Summary
Phagokinetic motilite parça tahlil hücre hareketi değerlendirmek için kullanılan bir yöntemdir. Özellikle, tahlil, bir nicel bir şekilde, zaman içinde chemokinesis (rastgele hücre hareketliliğinin) ölçer. Tahlil, koloidal altın kaplama lameller üzerine onların hareket ölçülebilir bir parça oluşturmak için hücrelerinin yeteneği yararlanır.
Abstract
Hücresel motilite tek hücreli ve çok hücreli canlılar için önemli bir biyolojik süreçtir. Bu besinlerin veya uzak uygun koşulların yanı sıra doku gelişimi, bağışıklık gözetim ve yara iyileşmesi için çok hücreli organizmalarda olduğu gibi, sadece birkaç rolleri 1,2,3 söz kaynağı doğru tek hücreli organizmaların hareketi için gereklidir. Bu işlemin önemli Deregülasyon, nörolojik kardiyovasküler ve immünolojik hastalıkların yanı sıra, şiddetlenir tümör oluşumuna yol açan ve 4,5 yayılabilir. Moleküler, aktin polimerizasyonu ve reseptör geri dönüşüm hücre 6,7,8 öne hareketini götürmek hücresel uzantıları (lamellipodia), yaratmada önemli rolleri olduğu gösterilmiştir. Ancak, hücre göçü ile ilgili birçok biyolojik sorular yanıtsız kalıyor.
Insan sağlığı ve hastalık hücresel hareketlilik açısından merkezi bir rol özgü mec anlamanın önemini vurgularhanisms bu süreç içinde yer alan ve özellikle önemli hücre hareketi değerlendirilmesi için doğru yöntem sağlar. Mikroskop genellikle hücre hareketi görselleştirmek için kullanılır. Ancak, hücre hareketli hücrelerin nicel zaman lapsed filmleri oluşturmak için pahalı kameralar ve yazılım gerektiren bir kaynak-alıcı bir süreç hücre göçü kantitatif ölçümü yapmak, oldukça yavaş hareket ettirin. Bu nedenle, maliyet-etkin olmayan zahmetli ve bu ortak laboratuvar ekipmanı kullanan bir hücre göçü bir kantitatif ölçümü gerçekleştirmek için yeteneği birçok araştırmacı için büyük bir ihtiyaçtır.
Phagokinetic parça motilite tayini kolloidal altın kaplamalı cam lamel 9,10 ölçülebilir bir parça oluşturmak için onun yolundan altın parçacıkları temizlemek için hareketli bir hücre yeteneğini kullanır. Serbestçe kullanılabilir yazılım kullanımı ile, birden fazla parçayı istatistiksel gereksinimleri gerçekleştirmek için her tedavi için değerlendirilebilir. Tahlil değerlendirmek için kullanılabilecekBu tür kanser hücrelerinin 11,12, fibroblastlar 9, nötrofiller 13, iskelet kas hücreleri 14, keratinositler 15, trofoblastlar 16, endotel hücreleri 17 ve monositler 10,18-22 gibi birçok hücre tipleri, motilitesi. Protokol sodyum sitrat ile chloroauric asit (Au 3 +) bir azalma ile oluşturulan nanoparçacıkların (Au °) ile kaplanmış slaytlara oluşturulmasını içerir. Bu yöntem, 1951, 23. Turkevich ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve sonra Frens ve diğerleri tarafından 1970 de geliştirilmiştir. 24,25. Bu kimyasal indirgeme aşamasının bir sonucu olarak, altın parçacıkları (çap: 10-20 nm), tepkime karışımından, çökelti ve hücre göçü analiz 9,26,27 kullanıma hazır sonra cam lameller üzerine tatbik edilebilir.
Genel olarak, phagokinetic parça motilite hücresel tahlil motilite hızlı, basit ve kantitatif ölçüsüdür. Buna ek olarak,Zaman lapsed görüntüleme, hem de, araştırmacının ihtiyaçlarına bağlı olarak başka kullanım için müsait olmayan hücre tipleri ile birlikte kullanım için, basit bir yüksek hacimli tahlil olarak kullanılabilir. Birlikte, kantitatif pahalı mikroskoplar ve yazılıma gerek olmadan birden fazla hücre tipleri hücresel motilite ölçme yeteneği, ortak laboratuvar ekipman ve kimyasalların kullanımı ile birlikte, hücresel anlamada phagokinetic parça motilite tayini ile ilgilenen bilim adamları için sağlam bir seçim yapmak motilite.
