Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

Published: December 4, 2012 doi: 10.3791/4165

Summary

Assay מסלול תנועתיות phagokinetic הוא שיטה המשמשת כדי להעריך את התנועה של תאים. באופן ספציפי, assay מודד chemokinesis (תנועתיות תאים האקראיות) לאורך הזמן באופן כמותי. Assay מנצל את יכולתם של תאים ליצור מסלול למדידת התנועה שלהם על coverslips colloidal מצופה זהב.

Abstract

תנועתיות ניידות היא תהליך ביולוגי חשוב לשני יצורים חד תאיים ורבים תאיים. הוא חיוני לתנועה של יצורים חד תאיים לכיוון מקור של חומרים מזינים או במרחק שאינם מתאימים תנאים, כמו גם באורגניזמים תאיים לפיתוח רקמות, מעקב חיסוני וריפוי פצעים, רק כדי להזכיר כמה תפקידים 1,2,3. הסרת פיקוח על תהליך זה יכול להוביל למחלות קשות נוירולוגיות, לב וכלי דם ומערכת חיסון, כמו גם היווצרות גידול החמיר והתפשטה 4,5. מולקולרי, פילמור יקטין ומחזור הקולט הוכחו לשחק תפקיד חשוב ביצירת רחבות סלולריות (lamellipodia), המניעות את התנועה קדימה בתא 6,7,8. עם זאת, שאלות רבות ביולוגיות על נדידת תאים נותרו ללא מענה.

התפקיד המרכזי לתנועתיות סלולרית באדם מחל בריאות מדגיש את החשיבות של הבנת MEC הספציפיhanisms מעורב בתהליך הזה והופך את השיטות מדויקות להערכת תנועתיות תא חשובה במיוחד. מיקרוסקופים משמשים בדרך כלל כדי לחזות את התנועה של תאים. עם זאת, תאים לנוע די לאט, מה שהופך את מדידת כמותית של נדידת תאי תהליך גוזל משאבים דורשים מצלמות ותוכנה יקרות כדי ליצור סרטים כמותיים נושנים של תאים ניעתי. לכן, היכולת לבצע מדידת כמותית של נדידת תאים שהיא יעיל וחסכוני, שאינם מייגע, ושמנצל ציוד מעבדה משותף היא צורך גדול עבור חוקרים רבים.

בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic מנצלת את יכולתו של תא נע כדי לנקות חלקיקי זהב ממסלולו כדי ליצור מסלול מדיד על coverslip זכוכית מצופת הזהב colloidal 9,10. עם השימוש בתוכנה זמינה באופן חופשי, מספר רבים של מסלולים ניתן להעריך עבור כל טיפול כדי להשיג את הצורכים סטטיסטיים. הבדיקה יכולה להיות מנוצלת כדי להעריךתנועתיות של תאים מסוגים רבים, כגון תאים סרטניים, 11,12 פיברובלסטים 9, נויטרופילים 13, תאי שריר שלד 14, 15, הקרטינוציטים trophoblasts 16, 17, תאי האנדותל ומונוציטים 10,18-22. הפרוטוקול כולל יצירת שקופיות מצופות בחלקיקי זהב (° Au) המופקים על ידי הפחתה של חומצת chloroauric (3 Au +) על ידי ציטרט הנתרן. שיטה זו פותחה על ידי Turkevich et al. בשנת 1951 23 ולאחר מכן השתפרה בשנתי ה -1970 על ידי Frens et al. 24,25. כתוצאה מהפחתת צעד זה כימי, חלקיקי זהב (10-20 ננומטר בקוטר) יזרזו מתערובת התגובה ויכולים להיות מיושמים על coverslips זכוכית, אשר אז מוכנים לשימוש בניתוחי נדידה סלולריות 9,26,27.

באופן כללי, בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic היא מדד מהיר, כמותית וקלה של תנועתיות סלולרית. בנוסף,יכול להיות מנוצל כמו assay פשוט תפוקה גבוהה, לשימוש עם סוגי תאים שאינם ניתן להדמיה נושנה, כמו גם שימושים אחרים, בהתאם לצרכימים של החוקר. ביחד, את היכולת למדידת כמותית תנועתיות סלולריות של סוגי תאים מרובים ללא צורך במיקרוסקופים ותוכנה יקרים, יחד עם השימוש בציוד מעבדה משותף וכימיקלים, לבצע בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic בחירה מוצקה למדענים בעלי עניין בהבנה סלולרית תנועתיות.

