eher langsam, so dass die quantitative Messung der Zellmigration eine Ressource langwieriger Prozess erfordern teure Kameras und Software, um quantitative Zeitraffer Filme von beweglichen Zellen zu schaffen. Daher ist die Fähigkeit, eine quantitative Messung der Zellmigration, die kostengünstige, nicht mühsam, und daß nutzt gemeinsamen Laborgeräten ist ausführen ein großer Bedarf für viele Forscher.
Die Spur phagokinetic Motilität Assay nutzt die Fähigkeit einer Zelle zu bewegenden Goldpartikel aus seiner Bahn zu löschen, um eine Spur auf einer messbaren kolloidalem Gold beschichteten Deckgläschen 9,10 erstellen. Mit dem Einsatz von frei verfügbarer Software, können mehrere Spuren für jede Behandlung, die statistischen Anforderungen erfüllen ausgewertet werden. Der Assay kann verwendet werden, um zu beurteilenMotilität von vielen Zelltypen, wie Krebszellen 11,12, Fibroblasten 9, Neutrophilen 13, Skelettmuskelzellen 14, Keratinozyten 15, Trophoblasten 16, 17 Endothelzellen und Monozyten 10,18-22. Das Protokoll beinhaltet die Erzeugung von Folien mit Gold-Nanopartikeln (Au °), die durch eine Reduktion von Chlorgoldsäure (Au 3 +) durch Natriumcitrat erzeugt beschichtet sind. Diese Methode wurde von Turkevich et al. Im Jahr 1951 23 und dann verbesserte sich in den 1970er Jahren von Frens et al. 24,25. Als Ergebnis dieser chemischen Reduktionsschritt auszufällen Goldpartikel (10 bis 20 nm Durchmesser) aus der Reaktionsmischung und kann auf Deckgläschen, die dann bereit für die Verwendung in Zellwanderung Analysen 9,26,27 aufgebracht werden.
Im Allgemeinen ist die Spur phagokinetic Motilität Assay eine schnelle, quantitative und einfache Maßnahme zellulärer Motilität. Darüber hinaus ist eskann als einfache Hochdurchsatz-Assay verwendet werden, zur Verwendung mit Zelltypen, die nicht zugänglich sind Zeitraffer Bildgebung, sowie andere Anwendungen in Abhängigkeit von den Bedürfnissen der Forscher. Zusammen, die Fähigkeit, quantitativ zu messen zellulären Motilität von mehreren Zelltypen, ohne die Notwendigkeit für teure Mikroskope und Software, zusammen mit der Verwendung von gemeinsamen Laborgeräte und Chemikalien machen den phagokinetic Spur Motilität Assay eine gute Wahl für die Wissenschaftler mit einem Interesse für das Verständnis zellulärer Motilität.
Protocol
Ein. Herstellung von Gelatine-beschichtete Deckgläser
- Ort acid-washed Deckgläschen (15 mm Durchmesser) in einem sterilen 100-mm-Schale (n). Zeigen 8-9 Deckgläser pro Gericht und sicherzustellen, dass sie nicht gegenseitig berühren oder die Seiten der Schüssel ..
Anmerkung: Die Deckgläser, Nadeln und Pinzette müssen steril sein, um mögliche kontaminierenden Mikroorganismen sowie Endotoxine, die zellulären Funktionen, einschließlich Motilität beeinflussen eliminieren.
- Wiegen die Gelatinepulver und resuspendieren des Pulvers in entionisiertem Wasser auf eine Gelatine-Lösung mit einer Endkonzentration von 0,5 g/300 ml betrug. Weiter muss die Gelatinelösung zur autoklaviert werden.
- Pipette 2-3 Tropfen Gelatine (~ 100-150 ml) auf jedes Deckglas.
Hinweis: Achten Sie darauf, nicht zu erlauben, die Gelatine in die Schale berühren oder Sie werden nicht in der Lage, die Deckgläser aus der Schale entfernen.