Protocol
1. Jelatin-kaplanmış lameller hazırlanması
- Bir steril plastik 100 mm çanak (es) yerleştirin asitle yıkanmış cam lameller (çapı 15 mm). Tabak başına 8-9 lamelleri yerleştirin ve birbirlerine dokunmadan veya yemeğin tarafında değil emin olun ..
Not: lameller, iğneler ve cımbız muhtemel kirletici mikroorganizmaların, hem de hareketliliği de dahil olmak üzere hücresel fonksiyonlar, endotoksinler etkiler ortadan kaldırmak için steril olması gerekmektedir.
- Jelatin toz tartılır ve 0.5 g/300 ml 'lik nihai bir konsantrasyon ile bir jelatin solüsyonu yapmak için deiyonize su içinde tekrar süspansiyon toz. Daha sonra, jelatin solüsyonu otoklava gerekmektedir.
- Pipet 2-3 her bir lamel üzerine jelatin (~ 100-150 ml) damla.
Not: Jelatin çanak dokunmak veya çanak lamelleri kaldırmak mümkün olmayacaktır izin vermemek için dikkatli olun.
- 10 dk için 90 ° C sıcaklıkta bir fırında 100 mm tabak jelatin kaplı lamelleri pişirilir.
- Nazik pipetleme tarafından aşırı jelatin çıkarın.
- 45 dk için 70 fırın içinde 100 mm tabak ° C lamelleri kurutun.
- Kuruduktan sonra, steril, endotoksin ücretsiz iğne ve cımbız (iğne hafifçe kaldırmak için yavaşça cımbız için erişilebilir yapmak için lamel kadar dürtmek için kullanılan) kullanarak 100 mm çanak lamelleri çıkarın.
- 24-iyi çanak ayrı kuyulara bireysel jelatin kaplı lamelleri yerleştirin.
2. Kolloidal Altın kaplı lameller hazırlanması
- Chloroauric asit (tetrakloro asit trihidrat; HAuCl 4 · 3H 2 O) uygun bir miktarı tartılır ve sonra bir nihai 14.5 mM solüsyonu (zehirli) maddesinin hazırlanması için steril deiyonize su içinde tekrar süspansiyon haline getirin. 8-9 lamelleri başına çözelti 1.5 ml hazırlayın.
Uyarı: Chloroauric asit hkucak dolusu yutulduğunda, Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olur ve alerjik cilt reaksiyonuna neden olabilir. Yutulması halinde toksiktir.
- Sodyum sitrat, uygun bir miktarda tartılır (trisodyum dihidrojen 2-hydroxypropane-1 ,2,3-tricarboxylate, Na 3 C 6 H 5 O 7) ve daha sonra son bir% 0.5 çözelti yapmak üzere deiyonize su içinde tekrar süspansiyon toz. 8-9 lamelleri başına 1 ml çözelti hazırlayın.
Uyarı: Sodyum sitrat göz ve cilt tahrişine neden olabilir. Ayrıca solunum ve sindirim yollarında tahrişe neden olabilir.
- Steril, endotoksin ücretsiz beher içinde steril 14.5 mM HAuCl 4 solüsyon ve steril deiyonize su 13.5 ml 1.5 ml birleştirmek sonucu soluk sarı bir çözelti elde edilmelidir. Adı geçen hacimleri için 8-9 koloidal altın lamelleri için izin verir.
- Sürekli karıştırarak ederken bu b başlayana kadar, bir sıcak plaka üzerinde çözüm ısıtmakyağ.
Uyarı: buharları toksik / zararlı olabilir gibi çözüm ısıtma, davlumbaz yapılmalıdır. Buharlar mukoza ve üst solunum yolu dokusu için yıkıcı vardır.
- Sıcak plaka gelen beher çıkarın.