Protocol

1. הכנת Coverslips ג'לטין המצופה

  1. מקום coverslips חומצה שטף את הכוס (15 מ"מ קוטר) בצלחת סטרילית פלסטיק 100 מ"מ (ES). הנח 8-9 coverslips לצלחת ולוודא שהם לא נוגעים זה בזה או את הצדדים של הצלחת ..

הערה: Coverslips, מחטים ומלקטים צריכות להיות סטרילי לחסל מיקרואורגניזמים אפשריים מזהמים, כמו גם endotoxins שישפיע על תפקודים תאיים, כולל תנועתיות.

  1. לשקול את אבקת הג'לטין וresuspend את האבקה במי deionized לעשות פתרון ג'לטין עם ריכוז סופי של 0.5 g/300 מ"ל. בשלב בא, פתרון ג'לטין צריך להיות autoclaved.
  2. פיפטה 2-3 טיפין של ג'לטין (~ 100-150 מ"ל) על כל coverslip.

הערה: היזהר שלא לאפשר את הג'לטין לגעת תבשיל או שלא יהיה מסוגל להסיר את coverslips מהצלחת.

    >
  1. אופה את coverslips ג'לטין המצופה בצלחת 100 מ"מימ בתנור בטמפרטורת 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  2. הסר ג'לטין העודף על ידי pipetting העדין.
  3. ייבש את coverslips בצלחת 100 מ"מימ בתנור בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
  4. ברגע יבש, להסיר את coverslips מצלחת 100 מ"מימ באמצעות מחט סטרילית, נטולת אנדוטוקסין ופינצטה (מחט משמש בעדינות על מנת לקרב את coverslip כדי להפוך אותו לנגיש לפינצטה בעדינות להסיר).
  5. הנח coverslips הבודד ג'לטין מצופה לתוך בארות נפרדות של 24 מנה טובה.

2. הכנת Coverslips קולואידיות מצופית זהב

  1. שוקל כמות מתאימה של חומצת chloroauric (trihydrate החומצה tetrachloroauric; HAuCl 4 · 3H 2 O) ולאחר מכן במי resuspend deionized סטרילי כדי להכין פתרון סופי 14.5 מ"מ (רעיל). הכן 1.5 מ"ל של הפתרון ל8-9 coverslips.

אזהרה: חומצת Chloroauric היא hמלוא חופנים בבליעה, יוצר כוויות קשות ולניזק לעיניים ועלול לגרום לתגובה אלרגית בעור. רעילה בבליעה.

  1. שוקל כמות מתאימה של ציטרט הנתרן (Trisodium dihydrogen 2-hydroxypropane-1-,2,3 tricarboxylate; Na 3 C 6 H 5 7 O) ולאחר מכן resuspend את האבקה במי deionized לעשות פתרון סופי 0.5%. הכן 1 מ"ל של הפתרון ל8-9 coverslips.

אזהרה: ציטראט נתרן עלול לגרום לעין וגירוי בעור. היא עשויה גם לגרום לגירוי בדרך נשימה ועיכול.

  1. במבחנה סטרילית, נטולת אנדוטוקסין לשלב 1.5 מ"ל של התמיסה סטרילית 4 14.5 מ"מ HAuCl ו -13.5 מיליליטר מי deionized סטרילית, והתוצאה אמורה להניב פתרון צהוב קלוש. את הכרכים הנ"ל ייאפשרו ל8-9 coverslips הזהב colloidal להתבצע.
  2. בעוד ברציפות ערבוב, מחמם את התמיסה על פלטה חמה עד שהוא מתחיל בשמן.

אזהרה: החימום של הפתרון צריך להתבצע במנדף, כמו אדים יכולים להיות מזיקים / רעילים. האדים הם הרסניים לרקמות של הריריות ודרכי נשימה העליונה.