- Backen die Gelatine-beschichtete Deckgläser in der 100-mm-Schale in einem Ofen bei 90 ° C für 10 min.
- Entfernen Sie das überschüssige Gelatine durch vorsichtiges Pipettieren.
- Trockne die Deckgläser in der 100-mm-Schale in dem Ofen bei 70 ° C für 45 min.
- Einmal trocken, entfernen Sie die Deckgläser aus der 100-mm-Schale mit einer sterilen, Endotoxin-freie Nadel und Pinzette (die Nadel wird verwendet, um vorsichtig anzustossen das Deckglas zugänglich zu machen für die Pinzette vorsichtig entfernen).
- Platzieren einzelner Gelatine beschichtete Deckgläser in separate Vertiefungen einer 24-Well-Platte.
2. Herstellung von kolloidalem Gold beschichteten Deckgläschen
- Wiegen eine entsprechende Menge an Chlorogoldsäure (Tetrachlorogoldsäure Trihydrat; HAuCl 4 · 3H 2 O) und dann in sterilem deionisiertem Wasser suspendieren, um eine endgültige 14,5 mM Lösung (giftig) vorzubereiten. Planen 1,5 ml der Lösung pro 8-9 Deckgläsern.
Warning: Chlorogoldsäure ist harmful bei Verschlucken bewirkt schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden und kann allergische Hautreaktionen verursachen. Giftig beim Verschlucken.
- Wiegen einer geeigneten Menge Natriumcitrat (Trinatrium dihydrogen 2-hydroxypropan-1 ,2,3-tricarboxylat; Na 3 C 6 H 5 O 7) und dann das Pulver resuspendieren in entionisiertem Wasser, um eine endgültige 0,5% ige Lösung herzustellen. Planen 1 ml der Lösung pro 8-9 Deckgläsern.
Warning: Natriumcitrat kann Augen und Haut reizen. Es kann auch die Atemwege und den Verdauungstrakt reizen.
- In einer sterilen, Endotoxin-frei kombinieren Becherglas 1,5 ml des sterilen 14,5 mM HAuCl 4-Lösung und 13,5 ml sterilem, deionisiertem Wasser, das Ergebnis sollte eine schwach gelbe Lösung erhalten wurde. Die oben genannten Mengen werden für 8-9 kolloidalem Gold Deckgläser gemacht werden können.
- Unter ständigem Rühren erhitzt, die Lösung auf einer heißen Platte, bis sie zu b beginntÖl.
Warnung: Die Erwärmung der Lösung sollte im Abzug durchgeführt werden, als Dämpfe schädlich sein kann / giftig. Die Dämpfe sind schädlich für das Gewebe der Schleimhäute und oberen Atemwege.
- Entfernen Sie das Becherglas von der Heizplatte.
- Unter Rühren hinzufügen, 0,7 ml der 0,5% Natriumcitrat-Lösung. Die oben erwähnte Volumen wird für 8-9 kolloidalem Gold Deckgläser gemacht werden können.
- Halten Sie das Rühren diese kombinierte Lösung für ca. 2 min (Hinweis: Die Farbe der Lösung wird allmählich von schwachen gelben verändern, zu löschen, zu grau, zu lila, Deep Purple, bevor sie schließlich erreichte einen Rotwein oder vorzugsweise Rostfarbe) . Dieses Produkt ist Ihr kolloidalem Gold Lösung.
- Man kühlt die kolloidale Goldlösung in einer 10 ml Pipette für 1-2 min (in der Reihenfolge, um die Gelatine-Schicht auf dem Deckglas aus Schmelzen zu halten, wenn die kolloidale Goldlösung hinzugefügt wird) und dann Hinzufügen von 1,0 bis 2,0 ml der colloidal Gold Lösung auf jede mit Gelatine beschichteten Deckgläschen zuvor in einer 24-Well-Platte (n) (die Menge der kolloidalen Goldlösung, dass sie zu den Gelatine-beschichtete Deckgläser hinzuzufügen abhängig, wie gut die Goldpartikel präzipitiert in der Lösung angeordnet - siehe Anmerkungen unten).