- Karıştırma sırasında,% 0.5 sodyum sitrat solüsyonu 0,7 ml eklenir. Söz konusu hacim yapılacak 8-9 koloidal altın lamelleri için izin verir.
- Yaklaşık 2 dakika için bu birleşik çözüm karıştırarak tutun (Not: çözüm rengi yavaş yavaş nihayet bir kırmızı şarap ulaşmadan önce, derin mor, mor, gri, açık veya, tercihen, pas rengi, soluk sarı değişecektir) . Bu ürün kolloidal altın çözümdür.
- 1-2 dk (koloidal altın çözeltisi eklendiğinde, erime lamel jelatin tabaka tutmak için) için 10 ml lik bir pipet, koloidal altın çözelti soğutulur ve daha sonra colloida bir 1.0-2.0 mLbakınız - önceden bir 24-kuyu çanak (ler) (bu, jelatin kaplı lamelleri eklediği koloidal altın çözelti miktarı altın parçacıkları çözelti içinde çökeltilmiştir ne kadar iyi bağlıdır yerleştirilmiş her bir jelatin kaplı lamel üzerine l altın çözelti aşağıdaki yorum).
Not: altın partikül Yağış verimliliğinde farklılıklar olabilir Çünkü, ilk jelatin kaplı lamelleri için koloidal altın çözeltisi 0.5-1 ml ekleyin ve sonra 0.5 saat boyunca inkübatörde 24-iyi çanak koymak için tavsiye edilir . Bu inkübasyon süresinden sonra, lamelleri lameller üzerine altın parçacıkları uygun yoğunluk için hafif mikroskop altında kontrol edilmelidir. Altın parçacıkları çok düşük ve çok yüksek bir konsantrasyon örnekleri 20x mikroskobu görüntüleri için Şekil 1'e bakınız. Altın parçacıkları (en azından monositler ile kullanmak için) ideal bir konsantrasyon 40x mikroskopi görüntü elde etmek için Şekil 2'ye bakınız. Optfarklı hücrelerin özellikleri lamelleri üzerine hareketin kendi gücünü dikte edecek gibi slayt üzerinde altın nanopartiküller olmuş bölgeler yoğunluğu deneysel, kullanılan her bir hücre tipi için tespit edilmelidir. Altın partiküllerinin konsantrasyonu yetersiz ise, jelatin kaplı lamelleri ile koloidal altın çözeltisi ilave 0.5-1 ml eklenir.
Hücre boyutuna bağlı olarak, altın partiküllerinin uygun konsantrasyonu değişebilir ve bu, bunun bir sonucu olarak hareketlilik açısından incelenmiştir hücre boyutuna bağlı olacaktır. Örneğin, küçük ölçekli hücreleri (~ 10-20 mikron 28) insan monosit ile, altın parçacıkları daha yüksek bir konsantrasyon analizlerimiz gerek duyuldu. Nanoparçacıkların uygun dağılımını kolayca ve verimli bir hücresel parçaların kenarları ayırt edebilme becerisi ile araştırmacı sağlar. Çok yüksek altın parçacıkları bir konsantrasyon doğru bir şekilde ölçmek için dolayısıyla hareket etmek için ve hücrelerin yeteneğini engellemektedirhareketliliğini iken motilite doğru bir parça çizmek için çok düşük limitler olanları yeteneğidir altın parçacıkları bir konsantrasyon.
Önemli Not: nanoparçacıkların sentez soruna neden olan, sentez nanoparçacıkların 5 nm ile 400 nm boyutlarda ticari olarak temin edilebilir. Buna ek olarak, floresan mikroküreler hücre hareketi 29 çalışmalarda aynı zamanda kullanılmıştır. Ancak, bu mikrosferler kullanımı hücre göçü ve analizi için bir floresan mikroskobu gerektirir.
- 37 küvözde kolloidal altın kaplı lamelleri ile 24 sıra tabak koyun 1 saat gecede ° C ve inkübe.
- Inkübasyondan sonra, durulama / (PBS, pH 7.4) tamponlu salin steril fosfat içine lamelleri (3x) batırarak ilişkisiz altın kaldırın.