  1. הסר את הכוס מהפלטה החמה.
  2. תוך כדי ערבוב, להוסיף 0.7 מ"ל של 0.5% פתרון ציטרט הנתרן. ההיקף האמור יאפשר ל8-9 coverslips הזהב colloidal להתבצע.
  3. ממשיך לערבב פתרון משולב זה לכ 2 דקות (הערה: הצבע של הפתרון ישתנה בהדרגה מצהובה קלושה, כדי לנקות, לאפור, לסגול, לסגול עמוק, ולבסוף לקחתי יין אדום או, עדיף, חלודת צבע) . מוצר זה הוא פתרון זהב colloidal שלך.
  4. לקרר את פתרון זהב colloidal בפיפטה 10 מ"ל במשך 1-2 דקות (כדי לשמור על שכבת ג'לטין על coverslip מהפשרה כאשר פתרון הזהב colloidal נוסף) ולאחר מכן להוסיף 1.0-2.0 מ"ל של colloidaפתרון זהב l על כל coverslip ג'לטין מצופה הונח בעבר בצלחת 24 היטב (es) (כמות הזהב colloidal הפתרון שאתה מוסיף לcoverslips ג'לטין המצופה תלוי בכמה טוב את חלקיקי הזהב זרזו בפתרון - ראה הערות להלן).

הערה: מאחר שייתכן שיש הבדלים ביעילות של משקעי חלקיקי זהב, מומלץ להוסיף 1 0.5-1 מ"ל של תמיסת זהב colloidal לcoverslips ג'לטין המצופה ולאחר מכן הנח את הצלחת 24 היטב בחממה על 0.5 שעות . לאחר זמן דגירה זה, coverslips צריך להיבדק תחת מיקרוסקופ האור לצפיפות המתאימה של חלקיקי זהב על coverslips. ראה איור 1 ל20x תמונות מיקרוסקופיה דוגמאות של נמוך מדי או גבוה מדי ריכוז של חלקיקי זהב. ראה איור 2 לתמונות מיקרוסקופיות של 40X ריכוז אידיאלי של חלקיקי זהב (לפחות לשימוש עם מונוציטים). Optצפיפות imal של חלקיקי הזהב בשקופית צריכה להיקבע באופן ניסיוני לכל סוג תא ששמש, כמאפיינים של התאים השונים יכתיבו כוח תנועה שלהם על coverslips. אם הריכוז של חלקיקי זהב אינו מספק, מוסיף 0.5-1 מ"ל נוסף של פתרון זהב colloidal לcoverslips ג'לטין המצופה.

בהתאם לגודל התא, הריכוז המתאים של חלקיקי זהב יכול להשתנות, ולכן סופו של דבר תלוי בגודל של התא נבדק לתנועתיות. לדוגמה, עם מונוציטים אדם תאים קטנים בגודל (~ 10-20 מיקרומטר 28), ריכוז גבוה של חלקיקי זהב היה צורך בניתוחים שלנו. ההפצה המתאימה של חלקיקי זהב מספקת חוקר עם היכולת בקלות וביעילות כדי להבדיל את הקצוות של מסלולים סלולריים. ריכוז של חלקיקי זהב שהוא גבוה מדי פוגע ביכולת של תאים לנוע ולכן כדי למדוד במדויק אתתנועתיות שלהם, ואילו ריכוז של חלקיקי זהב שהוא היכולת של אלה גבולות נמוכה מדי כדי להתוות מסלול מדויק של תנועתיות.

הערה חשובה: אם את הסינתזה של חלקיקי זהב היא בעייתית, חלקיקי זהב מסונתז זמינים מסחרי בגדלים מ 5 ננומטר עד 400 ננומטר. בנוסף, הניאון microspheres גם נעשה שימוש במחקרים של תנועתיות תא 29. עם זאת, השימוש בmicrospheres אלה דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי לניתוח נדידת תאים.

  1. מניח את הצלחת 24 היטב עם coverslips colloidal זהב מכוסה בחממה ב 37 ° C ו דגירה משעה 1 עד הלילה.
  2. לאחר דגירה, לשטוף / להסיר זהב מאוגד על ידי הטבילה בcoverslips (3x) לפוספט סטרילי נאגר מלוח (PBS; pH 7.4).
  3. הנח coverslips מצופה זהב colloidal אלה בצלחת 12-גם נקיה (es) המכילה PBS.
  4. אחסן coverslips אלה ב 4 ° C עד מוכן לשימוש (הצלחת לפני ההכנסה למקרר parafilm).

הערה חשובה: תמיד לשמור על coverslips colloidal מצופה זהב בסוג כלשהו של נוזל / מדיה כמו חלקיקי הזהב יכולים להתקלף מcoverslips אם להתייבש. את coverslips הזהב colloidal יש להשתמש תוך 2-3 חודשים מהיום שהם עשו.