Hinweis: Da es Unterschiede in der Effizienz der Goldpartikel Niederschläge sein könnte, ist es ratsam, zuerst hinzufügen 0,5-1 ml von kolloidalem Gold Lösung der Gelatine-beschichteten Deckgläsern und dann die 24-Well-Platte in den Inkubator für 0,5 h . Nach dieser Inkubationszeit sollten die Deckgläser unter dem Lichtmikroskop auf die entsprechende Dichte der Goldpartikel auf den Deckgläschen überprüft werden. Siehe Abbildung 1 für 20x Mikroskopiebilder von Beispielen zu niedrig und eine zu hohe Konzentration von Goldpartikeln. Siehe Abbildung 2 für 40x Mikroskopiebilder eines idealen Konzentration von Goldpartikeln (mindestens für die Verwendung mit Monozyten). Die optimal Dichte der Goldnanopartikel auf der Folie sollte experimentell für jeden Zelltyp bestimmt werden, da die Eigenschaften der verschiedenen Zellen ihre Festigkeit Bewegung auf den Deckgläschen diktieren. Wenn die Konzentration von Goldpartikeln unzureichend ist, eine zusätzliche 0,5-1 ml des kolloidalen Goldlösung den Gelatine-beschichtete Deckgläser.
Abhängig von der Größe der Zellen, können die entsprechenden Konzentrationen von Goldpartikeln variieren und damit letztlich von der Größe der Zelle für Motilität untersucht abhängen. Beispielsweise mit humanen Monozyten wobei klein bemessenen Zellen (~ 10-20 um 28) wurde eine höhere Konzentration von Goldpartikeln in die Analysen benötigt. Die geeignete Verteilung von Goldnanopartikeln stellt dem Forscher die Fähigkeit, leicht und effizient Unterscheidung der Kanten der zellulären Spuren. Eine Konzentration von Goldpartikeln, die zu hoch ist behindert die Fähigkeit von Zellen zu bewegen und somit die genaue Messungihre Beweglichkeit, während eine Konzentration von Goldpartikeln, die zu niedrig Grenzen eine Fähigkeit, einen genauen Überblick über Motilität abzugrenzen ist.
Wichtiger Hinweis: Wenn die Synthese von Gold-Nanopartikeln ist problematisch sind synthetisiert Gold-Nanopartikeln kommerziell erhältlich in den Größen von 5 nm bis 400 nm auf. Zusätzlich haben fluoreszierenden Mikrosphären auch in Studien der Zellmotilität 29 verwendet worden. Jedoch erfordert die Verwendung dieser Mikrokugeln eines Fluoreszenzmikroskops für die Analyse der Zellmigration.
- Legen Sie die 24-Well-Platte mit kolloidalem Gold bedeckten Deckgläschen in einem Brutschrank bei 37 ° C und inkubieren von 1 h bis über Nacht.
- Nach Inkubation spülen / Entfernen ungebundenen Gold durch Eintauchen der Deckgläser (3x) in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4).
- Legen Sie diese kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern in einem sauberen 12-Well-Platte (n) mit PBS.
- Bewahren Sie diese Deckgläser bei 4 ° C bis zumverwenden (Parafilm die Platte, bevor sie in einem Kühlschrank).
Wichtiger Hinweis: Halten Sie die kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern in irgendeine Art von Flüssigkeit / Medien als die Goldpartikel kann abplatzen von den Deckgläsern, wenn trocknen gelassen. Die kolloidalem Gold Deckgläser sollte innerhalb von 2-3 Monaten ab dem Zeitpunkt, als sie getätigt wurden verwendet werden.