- PBS içeren temiz 12-iyi çanak (es) bu kolloidal altın kaplı lamelleri yerleştirin.
- 4 ° C 'ye kadar olan bu lamelleri depolamak için hazır(parafilm buzdolabında yerleştirmeden önce plaka) kullanın.
Önemli Not: Her zaman altın parçacıkları lamelleri gelen soyulmaz kurumasına izin verirseniz olabildiğince sıvı / medya bazı tür kolloidal altın kaplı lamelleri tutmak. Kolloidal altın lamelleri yapıldığı tarihten itibaren 2-3 ay içinde kullanılmalıdır.
Kalite Kontrol: tek bir parça phagokinetic motilite tahlil olarak, altın parçacıkları benzer bir konsantrasyon ile karakterize edilir lamelleri kullanmak için çok önemlidir. Bu basit nokta muamele ile değil, koloidal altın kaplı lamelleri fiziksel özelliklerinin doğası sadece bağlı olduğu örnekleri arasında hücre hareketliliği de kantitatif farklılıklar için izin verir. Bu nanoparçacıkların yoğunluk sürece eşit olduğunu göstermiştir olmakla beraber, ayrı deneyler, aynı anda yapılan tek lamelleri kullanarak lehine, lamelleri kullanımıFarklı hazırlıkları uygundur.
3. Hücresel Motilite Analiz
- İlgi hücreleri için uygun bir hücresel ortamda, koloidal altın kaplama lamelleri yerleştirin.
- 24-iyi çanak (es) yerleştirilir kolloidal altın kaplı lamelleri üzerine uygun şekilde tedavi hücreleri aktarın
Not: tek bir iyi transfer hücrelerin sayısı, her bir hücre tipinde çalışma için tespit edilmesi gerekmektedir. İdeal olarak, hücrelerin eşit sırayla tek bir hücre tarafından oluşturulan tek parça istatistiksel analiz için izin verecektir kolloidal altın kaplı lamel üzerinde dağıtılması gerekir. Hücrelerinde çok yüksek bir konsantrasyonda kaplama durumunda, birden fazla hücre çakışan rota görülecektir ki son derece olası hale gelir. Örtüşen parça doğru nicelendirildi edilemez ve dolayısıyla bunlar, test edilen hücre hareketi, sonuç olarak dikkate alınması mümkün değildir. Bir sonucu olarak parça Örtüşenbirden fazla hücre tutulum genellikle kolayca gözlenir; iki ya da daha fazla hücrenin aynı bitişik temizlenmiş bir alana görülebilir olan parça (analizi alanında) birleştirilmiş ya da çapraz olarak.
- 37 inkübe ° 24 hr C /% 5 CO 2 (veya herhangi uygun bir zaman, biz 6 saat ve 12 saattir tedavi sonrası 24 saat sonrası tedavi ve endotel hücreleri arasında monosit motilitesini analiz ettiler örneğin). Hücre tipi çalıştı ve böylece deneysel her bir hücre türü (- 12 saat sonrası tedavi iyi bir başlangıç noktası, ancak, 6, olduğu) için tespit edilir ile hücre hareketliliği belirlenmesi ve ölçülmesi için optimum süre çerçevesi değişecektir.
Not: Deneysel kolloidal altın kaplı lamelleri daha sonraki bir zamanda depolanan ve / veya analiz edilmesi gerekiyorsa, hücreleri ve altın nanopartiküller lamelleri üzerine sabit olması gerekir. Bu tespitin adımı gerçekleştirmek için; aşağıdaki Adım 3.3, ilk yıkamada 1x ile dikkatlice 2 kez lamelleriPBS (lamelleri altın nanopartiküller bir kaldırma kaçınılmalıdır gibi lamelleri daldırma, tercih edilir), daha sonra bu oda sıcaklığında 3% paraformaldehit ile inkübasyon gibi standart bir cep fiksasyon yöntemi kullanın. 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra,% 3 paraformaldehid çıkarılmalı ve lamelleri 1 x PBS ile dikkatle 3 kez yıkandı. Lamelleri sabit bir buzdolabında saklanır.