בקרת איכות: בבדיקת תנועתיות בודדה phagokinetic מסלול, זה קריטי לשימוש coverslips המתאפיינים בריכוז דומה של חלקיקי זהב. נקודה פשוטה זו תאפשר להבדלים כמותיים בתנועתיות סלולריות בין דגימות להיות אך ורק בשל טבעו של הטיפול ולא את התכונות הפיסיקליות של coverslips colloidal מצופה זהב. אנו בעד שימוש coverslips בלבד שנעשה באותו הזמן בניסויים נפרדים, למרות שהראינו שכל עוד את הצפיפות של חלקיקי הזהב שווה, השימוש בcoverslipsמהכנות שונות הוא מתאים.

3. ניתוח של כושר תנועה נייד

  1. הנח את coverslips colloidal מצופה זהב במדיה הסלולריים המתאימים לתאים של עניין.
  2. העברת תאים שטופלו כראוי על גבי coverslips colloidal מצופה זהב שהונח בצלחת 24 היטב (ES)

הערה: מספר התאים שהועברו לאחת גם צריכה להיות נקבע לכל סוג תא למד. באופן אידיאלי, תאים צריכים להיות מופצים באופן שווה על coverslip מצופה הזהב colloidal, אשר בתורו יאפשר ניתוח הסטטיסטי של פסים רק שנוצרו על ידי תא בודד. אם תאים מצופים בריכוז גבוה מדי, הוא הופך להיות אפשרות סביר בהחלט שמסלולים חופפים של מספר תאים שנראים. מסלולים חופפים לא ניתן נבדקים ומדויקים, ולכן, הם לא יכולים להילקח בחשבון בניתוח הסופי של התנועה של התאים הנבדקים. חפיפת מסלולים כתוצאה מהמעורבות של מספר תאים בדרך כלל נצפתה בקלות; כהתמזגה או חצה מסילה (בתחום של ניתוח) שבו ניתן להבחין שני תאים או יותר באותו האזור פינה רציף.

  1. לדגור על 37 מעלות CO C / 5% 2 עבור 24 שעות (או לכל זמן מתאים; למשל נתחנו תנועתיות monocyte בין 6 שעות ו 24 תאים שלאחר טיפול ואנדותל משאבי אנוש ב12 שעות לאחר טיפול). מסגרת הזמן האופטימלית לקביעת ומדידת תנועתיות סלולריות תשתנה בהתאם לסוג התא למד, ולכן צריך להיות בניסוי נקבע לכל סוג תא (נקודת התחלה טובה, לעומת זאת, היא 6-12 שעות לאחר טיפול).

הערה: אם coverslips מצופה זהב colloidal הניסיוני צריך להיות מאוחסן ו / או ניתוח במועד מאוחר יותר, תאים וחלקיקי זהב צריכים להיות קבועים על coverslips. כדי לבצע שלב זה קיבעון; השלב הבא 3.3, לשטוף 1 coverslips זהירות 2 פעמים עם 1xPBS (טבילה של coverslips עדיף, כהסרה של חלקיקי זהב מcoverslips יש להימנע), ואז להשתמש בשיטה סטנדרטית תא קיבעון, כגון דגירה עם paraformaldehyde טמפרטורת החדר 3%. לאחר דגירה 15-דקות, paraformaldehyde 3% יש להסיר ואת coverslips שטף 3 פעמים בזהירות עם 1x PBS. את coverslips הקבוע ניתן לאחסן במקרר.

  1. השימוש במיקרוסקופ אור, ללכוד תמונות של מסלולים שנוצרו על ידי תא בודד נע (הערה: ההגדלה נהגה לקחת תמונות של מסלולים סלולריים בהחלט להשתנות בהתאם לסוג התא תחת חקירה). דוגמאות למסלולי הסלולר שנוצרו על ידי תאים הלא נעימים ובניע על coverslips colloidal מצופה זהב מוצגות באיור 2.

הערה: חלקיקי הזהב של הגודל השתמש בבדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic כבר מצא להיות רעיל לחלוטין לתאים 30. במידת צורך, את הכדאיות של התאים שנבדקו ניתן להעריך על ידי הכתמה עם trypan כחול או בדקה לסמנים אחרים של כדאיות סלולרית. יהיה צורך לקחת בחשבון את הצורך בקיבוע, סוג של קיבעון, וכו ', אם צעד זה צריך להתבצע.