Qualitätskontrolle: In einer einzigen Spur phagokinetic Motilität Assay, ist es kritisch, Deckgläschen, die durch eine ähnliche Konzentration von Goldpartikeln gekennzeichnet verwenden. Diese einfache Punkt wird für die quantitativen Unterschiede im zellulären Motilität zwischen Proben zu ermöglichen, allein aufgrund der Art der Behandlung und nicht die physikalischen Eigenschaften der kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern. Wir bevorzugen Verwendung nur Deckgläser gleichzeitig in einzelnen Versuche gemacht, obwohl wir gezeigt, dass, solange die Dichte der Goldnanopartikel gleich sind haben, die Verwendung von Deckgläsernaus verschiedenen Präparate geeignet ist.
3. Analyse zellulärer Motilität
- Platzieren Sie die Goldkolloid-beschichtete Deckgläser in einem geeigneten zellulären für die Zellen von Interesse.
- Übertragen entsprechend behandelten Zellen auf die kolloidale Gold-beschichteten Deckgläschen in einer 24-Well-Platte (n) platziert
Anmerkung: Die Anzahl von Zellen transferiert zum Einzelwell muss bestimmt für jeden Zelltyp studiert werden. Idealerweise sollten Zellen gleichmäßig auf der kolloidalem Gold beschichteten Deckgläschen, die wiederum für die statistische Analyse von nur Spuren von einer einzigen Zelle erstellt ermöglichen verteilt werden. Wenn Zellen mit zu hoher Konzentration plattiert sind, wird es sehr wahrscheinlich, dass überlappende Spuren mehrerer Zellen gesehen wird. Überlappenden Spuren nicht genau quantifiziert werden, und somit können sie keine Berücksichtigung in der endgültigen Analyse der Bewegung der getesteten Zellen aufgenommen werden. Überlappenden Spuren durchdie Einbeziehung mehrerer Zellen werden üblicherweise leicht beobachtet; als fusionierte oder Spuren (im Bereich der Analyse), in der zwei oder mehr Zellen in der gleichen angrenzenden freigemachten Fläche beobachtet werden kann gekreuzt.
- Bei 37 ° C / 5% CO 2 für 24 Stunden (oder aus einem geeigneten Zeitpunkt, zB Monozyten wir Motilität analysierten zwischen 6 h und 24 h nach der Behandlung und Endothelzellen nach 12 h nach der Behandlung). Die optimale Zeitspanne zur Bestimmung und Messung zelluläre Motilität variieren mit dem Zelltyp untersucht und somit sollte experimentell für jeden Zelltyp (ein guter Ausgangspunkt jedoch beträgt 6 - 12 Stunden nach Behandlung) bestimmt werden.
Anmerkung: Wenn experimentellen kolloidalem Gold beschichteten Deckgläschen zu speichernden und / oder zu einem späteren Zeitpunkt analysiert, benötigen die Zellen und Gold-Nanopartikel auf die Deckgläser fixiert werden. Um diese Fixierung Schritt zu erreichen; folgenden Schritt 3,3, Deckgläser ersten Waschen sorgfältig 2 mal mit 1xPBS (Eintauchen Deckgläser ist vorzuziehen, da eine Entnahme von Gold-Nanopartikeln aus Deckgläser müssen vermieden werden), dann verwenden Sie ein Standard Zellfixierung Methode, wie Inkubation mit Raumtemperatur 3% Paraformaldehyd. Nach einer 15-minütigen Inkubation sollte die 3% Paraformaldehyd entfernt werden und die Deckgläser sorgfältig gewaschen 3 mal mit PBS 1x. Die festen Deckgläser in einem Kühlschrank aufbewahrt werden.
- Verwendung eines Lichtmikroskops, die Aufnahmen der Schienen von einem einzigen beweglichen Zelle (Anmerkung: Die Vergrößerung verwendet werden, Bilder von zellulären Spuren sicher ergreifen je nach Zelltyp zu untersuchenden) erstellt. Beispiele für zelluläre Titel von unbeweglichen und beweglichen Zellen auf kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern erstellt sind in Abbildung 2 gezeigt.