- Bir ışık mikroskobu kullanarak, tek bir hareketli hücre (: Kesinlikle soruşturma altında hücre türüne bağlı olarak değişir hücresel parçalarının fotoğraflarını çekmek için kullanılan büyütme Not) tarafından oluşturulan parça görüntüleri yakalayabilir. Koloidal altın kaplanmış lameller üzerine olmayan hareketsiz ve hareketli hücreler tarafından oluşturulan hücre parçaları örnek olarak Şekil 2 'de gösterilmiştir.
Not: phagokinetic parça motilite ölçüm içinde kullanılabilir boyutu nanoparçacıkların hücre 30 için tamamen toksik olduğu tespit edilmiştir. Gerekirse, Incelenen hücre canlılığı tripan mavisi ile boyanarak değerlendirildi veya hücresel canlılığı diğer belirteçleri için incelenebilir. Bir bu adımı taahhüt gerekiyorsa, dikkate sabitleme vb fiksasyonu, türü için ihtiyaç almak zorunda kalacak.
- Böyle ImageJ yazılımı (olarak serbestçe kullanılabilir yazılım kullanma http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) veya NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ geliştirilen), hem Ulusal Sağlık Enstitüleri, veya ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ) San Antonio, Texas Sağlık Bilimleri Merkezi tarafından temizlenmiş, kolloidal altın ortalama alanı (keyfi birimler olarak) Üniversitesi'nde geliştirilen 10-20 veya daha fazla hücre (örnek başına) çekilen görüntülerin her deneysel kol için belirlenir. İstatistikler ardından t yapılabilirO sonuçlar toplanır. Örneğin, sonuçlar gelir olarak çizilebilir ± örnekler arasında istatistiksel anlamlılık ölçütü olarak kullanılan Student t yapılan testler ve bir P değeri <0.05 olan (SEM) ve standart hataları. Şekil 3 ve 4 gösteri adımları hücre tarafından temizlenir koloidal altın alan analizi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gösterilen tek bir hücre (bizim deneyler bir monosit Şekil 2 'de gösterilmiştir) tarafından temizlenir bir izi alanı gösteren bir ışık mikroskobu altında alınan resimlerin bir örnektir. Non-motil hücrelerin karakteristik küçük, oval veya bu uyarılmamış hücreleri (Şekil 2A ve 2B) için hareket düşük bazal seviyesini gösteren kendi etrafında daire şeklinde yolları oluşturmak. Bunun aksine, yüksek derecede hareketli hücreler [Sistemimizde, insan sitomegalovirüs (HCMV) ile enfekte olmuş hücrelerde] uzatılmış parça bölgeleri olarak Şekiller 2C ve 2D'de gösterilen bir yönlü hareket ile karakterize edilmektedir. Bir 40x objektif ile bir ters mikroskop kullanılarak parça alanlarında birden çok resmi elde edildikten sonra, toplam parça alanları ImageJ yazılımı (Şekil 3) ile işaretlenmiştir; benzer sonuçlar diğer yazılım uygulamaları ile elde edilebilir. Ücretsiz ve kullanımı kolay olduğu için biz ImageJ yazılım lehine. Hareketli hücreler standart, geometrik şekilli parçalar du oluşturmak yokbunların hareketi halka, bu yüzden, analiz edilecek alan işaretlemek için uygun bir yol, hareketli hücre (Şekil 3) tarafından oluşturulan parça şeklinde işaretlemek için ImageJ yazılım içinde serbest çizim araç seçilmesidir. Verilerin nicel ölçümü ImageJ menü çubuğunda "Analiz" üzerine tıklayarak ve açılan menüden gelen "Tedbir" seçerek yapılır, analiz edilecek izi alanı tarif olması. Şekil 3 'de sunulan veriler toplanmıştır hücresel parça alanları analiz edilmesi ile elde edilen rasgele birimleri elde edilen sonuçlar bir örneği Şekil 4A'da gösterilmiştir. ImageJ yazılım elde edilen sonuçlar daha sonra, Şekil 4B de gösterildiği gibi, hücre başına temizlenir ortalama parça alanın hesaplanması için izin vermek için tercih edilen bir tablo olarak analiz edilebilir.