  1. שימוש בתוכנה זמינה באופן חופשי, כמו ImageJ תוכנה (http://rsbweb.nih.gov/ij/) או NIH תמונה (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/), הן פתחו ב מכונים הלאומיים לבריאות, או ImageTool (http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html) שפותח באוניברסיטת טקסס למדעי בריאות במרכז סן אנטוניו, השטח הממוצע (ביחידות שרירותיות) של זהב colloidal פונה על ידי 10-20 תאים או יותר (לדוגמה) נקבעים לכל יד ניסיונית מתמונות שנתפסו. סטטיסטיקה אז יכולה להיות מבוצעת על tהוא אסף תוצאות. לדוגמה, תוצאות ניתן להתוות כמשמעות ± סטיות ההתקן של האמצעי (SEM) עם בדיקות של סטודנטי t שבוצעו, וערך P של <0.05 משמשים כמדד למובהקות סטטיסטיות בין דגימות. תרשימי 3 ו 4 צעדי ראווה ב ניתוח של השטח של זהב colloidal פונה על ידי התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הראה דוגמה של תמונות שצולמו במיקרוסקופ אור מראה אזור מסלול המסומן על ידי תא בודד (monocyte מהניסויים שלנו מוצגת באיור 2). תאים ללא ניעתי ליצור, סגלגלים קטנים אופייניים או שטחים בצורת העיגול סביב עצמם מעידים על רמה בסיסית נמוכה של תנועה לתאי unstimulated אלה (איורים 2 א ו -2). לעומת זאת, תאים ניעתי ביותר [במערכת שלנו, ציטומגלווירוס האנושי (HCMV)-נגועים תאים] מאופיינים בתנועה כיוונית שמוצגת ב2C 2D ודמויות כמו אזורי מסלול מוארכים. לאחר קבלת תמונות מרובות של אזורים לעקוב באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם אובייקטיבי 40X, אזורי המסלול כלל סומנו באמצעות ImageJ התוכנה (איור 3); תוצאות דומות ניתן להשיג עם יישומי תוכנה אחרות. אנו מעדיפים את תוכנת ImageJ כי זה בחינם וקל לשימוש. תאים ניעתי לא יוצרים רגילים מסלולים, גיאומטריים בצורה דותצלצל התנועה שלהם, ולכן דרך נוחה לסמן את האזור שנותח היא לבחור את הכלי ביד החופשית בתוכנת ImageJ כדי לסמן את הצורה של מסלול שנוצר על ידי התא נע (איור 3). לאחר שהתווה את מסלול השטח כדי להיות מנותחים, מדידת כמותית של הנתונים מתבצע על ידי לחיצה על "ניתוח" בשורת התפריט ובחירת ImageJ "מדוד" מתפריט הנפתח. מדגם של התוצאות שלנו ביחידות שרירותיות המתקבלות על ידי ניתוח תחומי מסלול הסלולר שנאספו מהנתונים המוצגים באיור 3 מוצג באיור 4 א. התוצאות שנאספו מתוכנת ImageJ אז יכולות להיות מנותחות בגיליון אלקטרוני לבחירה כדי לאפשר לחישוב שטח המסלול הממוצע פינה לתא, כפי שמוצג באיור 4 ב.

מניסיוננו, הצעד הבעייתי ביותר בפרוטוקול הוא הייצור של coverslips colloidal מצופה זהב; הנושא לדאגה הוא גרםeneration של coverslips עם כיסוי אחיד של חלקיקי זהב (נושאים הקשורים לדאגה זו נדונים ב2.8 לעיל). הכיסוי המתאים והאחיד של חלקיקי זהב בcoveslip מוצג באיור 2. כיסוי שהוא צפוף מדי (התרשימים 1A ו-1B) או דליל מדי (1C 1D ותרשימים) ימנע נדידת תאים או משנה את הניתוח לשחזור של הגודל והצורה של אזור המסלול. הנקודה המרכזית השנייה שנדון ב3.2 לעיל, היא הצפיפות של תאי הציפוי והצורך למנוע חפיפה או מוזג מסלולים מתאים מרובים.