Anmerkung: Die Gold-Nanoteilchen von der Größe in der Spur phagokinetic Motilität Assay verwendet wurde gefunden, daß völlig ungiftig für Zellen 30. NotfallsKann die Lebensfähigkeit der untersuchten Zellen durch Anfärben mit Trypanblau beurteilt oder geprüft für andere Marker der zellulären Lebensfähigkeit. Man müsste berücksichtigt die Notwendigkeit für die Fixierung, die Art der Fixierung, etc., wenn dieser Schritt muss durchgeführt werden.
- Mit der frei verfügbaren Software, wie ImageJ Software ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) oder NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ), beide an der Entwicklung National Institutes of Health, oder ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ) an der University of Texas Health Science Center in San Antonio, die durchschnittliche Fläche (in willkürlichen Einheiten) von kolloidalem Gold gelöscht entwickelt von 10-20 oder mehr Zellen (pro Probe) wird für jeden experimentellen Arm aus den aufgenommenen Bildern bestimmt. Statistiken können dann auf t durchgeführt werdener sammelte Ergebnisse. Zum Beispiel können die Ergebnisse aufgetragen als Mittel werden ± Standardfehler des Mittels (SEM) mit dem Student-t-Tests durchgeführt, und einem P-Wert <0,05 als Maß der statistische Signifikanz zwischen Proben verwendet. Abbildungen 3 und 4 zeigen Schritte in der Analyse des Bereichs von kolloidalem Gold durch die Zelle gelöscht.
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Representative Results
Ist ein Beispiel der Bilder unter einem Lichtmikroskop, die einen Gleisbereich durch eine einzige Zelle (a Monozyt aus unseren Experimenten ist in Abbildung 2 gezeigt) gelöscht entnommen. Unbeweglichen Zellen zu schaffen charakteristischen kleinen, ovalen oder kreisförmigen Bahnen um sich herum, die einen niedrigen Grundniveau der Bewegung für diesen stimulierten Zellen (2A und 2B). Im Gegensatz dazu sind hoch beweglichen Zellen [in unserem System, humanen Cytomegalovirus (HCMV)-infizierten Zellen] durch eine gerichtete Bewegung in den 2C und 2D als längliche Spur Flächen dargestellt ist. Nach Erhalt mehrerer Bilder der Spur Bereiche mit einem inversen Mikroskop mit einem 40x-Objektiv, wurden die insgesamt Spur markierten Bereiche mit dem ImageJ Software (Abbildung 3); ähnliche Ergebnisse auch mit anderen Software-Anwendungen erhältlich. Wir bevorzugen die ImageJ Software, weil es kostenlos und einfach zu bedienen ist. Motile Zellen nicht erstellen Standard, geometrischen förmigen Bahnen duklingeln ihrer Bewegung, so ist ein bequemer Weg, um den Bereich zu analysieren markieren, um die Freihand-Werkzeug in der ImageJ-Software zu wählen, um die Form der Spur durch den sich bewegenden Zelle (Abbildung 3) erstellt markieren. Nachdem abgegrenzt den Gleisbereich zu analysierenden die quantitative Messung der Daten durch Klick auf "Analyse" im ImageJ Menüleiste und wählen Sie "Measure" aus dem Pull-Down-Menü ausgeführt wird. Eine Probe von unseren Ergebnissen in willkürlichen Einheiten durch Analyse der zellulären Spur Bereiche aus den Daten in Abbildung 3 dargestellt gesammelt erhalten wird in 4A gezeigt. Die Ergebnisse aus der ImageJ Software gesammelt kann dann in einer Tabelle der Wahl analysiert werden, um für die Berechnung des durchschnittlichen Spurbereich pro Zelle gelöscht, wie in 4B gezeigt, zu erlauben.
Nach unserer Erfahrung ist die problematischste Schritt des Protokolls die Produktion der kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern, die Anlass zur Sorge ist die generation der Deckgläser mit gleichmäßige Abdeckung von Gold-Nanopartikeln (Fragen im Zusammenhang mit diesem Anliegen in 2,8 oben erörtert). Die geeignete, gleichmäßige Abdeckung von Gold-Nanopartikeln auf einer coveslip ist in Abbildung 2 dargestellt. Abdeckung, die zu dicht (1A und 1B) oder zu dünn (1C und 1D) ist verhindert Zellmigration oder verändern die reproduzierbare Analyse der Größe und der Form des Gleisbereich. Der zweite entscheidende Punkt, wie in 3.2 oben erörtert wurde, ist die Dichte der plattierten Zellen und die Notwendigkeit, sich überlappenden oder Spuren zusammengeführt aus mehreren Zellen zu verhindern.