Bizim tecrübelerimize göre, protokolün en sorunlu adım kolloidal altın kaplı lamelleri üretimi olduğunu; endişe sorunu galtın nanopartiküller (Bu endişe ile ilgili konularda yukarıda 2.8 'de ele alınmıştır) üniforma kapsama lamelleri arasında eneration. Bir coveslip altın nanopartiküller uygun homojen kaplama Şekil 2'de sunulmuştur. (Şekil 1C ve 1D) çok yoğun (Şekil 1A ve 1B) veya çok seyrek olduğunu Kapsama hücre göçü önlemek ya da boyutunu ve parça alanının şekli tekrarlanabilir analiz değiştirecektir. Yukarıda 3.2 'de anlatıldığı gibi İkinci önemli nokta, kaplama hücrelerinin yoğunluğu ve birden fazla hücreyi parça örtüşen veya birleştirilmiş önlemek için ihtiyaçtır.
Şekil 1. Lameller üzerine Kolloidal Altın Yoğunluk ile Potansiyel Sorunlar. Bu rakam Gösterildi ya (çok yüksek Panelleri ile kolloidal altın kaplı lamelleri örnekleridir
Şekil 2. Non-motil tarafından oluşturulan parça örnekleri (Paneller A ve B) ve kolloidal altın kaplı lamelleri üzerine motil (Paneller C ve D) hücreleri. Virüs ücretsiz viral partiküller içeren medya (mock-enfekte) veya medya (HCMV ile enfekte) idi İzole Periferik eklendial kan monositleri 10,18-22. Monositler 37 inkübe ° C /% 5 37 24 saat boyunca koloidal altın kaplamalı lamelleri üzerine 1 saat sonra kaplama ° C /% 5 CO 2 CO 2. Edildi Resimleri bir 40x objektif kullanılarak çekildi. Beyaz oklar nihai konuma monositler işaretleyin. Daha önce 10,18-22 gösterdiği gibi HCMV ile enfekte olmuş hücrelerde yüksek hareketlilik özellikleri gösterirken, enfekte olmamış monositler, motilite düşük bir taban seviye ile karakterize edilir. Ölçü bar uzunluğu 25 um karşılık gelir.
Şekil 3,. ImageJ yazılımı kullanarak Hücresel Tracks Alan İşaretleme. Gösterilen örnekler vardır Image J yazılımı (non-motil (Paneller A ve B) ve hareketli tarafından oluşturulan parçaların analizi sırasında kullanılan hangi parçaları, anlık Paneller C veD) kolloidal altın kaplı lamelleri (Not hücreleri: parçalar ImageJ freehand aracını) kullanarak beyaz bir çizgi ile çember vardır. Numune resimleri, Şekil 2'de gösterildiği gibi aynı, tek bir hücre tarafından temizlenir izi alanlarına ölçmek için bu rakam olarak kullanılmıştır. Bu sahte ve HCMV ile enfekte monosit temsili görüntüler, ancak genellikle 10-20 görüntüleri örnek başına analiz edilmektedir. Ölçü bar uzunluğu 25 um karşılık gelir.