איור 1
איור 1. בעיות פוטנציאליות עם הצפיפות של זהב Colloidal על Coverslips. מוצגות באיור זה הן דוגמאות לcoverslips colloidal מצופה זהב גם עם פנלים גבוהים מדי ( ו-B) או נמוכה מדי (הפנלים C ו-D) צפיפות של חלקיקי זהב. שתי דוגמאות אלה יביאו לאיסוף נתונים עניים וניתוחים סטטיסטיים. הערה: ריכוזים הולמים של חומצת chloroauric או ציטרט הנתרן, כמו גם רותח ממושכת של פתרון התגובה, עלולים לגרום לתוצאות בלתי רצויות אלה. תמונות צולמו באמצעות 20x אובייקטיבי. הערה: לוח D גם מתארת ​​אגרגטים לא רצויים של חלקיקי זהב על coverslips הזכוכית. בר הגודל מתאים ל50 מיקרומטר באורך.

איור 2
איור 2. דוגמאות למסלולים שנוצרו על ידי הלא ניעתי (פנלי A ו-B) ונעימים בתאים (הפנלים C ו-D) על coverslips colloidal מצופה זהב. וירוס נטולת תקשורת (מדומה-נגוע) או מדיה המכילה חלקיקי נגיף (HCMV נגוע) היו הוסיף לperipher המבודדמונוציטים בדם 10,18-22 al. מונוציטים הודגרו ב 37 מעלות% 5 / CO 2 לשעה 1 ולאחר מכן מצופית על coverslips colloidal מצופה זהב עבור 24 שעות ב 37 ° C% / 5 CO 2. תמונות צולמו באמצעות אובייקטיבי 40X. חצים לבנים לסמן מונוציטים במיקומם הסופי. כפי שכבר הוכיחו בעבר 10,18-22, מונוציטים נגועים מתאפיינים ברמה בסיסית נמוכה של תנועתיות, בעוד תאים HCMV נגועים להראות מאפיינים של תנועתיות גבוהה. בר הגודל מתאים ל25 מיקרומטר באורך.

איור 3
איור 3. סימון השטח של המסלולים הסלולריים באמצעות תוכנת ImageJ. דוגמאות מוצגות תמונות של מסלולים, שבתוכנת J התמונה הייתה בשימוש במהלך הניתוח של מסלולים שנוצרו על ידי הלא ניעתי (פנלי A ו-B) וניע (פנלי C וד) תאים בcoverslips colloidal מצופה זהב (הערה: מסלולים הם מוקף בקו לבן משתמש בכלי ביד החופשי ImageJ). את התמונות לדוגמה, זהות לאלה שמוצגים באיור 2, שמשו בנתון זה כדי למדוד אזורי מסלול הוכשרו תא בודד. אלו הן תמונות מייצגות של מונוציטים מדומים וHCMV נגועים, עם זאת, בדרך כלל 10-20 תמונות מנותחות למדגם. בר הגודל מתאים ל25 מיקרומטר באורך.