Abbildung 1. Mögliche Probleme mit dem Dichte von kolloidalem Gold auf den Deckgläschen. In dieser Figur gezeigt sind Beispiele von kolloidalem Gold beschichteten Deckgläser mit entweder zu hoch (Panels
Abbildung 2. Beispiele von Spuren durch unbewegliche angelegt (Felder A und B) und beweglichen (Panels C und D) Zellen auf kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern. Virus-freien Medium (Mock-infizierte) oder Medium, das virale Partikel (HCMV-infizierten) waren zugegeben, um isolierte peripheral Blutmonozyten 10,18-22. Monozyten wurden bei 37 ° C / 5% CO 2 für 1 Stunde und dann plattiert auf kolloidalem Gold beschichteten Deckgläschen für 24 h bei 37 ° C / 5% CO 2. Bilder wurden mit einem 40x-Objektiv aufgenommen. Weiße Pfeile markieren Monozyten in ihrer endgültigen Lage. Wie wir gezeigt zuvor 10,18-22 haben, werden infizierte Monozyten durch einen niedrigen Basisniveau der Motilität gekennzeichnet, während HCMV-infizierten Zellen Eigenschaften der hohen Beweglichkeit zeigen. Größe bar entspricht 25 um in der Länge.
Abbildung 3. Kennzeichnung der Bereich der Cellular Tracks mit ImageJ Software. Beispielen gezeigt werden Snapshots der Titel, in dem das Image J Software während der Analyse der Spuren durch unbewegliche (Felder A und B) und beweglichen (erstellt verwendet wurde Panels C undD) Zellen auf kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern (Hinweis: Die Spuren werden durch eine weiße Linie mit dem ImageJ Freihandwerkzeug) eingekreist. Die Probe Bilder, die gleichen wie die in 2 gezeigt, wurden in dieser Figur verwendet, um Gleisbereich durch eine einzige Zelle gelöscht messen. Dies sind repräsentative Bilder von mock-und HCMV-infizierten Monocyten, jedoch sind in der Regel 10 bis 20 Bilder pro Probe analysiert. Größe bar entspricht 25 um in der Länge.
Abbildung 4. Die quantitative Auswertung der Zellmotilität Mit ImageJ Software und Tabellenkalkulation. A) Gemessener Gleisbereich von Zellen gelöscht, wie in den Beispielbilder (Abbildungen 2 und 3) dargestellt, mit dem ImageJ Software. Die berechneten Ergebnisse # 1, # 2, # 3 und # 4 bis Panels A entsprechen B, C und D in den 2 und 3, bzw. B) Eine grafische Darstellung der durchschnittlichen Bereiche (Mittel;. in willkürlichen Einheiten) durch Zellen gelöscht und durch die ImageJ Software. In diesem Beispiel ist die Standardabweichung des Mittelwertes nicht dargestellt, weil in dem Beispiel eine unzureichende Anzahl von Wiederholungen wird analysiert. Anmerkung: Die Software stellt die ImageJ gemessene Fläche von Spuren in willkürlichen Einheiten, daher ist es wichtig, um Bilder von Spuren unter der gleichen Vergrößerung aufgenommen vergleichen. Die einfachste Methode, um Ergebnisse aus verschiedenen Experimenten zu vergleichen, ist fache Veränderungen zwischen untersuchten Proben zu vergleichen.