Şekil 4. ImageJ Yazılım ve elektronik tablo kullanma Hücre Motilite Kantitatif Değerlendirilmesi. A) hücreleri tarafından temizlenir Ölçülen parça alanlar gibi ImageJ yazılımı kullanılarak, örnek resimler (Şekiller 2 ve 3) 'de betimlenmiştir. Hesaplanan sonuçları # 1, # 2, # 3 ve # 4 Paneller A karşılık B, C, ve Şekil 2 ve 3 de D, ortalama alanları B) bir grafiksel temsilini (anlamına gelir;. keyfi birimler olarak) hücreler tarafından temizlenir ve ImageJ yazılımı ile analiz edilmiştir. Örnek olarak çoğaltılır, yeterli sayıda analiz edilir çünkü bu örnekte, ortalamanın standart hatası, gösterilmemiştir. Not: ImageJ yazılım keyfi birimleri parça ölçülen alanı sağlar, bu nedenle, aynı büyütmede çekilen parça resim karşılaştırmak için çok önemlidir. Ayrı deney sonuçları karşılaştırmak için basit yöntem incelenen örnekler arasında kat değişiklikleri karşılaştırmaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede sunulan phagokinetic parça motilite tayini hücre göçü kantitatif analiz için basit ve son derece etkili bir yöntemdir. Birden fazla hücre tipleri 9-17 analiz edilebilir, çünkü bu yöntem farklı disiplinlerde potansiyeline geniş bir kullanıma sahiptir. Koloidal altın kaplı cam lameller kullanımı, bir hareket eden bir hücre ile temizlenmiş bir izi alanı ölçümü sağlar. Test hücresi motilitesi üzerine (ECM ligandlar, virüsler, bakteriler saflaştırılmış yani büyüme faktörleri,) farklı uyaranların etkisini ölçebilirsiniz. Ek olarak, hücre tespit için gereksinim eksikliği farklı deneysel zaman noktalarında hücre göçü izlenmesini sağlar. Ayrıca, deney sadece standart bir ışık mikroskobu, bir CCD (şarj bağlı cihaz) görüntü sensörü ve serbestçe kullanılabilir yazılım kullanarak standart bir kamera gerektirir. Bu nedenle, gelişmiş mikroskoplar ve kameralar gerekli, ne de özel bir yazılım suit değildir. Rağmen eşekay tasarım basit, istatistiksel deney koşulları çok sayıda altında birden fazla hücre tipleri motilite incelemek için güçlü bir araçtır. Örneğin, bu ilgili olarak anlatmak gerekirse, deney etkili bir deney örnekleri, az sayıda çalışma için, hem de etkili bir şekilde yüksek verimli tarama deneyi olarak hizmet etmek için kullanılabilir. Lamelleri çözülmüş kontrol edilebilir, çünkü test ayrıca kapalı bir nemlendirilmiş, ısıtılmış CO2 kuluçka makinesi ile bir mikroskop için gerek kalmadan saat boyunca hareket eden hücrelerin analizi için izin verebilir. Fluorofor boyanmış hücrelerin bir photobleaching kolloidal altın tabanlı motilite testi daha az bir endişe olduğu gibi ek olarak, phagokinetic parça motilite testi, bir time-lapse görüntüleme için uygun olmayan bir hücre motilite okuyan yardımcı olur. Diğer yazılım kullanılabilir olmasına rağmen, tek bir hücre tarafından temizlenir parça alanların kantitatif değerlendirilmesi, serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılım kullanılarak elde edilir. Üstelik, genel GRAPHICAl ve istatistiksel analizler temel hesaplamalar bilgisi, hesap tabloları ve istatistikler sadece gerektirir elde.
Bu, orijinal yöntem cam lameller 9 kapak (BSA), bovine serum albumin kullanımını tarif ettiği belirtilmelidir. Bununla birlikte, BSA kullanımı aynı altın koloit tek tabaka 27 için izin vermek için bir ajan olarak güvenilir olarak tespit edilmiştir. BSA için jelatin ikamesi, lamel en kaplama olarak, lamel altın nanopartiküller bağlılığı arttı. Scott ve ark tarafından tanıtıldı Ek değişiklikler. 27. protokole büyük altın nanoparçacık kaplama kalitesi artar. Bununla birlikte, Turkevich et al, bulundu. 23, bir indirgeyici madde olarak, sodyum sitrat kullanımı nanoparçacıkların en homojen tek tabakalı oluşturulan. Bu nedenle, bu yöntem ve tercih gibi, bizim protokol de tarif edilmektedir.