איור 4
איור 4. ההערכה כמותית של כושר תנועה ניידת באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני וImageJ. ) אזורי המסלול נמדדו נוקו על ידי תאים, כמתואר בתמונות לדוגמא (איורים 2 ו 3), באמצעות תוכנת ImageJ. תוצאות # 1, # 2, # 3 ומס '4 שחושבו מתאימות לפנלי A B, C ו-D באיורי 2 ו 3, בהתאמה B) ייצוג גרפי של אזורים ממוצעים (אמצעים;. ביחידות שרירותיות) פונה על ידי תאים ונותח על ידי תוכנת ImageJ. בדוגמה זו, שגיאת ההתקן של הממוצע אינה מוצגת, משום שבדוגמא מספר מספיק של חזרות הוא נתח. הערה: תוכנת ImageJ מספקת לאזור התצפית של רצועות ביחידות שרירותיות, ולכן זה קריטי כדי להשוות תמונות של מסלולים נלקחו תחת אותו הגדלה. השיטה הפשוטה ביותר להשוואת תוצאות מניסויים נפרדים היא להשוות שינויים לקפל בין דגימות שנבדקו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic הוצגה במאמר זה היא שיטה פשוטה ויעילה ביותר לניתוח כמותי של נדידת תאים. כי ניתן לנתח סוגי תאים מרובים 9-17, לשיטה זו יש שימוש הרחב הפוטנציאל על פני תחומים רבים. השימוש בcoverslips הזכוכית מצופית זהב colloidal מאפשר מדידה של אזור מסלול המסומן על ידי תא נוסע. הבדיקה יכולה למדוד את ההשפעה של גירויים שונים (כלומר, גורמי גדילה המטוהרות ligands ECM, וירוסים, חיידקים) על תנועתיות תא. בנוסף, חוסר הדרישה לקיבוע תא מאפשר ניטור של נדידת תאים בנקודתי זמן ניסיוניות שונות. יתר על כן, הבדיקה דורשת רק מיקרוסקופ אור רגילה, מצלמה סטנדרטית באמצעות חיישן CCD (תשלום מצמידי מכשיר) תמונה ותוכנה זמינה באופן חופשי. לכן, מיקרוסקופים והמצלמות המתוחכמים אין צורך, וגם חבילות תוכנה מיוחדות. למרות התחתאיי הוא פשוט בעיצוב, זה הוא כלי רב עצמה סטטיסטית ללמוד תנועתיות של סוגי תאים מרובים תחת שפע של תנאי ניסוי. לדוגמה, זה לגבי, assay ניתן להשתמש ביעילות כדי ללמוד מספר קטן של דוגמאות ניסיוניות, כמו גם ליעילות לשמש assay הקרנת תפוקה גבוהה. מכיוון שניתן לבחון את coverslips מבולבל, assay יכול גם לאפשר ניתוח של הזזת תאים לאורך הזמן ללא צורך במיקרוסקופ עם humidified סגורה, מחוממת CO 2 חממה. בנוסף, בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic מועילה בלימוד תנועתיות של תאים לא מקובל הדמית זמן לשגות, כphotobleaching של תאי fluorophore מוכתמים הוא פחות דאגה בבדיקת תנועתיות זהב מבוסס colloidal. ההערכה כמותית של אזורי מסלול הוכשרו תא בודד מושגת על ידי שימוש בתוכנה הזמינה באופן חופשי ImageJ, אם כי ניתן להשתמש בו תוכנות אחרות. יתר על כן, graphica הכלליניתוחים סטטיסטיים וl לקבל רק דורשים ידע בסיסי בחישובים, גיליונות אלקטרוניים, ונתונים סטטיסטיים.

יש לציין כי השיטה המקורית תארה את השימוש של אלבומין בסרום שור (BSA) לכיסוי הזכוכית 9 coverslips. עם זאת, השימוש בBSA נמצא לא אמין כסוכן, כדי לאפשר זהב קולואיד 27 monolayer האחיד. ההחלפה של ג'לטין לBSA, כציפוי של coverslip, הגדילה את ההיצמדות של חלקיקי זהב לcoverslip. שינויים נוספים שהוכנסו על ידי סקוט et al. 27 לפרוטוקול השתפרו מאוד איכות ציפוי זהב nanoparticle. יחד עם זאת, מצא, המבוסס על Turkevich et al. בן 23, כי השימוש בציטרט הנתרן כסוכן צמצום יצר monolayer האחיד ביותר של חלקיקי זהב. לכן, אנחנו מעדיפים שיטה זו וכאמורה, היא מתוארת בפרוטוקול שלנו.

כדי לאפשר לאהתואר IGH של שחזור של assay, חשוב להקפיד לעקוב אחר ההיקפים וטמפרטורות מפורט בפרוטוקול, כסטיות מאוד יכולות להשפיע על התוצאות הסופיות. כאמור לעיל, אחד המכשולים הטכניים בשימוש בבדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic כרוך הייצור של חלקיקי הזהב בתמיסה ולאחר מכן בהשגת ריכוז אחיד מתאים של חלקיקי הזהב על coverslip. לכן, למרות שצעד משקעי nanoparticle הזהב הוא לשעתק, אנו שמים דגש על הערכת הצבע של הפתרון הסופי של חלקיקי זהב זרזו. בנוסף, זה הרציונל שלנו להוספה רק מחצית מההיקף הרגיל של הפתרון הסופי על כל coverslips ו, אז לאחר 0.5 שעות, הערכת הצפיפות והאחידות של חלקיקי זהב על coverslips (עם היכולת להוסיף פתרון נוסף, אם צורך בהמשך). אמצעי זהירות אלו ננקטו כדי להימנע מיצירת מצב שבו לאהוא coverslips להראות או גבוה מדי (התרשימים 1A ו-1B) או ריכוז של חלקיקי זהב בcoverslips זכוכית נמוכה מדי (1C 1D ואיורים).