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Discussion
Die phagokinetic Spur Motilität Assay in diesem Artikel vorgestellt ist eine einfache und sehr effektive Methode zur quantitativen Analyse von Zellmigration. Da mehrere Zelltypen 9-17 analysiert werden kann, hat diese Methode das Potenzial breiten Einsatz über mehrere Disziplinen. Die Verwendung von kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern erlaubt die Messung einer Gleisbereich durch einen sich bewegenden Zelle gelöscht. Der Assay kann den Effekt verschiedener Stimuli (zB Wachstumsfaktoren, Liganden gereinigt ECM, Viren, Bakterien) auf Zellmotilität. Darüber hinaus ermöglicht das Fehlen des Erfordernisses Zellfixierung zur Überwachung der Zellmigration zu unterschiedlichen experimentellen Zeitpunkten. Darüber hinaus erfordert der Assay nur eine Standard Lichtmikroskop, eine Standard-Kamera mit einer CCD (Charge Coupled Device)-Bildsensor und frei verfügbare Software. Daher werden die anspruchsvollen Mikroskopen und Kameras nicht erforderlich, noch sind spezielle Software-Suiten. Auch wenn der Eselay ist einfach aufgebaut, ist es ein leistungsstarkes Werkzeug zur statistischen Untersuchung der Motilität von mehreren Zelltypen unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen. Zum Beispiel wird in dieser Hinsicht kann der Assay verwendet werden, um effektiv zu studieren eine kleine Anzahl von experimentellen Proben, sowie eine effektive als Hochdurchsatz-Screening-Assay dienen. Weil die Deckgläser kann untersucht werden unfixiert kann der Assay auch für die Analyse von bewegten Zellen über die Zeit ohne die Notwendigkeit für ein Mikroskop mit einer geschlossenen befeuchteten CO 2-Inkubator beheizten ermöglichen. Zusätzlich ist die Spur phagokinetic Motilität Assay hilfreich für das Studium eines Motilität von Zellen nicht zugänglich einer Zeitraffer-Bildgebung, wie ein Photobleichen von Fluorophor-gefärbten Zellen ist weniger problematisch in der kolloidalen Gold basierende Motilität Assay. Die quantitative Auswertung der Gleisbereich durch eine einzige Zelle gelöscht wird unter Verwendung der frei verfügbaren ImageJ Software erreicht, obwohl andere Software genutzt werden kann. Darüber hinaus ist die gesamte graphical und statistische Analysen erhalten benötigen nur grundlegende Kenntnisse von Berechnungen, Tabellen und Statistiken.
Es sollte beachtet werden, dass die ursprüngliche Verfahren die Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA), um die Deckgläser 9 abzudecken beschrieben. Allerdings wurde die Verwendung von BSA sich als unzuverlässig als Mittel zur einheitlichen Goldkolloid Monoschicht 27 ermöglichen. Die Substitution von Gelatine für BSA, wie das Deckglas der Beschichtung erhöht die Haftung von Gold-Nanopartikeln auf dem Deckglas. Zusätzliche Modifikationen von Scott et al. 27 zur Protokoll stark verbessert die Qualität der Beschichtung Gold-Nanopartikel. Trotzdem haben wir festgestellt, bezogen auf Turkevich et al. 23, daß die Verwendung von Natriumcitrat als Reduktionsmittel die gleichmäßigste Monoschicht von Goldnanopartikeln erstellt. Daher bevorzugen wir diese Methode und als solches ist es in unserem beschriebenen Protokoll.
Um ah ermöglichenigh Maß an Reproduzierbarkeit des Assays ist es wichtig, sich strikt an die Volumina und Temperaturen im Protokoll angegeben, als Abweichungen stark beeinflussen können die endgültigen Ergebnisse. Wie oben diskutiert, beinhaltet einer der technische Hürden in der Verwendung des phagokinetic Spur Motilität Assay die Herstellung der Gold-Nanopartikel in der Lösung und dann in Erlangung einer entsprechenden gleichmäßigen Konzentration der Gold-Nanopartikel auf dem Deckglas. Somit, obwohl die Goldnanopartikel Fällungsschritt reproduzierbar ist, legen wir einen Schwerpunkt auf die Beurteilung der Farbe der Endlösung von gefälltem Goldnanopartikel. Darüber hinaus ist unser Grundprinzip für nur Zugabe Hälfte des normalen Volumens der endgültigen Lösung auf jeweils Deckgläser und dann nach 0,5 Stunden, die Beurteilung der Dichte und Gleichmäßigkeit der Goldpartikel auf die Deckgläser (mit der Möglichkeit, zusätzliche Lösung hinzufügen, wenn später) erforderlich. Diese Vorkehrungen getroffen werden, um zu vermeiden, einen Zustand, wo ter Deckgläser zeigen entweder zu hoch (1A und 1B) oder zu niedrig (1C und 1D) eine Konzentration von Gold-Nanopartikeln auf Deckgläsern.
Insgesamt ist die phagokinetic Spur Motilität Assay eine einfache Methode, um Zellbewegung analysieren. Es ist eine Momentaufnahme des Abstandes (über den endgültigen Spurbereich), dass eine Zelle über einen definierten Zeitrahmen verschoben. Darüber hinaus ist der Test sehr zugänglich mehrere Reize, dh untersuchten Zellen unter einer Vielzahl von Behandlungsmöglichkeiten können getestet werden. Zum Beispiel wird in unserer Monozyt Experimenten haben wir die Motilität von viral infizierten, behandelten Zytokin-, Wachstumsfaktor-behandelten, Mitogen-behandelten und LPS-behandelten Monozyten getestet. Darüber hinaus haben wir diese aktivierten Monozyten unter einer Vielzahl von Inhibitoren / hemmenden Bedingungen getestet, um funktionell untersuchen, welche Rolle verschiedene biochemische / molekulare Signalwege spielen in Monozyten Motilität. Im Gegensatz zu einer Wundheilung Assay 31, Messendega kumulative Wirkung der Zellproliferation und Migration oder einer Boyden-Kammer (trans-well) Migration Assay 32, was eine Analyse der Bulk-Chemotaxis-Motilität, wertet das phagokinetic Spur Motilität Assay die Migration der einzelnen Zelle. Allerdings, wenn es eine Notwendigkeit für eine chemotaktische Wirkung Schüttgut gemessen werden soll, ein dreidimensionales Migration / Invasion zu beurteilen, eine genauere Analyse eines zellularen Bewegung oder die Analyse der Bewegung der Zellen unter in vivo Bedingungen, würde dieses Protokoll nicht ausreichen und der Einsatz von zusätzlichen Methodik, wie einem trans-Well Migration Assay, einem Matrigel Invasionsassay 33, Live Zeitraffer-Mikroskopie / Fotografie 34,35 usw. müsste berücksichtigt werden.
Die Spur phagokinetic Motilität Assay ist eine einfache, quantitative Auswertung / Vergleich einer Fähigkeit von Zellen, ohne Notwendigkeit der Verwendung teurer Mikroskopen und Software in den Analysen migrieren. Es richtet sich an ReseBogenschützen in der Notwendigkeit einer schnellen und einfachen, aber zuverlässigen Methode zur Zellmotilität quantifizieren, bietet eine Möglichkeit einer einfachen High-Throughput-Assay.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (AI050677, HD-051.998 und GM103433), ein Malcolm Feist Herz-Kreislauf-Forschungsstipendium und ein American Heart Association Promotionsstipendium (10PRE4200007) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Coverslips (15mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| Gelatin 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| Tetrachloroauric Acid Trihydrate | Fisher Chemical | G54-1 | 14.5 mM (a final working solution) |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | BP327-500 | 0.5% (a final working solution) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 3% (a final working solution) |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Sarstedt | 83.1802 | |
| 12-Well Plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Oven Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | The standard laboratory oven will suffice |
| 10 ml Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-Aid Filler/Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 Single-Channel Manual Pipette | Rainin | PR-200 | |
| 200 ml Barrier Tips | CLP | BT200 | |
| ImageJ software | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | License: Public Domain | |
| Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera | Nikon | Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes. | |
| Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications. | |||
References
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