Ah izin vermek içinTestin tekrarlanabilirliği igh derecesi, bu sapmaların kuvvetle nihai sonuçları etkileyebilir gibi kesinlikle, hacimleri ve protokolde belirtilen sıcaklıklar takip etmek önemlidir. Yukarıda tartışıldığı gibi, phagokinetic parça motilite tahlilin kullanımı teknik en büyük zorluklardan biri altın çözelti içinde nanopartiküller ve sonra altın uygun bir forma konsantrasyon elde lamel nanoparçacıkların imal etmekle ilgilidir. Altın nanoparçacık yağış adım tekrarlanabilir olmasına rağmen Böylece, biz çöktürülmüş altın nanopartiküller nihai çözüm renk değerlendiren bir vurgu yerleştirin. Ayrıca, bu takdirde, lamelleri üzerine altın parçacıkları (ek çözümü eklemek için yeteneği ile yoğunluk ve homojenlik değerlendirirken, sonra 0.5 saat sonra, sadece her lamelleri üzerine nihai çözüm normal hacminin yarısı eklenerek ve bizim mantık ) sonra gerekli. Bu önlemler nerede t bir devlet yaratmaktan kaçınmak için alınırO lamelleri veya çok yüksek (Şekil 1A ve 1B) veya cam lameller üzerine altın nanopartiküller bir konsantrasyon (Şekil 1C ve 1D) çok düşük göstermektedir.
Genel olarak, phagokinetic parça motilite tayini hücre hareketi analiz etmek için basit bir yöntemdir. Bir hücre, bir tanımlanmış bir zaman dilimi içinde taşınan mesafe bir anlık değeri (son izi alanı üzerinden) içerir. Ayrıca, test birden uyaranlara çok müsait olduğunu;, hücre tedavi seçenekleri altında test edilebilir incelenmiştir olduğunu. Örneğin, monosit deneylerde, biz viral enfeksiyonlu, sitokin-tedavi, büyüme faktörü-tedavi, mitojenle-tedavi ve LPS-tedavili monositlerin motilite test ettik. Ayrıca, işlevsel çeşitli biyokimyasal / moleküler yolaklar monosit motilitesini oynadığı rolü incelemek için inhibitörleri / inhibitör çeşitli koşullar altında bu aktive monositler test ettik. Bir yara iyileşmesi deneyini 31, measurin aksineHücre kemotaktik motilite bir toplu analizi sağlayan hücre çoğalması ve göç veya Boyden çemberinin (trans-iyi) göçü assay 32, ga kümülatif etkisi, phagokinetic parça motilite tayini tek hücre göçü değerlendirir. Ölçülecek bir yığın kemotaktik etki için bir ihtiyaç, in vivo koşullarda altında değerlendirilmesi için bir üç-boyutlu göç / istila, bir hücresel hareket ilişkin daha ayrıntılı bir analizi, ya da hücre hareket analizi yoktur, ancak, bu protokol olurdu yeterli ve böyle bir trans-kuyu göç deneyi, bir Matrigel istila tahlil 33, canlı mikroskobi zaman atlanmıştır / fotoğraf 34,35 gibi ek yöntemin kullanılması, vb göz önüne alınması gereken olmaz.
Phagokinetic parça motilite testi basit, kantitatif değerlendirme / analiz pahalı mikroskoplar ve yazılım kullanımı için bir ihtiyaç olmadan geçirmek hücrelerinin yeteneği karşılaştırma. Bu rese yöneliktirBasit bir high-throughput testin bir olasılık sunan, hücre hareketi ölçmek için hızlı ve kolay bir, ama güvenilir, yöntem ihtiyacı okçular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI050677, HD-051998 ve GM103433), bir Malcolm Feist kardiyovasküler araştırma bursu ve bir Amerikan Kalp Derneği predoctoral bursu (10PRE4200007) hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Coverslips (15mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| Gelatin 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| Tetrachloroauric Acid Trihydrate | Fisher Chemical | G54-1 | 14.5 mM (a final working solution) |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | BP327-500 | 0.5% (a final working solution) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 3% (a final working solution) |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Sarstedt | 83.1802 | |
| 12-Well Plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Oven Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | The standard laboratory oven will suffice |
| 10 ml Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-Aid Filler/Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 Single-Channel Manual Pipette | Rainin | PR-200 | |
| 200 ml Barrier Tips | CLP | BT200 | |
| ImageJ software | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | License: Public Domain | |
| Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera | Nikon | Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes. | |
| Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications. | |||
References
- Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
- Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
- Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
- Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
- Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
- Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
- Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
- Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, Humana Press. 379-392 (2010).
- Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
- Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
- Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
- Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
- Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
- McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
- Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
- Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
- Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
- Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
- Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
- Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
- Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
- Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
- Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
- Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
- Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).
- Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
- Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
- Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).