בסך הכל, assay תנועתיות המסלול phagokinetic הוא שיטה פשוטה לניתוח תנועת תא. הוא מספק תמונת מצב של המרחק (דרך אזור המסלול הסופי) שתא עבר מעל מסגרת זמן מוגדר. יתר על כן, הבדיקה היא מאוד נוחה לגירויים מרובים, כלומר, בדק תאים ניתן לבדוק תחת מגוון רחב של אפשרויות טיפול. לדוגמה, בניסויי monocyte שלנו, אנחנו צריכים לבדוק את תנועתיות virally נגוע, ציטוקין טופל-, צמיחה של גורמים שטופלו, מטופלי mitogen-, וטופלו LPS-מונוציטים. יתר על כן, יש לנו נבדקו מונוציטים אלה הופעלו תחת מגוון של מעכבים / תנאים מעכבים תפקודי כדי לבחון את תפקיד הביוכימיים / מולקולריים שונים לשחק בתנועתיות monocyte. בניגוד לבדיקת ריפוי פצעים 31, מודדיםהשפעה מצטברת של ga התפשטות תאים והגירה, או Boyden קאמרי (טראנס היטב) assay ההגירה 32, המאפשרת ניתוח כמות גדולה של תנועתיות chemotactic תא, assay תנועתיות המסלול phagokinetic מעריכה את ההגירה של תא בודד. עם זאת, אם יש צורך בהשפעת chemotactic תפזורת יש למדוד, הגירה תלת ממדים / פלישה להיות מוערך, ניתוח מפורט יותר של תנועה סלולרית, או הניתוח של תנועת תא תחת בתנאי vivo, פרוטוקול זה היית ולא די בשימוש במתודולוגיה נוספת, כגון בדיקת טרנס גם הגירה, assay פלישת matrigel 33, מיקרוסקופים חיים נושן / צילום 34,35, וכו 'הייתי צריך להילקח בחשבון.

בדיקת תנועתיות מסלול phagokinetic היא הערכה פשוטה, כמוני / השוואה של יכולת של תאים להעביר ללא צורך בשימוש במיקרוסקופים ותוכנה יקרים בניתוח. הוא מופנה לreseקשתים זקוקים ל, שיטה מהירה וקלה, אך אמינה לכמת תנועתיות תא, המציע אפשרות של בדיקה פשוטה תפוקה גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (AI050677, HD-051998, וGM103433), מלקולם פייסט לב וכלי דם מחקר מלגה, ומלגת איגוד לב אמריקנית predoctoral (10PRE4200007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Coverslips (15mm) Fisher Scientific 12-545-83
Gelatin 300 Bloom Sigma-Aldrich G-1890
Tetrachloroauric Acid Trihydrate Fisher Chemical G54-1 14.5 mM (a final working solution)
Sodium Citrate Fisher Scientific BP327-500 0.5% (a final working solution)
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042 3% (a final working solution)
100 mm Tissue Culture Dish Sarstedt 83.1802
12-Well Plates Fisher Scientific 08-772-29
24-Well Plates Fisher Scientific 07-200-84
Techne Oven Hybridiser HB-1D LabPlanet 2040500 The standard laboratory oven will suffice
10 ml Serological Pipettes Sarstedt 86.1254.001
Pipet-Aid Filler/Dispenser Drummond 13-681-15
P200 Single-Channel Manual Pipette Rainin PR-200
200 ml Barrier Tips CLP BT200
ImageJ software http://rsb.info.nih.gov/ij/ License: Public Domain
Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera Nikon Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes.
Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
  2. Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
  3. Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
  4. Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
  5. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  6. Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
  7. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
  8. Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
  9. Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
  10. Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
  11. Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, Humana Press. 379-392 (2010).
  12. Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
  13. Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
  14. Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
  15. Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
  16. Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
  17. McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
  18. Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
  19. Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
  20. Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
  21. Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
  22. Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
  23. Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
  24. Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
  25. Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
  26. Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
  27. Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
  28. Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
  29. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).
  30. Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
  31. Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
  32. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  33. Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
  34. Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
  35. Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).

Tags

אימונולוגיה גיליון 70 מיקרוביולוגיה ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית חלקיקי זהב coverslips נדידת תאים תנועת תא כמותית מיקרוסקופיה תנועתיות assay
הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nogalski, M. T., Chan, G. C. T.,More

Nogalski, M. T., Chan, G. C. T., Stevenson, E. V., Collins-McMillen, D. K., Yurochko, A. D. A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay. J. Vis. Exp. (70), e4165, doi:10.3791/4165 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter