Summary
Le test de motilité phagokinetic piste est une méthode utilisée pour évaluer le mouvement des cellules. Plus précisément, le test mesure chimiokinèse (motilité cellulaire aléatoire) au fil du temps de manière quantitative. Le dosage tire parti de la capacité des cellules à créer une piste mesurable de leur mouvement sur colloïdales revêtues d'or lamelles.
Abstract
La motilité cellulaire est un processus biologique important pour les deux organismes unicellulaires et multicellulaires. Il est essentiel pour le mouvement des organismes unicellulaires vers une source de nutriments ou de loin des conditions inappropriées, ainsi que dans les organismes multicellulaires pour le développement des tissus, la surveillance immunitaire et la cicatrisation des plaies, pour n'en citer que quelques rôles 1,2,3. La déréglementation de ce processus peut entraîner de graves maladies neurologiques, cardio-vasculaires et immunologiques, ainsi que exacerbé la formation de tumeurs et la propagation 4,5. Moléculaire, polymérisation de l'actine et de recyclage des récepteurs ont été montré à jouer un rôle important dans la création d'extensions cellulaires (lamellipodes), qui animent le mouvement vers l'avant de la cellule 6,7,8. Cependant, de nombreuses questions sur la migration des cellules biologiques restent sans réponse.
Le rôle central de la motilité cellulaire sur la santé humaine et la maladie souligne l'importance de comprendre le mec spécifiquehanisms impliqués dans ce processus et fait des méthodes précises d'évaluation de la motilité cellulaire particulièrement important. Microscopes sont généralement utilisés pour visualiser le mouvement des cellules. Cependant, les cellules se déplacent assez lentement, ce qui rend la mesure quantitative de la migration des cellules d'un processus consommateur de ressources nécessitant de coûteux appareils photographiques et des logiciels pour créer quantitatives temps périmé films de cellules mobiles. Par conséquent, la possibilité d'effectuer une mesure quantitative de la migration cellulaire qui est rentable, non-laborieux, et qui utilise l'équipement de laboratoire commun est une grande nécessité pour de nombreux chercheurs.
Le dosage piste phagokinetic motilité utilise la capacité d'une cellule mobile pour dégager des particules d'or de sa trajectoire pour créer une piste mesurable sur une lamelle de verre enduit d'or colloïdal, 9,10. Avec l'utilisation de logiciels librement disponibles, plusieurs pistes peuvent être évalués pour chaque traitement pour accomplir les exigences statistiques. Le test peut être utilisé pour évaluermotilité de nombreux types de cellules, comme les cellules cancéreuses, 11,12 fibroblastes 9, 13, neutrophiles cellules musculaires squelettiques 14, 15, kératinocytes trophoblastes 16, les cellules endothéliales et les monocytes 17, 10,18-22. Le protocole implique la création de lames recouvertes de nanoparticules d'or (Au °) qui sont générés par une réduction de l'acide chloroaurique (3 Au +) par le citrate de sodium. Cette méthode a été développée par Turkevich et al., En 1951 23, puis améliorée dans les années 1970 par Frens et al. 24,25. À la suite de cette étape de réduction chimique, des particules d'or (10-20 nm de diamètre) précipiter à partir du mélange réactionnel et peuvent être appliqués à des lamelles de verre qui sont alors prêts à être utilisés dans des analyses de migration cellulaires 9,26,27.
En général, le dosage piste phagokinetic motilité est une mesure rapide, quantitative et facile de la motilité cellulaire. En outre, ilpeut être utilisé comme un simple test à haut débit, pour une utilisation avec types de cellules qui ne se prêtent pas à temps caduc imagerie, ainsi que d'autres utilisations en fonction des besoins du chercheur. Ensemble, la capacité de mesurer quantitativement la motilité cellulaire de plusieurs types de cellules, sans la nécessité pour les microscopes coûteux et des logiciels, ainsi que l'utilisation de matériel de laboratoire et produits chimiques commun, faire l'essai de piste phagokinetic motilité un choix solide pour les scientifiques ayant un intérêt dans la compréhension cellulaire motilité.
Protocol
1. Préparation de gélatine à revêtement Lamelles
- Placer les lamelles de verre lavées à l'acide (15 mm de diamètre) dans un plastique stérile boîte de 100 mm (es). Placer 8-9 lamelles par boîte et assurez-vous qu'ils ne se touchent pas les uns les autres ou sur les côtés du plat ..
Remarque: lamelles, les aiguilles et les pinces doivent être stérile pour éliminer les microorganismes contaminants possibles, ainsi que les endotoxines qui affectent les fonctions cellulaires, y compris la motilité.
- Peser la poudre de gélatine et de remettre en suspension la poudre dans de l'eau désionisée pour former une solution de gélatine à une concentration finale de 0,5 g/300 ml. Ensuite, la solution de gélatine doit être autoclavé.
- Pipette 2-3 gouttes de gélatine (~ 100-150 ml) sur chaque lamelle.
Remarque: Veillez à ne pas laisser la gélatine de toucher le plat ou vous ne serez pas en mesure de retirer les lamelles de la boîte.
- Cuire les lamelles recouvertes de gélatine dans la boîte de 100 mm dans une étuve à 90 ° C pendant 10 min.
- Enlever tout excès de gélatine par pipetage doux.
- Sécher les lamelles dans le plat 100 mm dans le four à 70 ° C pendant 45 min.
- Une fois sec, retirer les lamelles de la boîte de 100 mm en utilisant une solution stérile, sans endotoxine aiguille et pince à épiler (l'aiguille est utilisée pour pousser gentiment jusqu'à la lamelle à la rendre accessible à la pince à épiler pour enlever délicatement).
- Placez individuelles revêtues de gélatine lamelles dans des puits séparés d'un plat de 24 puits.
2. Préparation de l'or colloïdal recouvertes de lamelles couvre-
- Peser une quantité appropriée d'acide chloraurique (trihydrate d'acide tétrachloroaurique; HAuCl 4 · 3H 2 O), puis remettre en suspension dans de l'eau déminéralisée stérile pour préparer une solution finale 14,5 mM (toxique). Préparer 1,5 ml de la solution par 8-9 lamelles.
Attention: l'acide chloroaurique est hbrassée en cas d'ingestion cause des brûlures graves de la peau et des lésions oculaires et peut causer une réaction allergique cutanée. Toxique en cas d'ingestion.
- Peser une quantité appropriée de citrate de sodium (dihydrogénophosphate trisodique 2-hydroxy-1 ,2,3-tricarboxylate; Na 3 C 6 H 5 O 7), puis remise en suspension de la poudre dans de l'eau désionisée pour obtenir une solution finale à 0,5%. Préparer 1 ml de la solution par 8-9 lamelles.
Attention: le citrate de sodium peut irriter les yeux et la peau. Elle peut également causer une irritation des voies respiratoires et digestives.
- Dans une solution stérile, sans endotoxines bécher combiner 1,5 ml de la solution stérile 14,5 mm HAuCl4 solution et 13,5 ml d'eau déminéralisée stérile, le résultat devrait donner une solution jaune pâle. Les volumes mentionnés ci-dessus permettra pour 8-9 lamelles d'or colloïdal à faire.
- Tout en continuant à agiter, chauffer la solution sur une plaque chaude jusqu'à ce qu'il commence à bhuile.
Avertissement: Le chauffage de la solution doit être effectuée sous la hotte, sous forme de vapeurs peut être nocif / toxique. Les vapeurs sont plus destructeur pour le tissu des muqueuses et des voies respiratoires supérieures.
- Retirer le bécher de la plaque chauffante.
- Tout en agitant, ajouter 0,7 ml de la solution de citrate de sodium à 0,5%. Le volume mentionné ci-dessus permettra pour 8-9 lamelles d'or colloïdal à faire.
- Continuez à remuer cette solution combinée pendant environ 2 minutes (Note: La couleur de la solution change graduellement du jaune pâle, d'effacer, de gris, de violet, de pourpre foncé, avant d'atteindre finalement un vin rouge ou, de préférence, couleur rouille) . Ce produit est la solution d'or colloïdal.
- Refroidir la solution d'or colloïdal dans une pipette de 10 ml de 1-2 min (pour garder la couche de gélatine sur la lamelle de fusion lorsque la solution d'or colloïdal est ajouté) et ensuite ajouter 1,0 à 2,0 ml de la colloidasolution d'or sur chaque lamelle l revêtues de gélatine préalablement placée dans un plat de 24 puits (s) (la quantité de la solution d'or colloïdal que vous ajoutez des lamelles recouvertes de gélatine dépend de la façon dont les particules d'or précipité dans la solution - voir commentaires ci-dessous).
Remarque: il peut y avoir des variations dans l'efficacité de la précipitation de particules d'or, il est conseillé de d'abord ajouter 0,5-1 ml de la solution d'or colloïdal pour les lamelles recouvertes de gélatine, puis placez le plat de 24 puits dans l'incubateur pendant 0,5 heure . Après ce temps d'incubation, les lamelles doivent être vérifiés au microscope optique de la densité appropriée des particules d'or sur les lamelles. Voir la figure 1 pour des images de microscopie de 20x exemples de trop faible et trop forte concentration de particules d'or. Voir la figure 2 pour des images de microscopie 40x d'une concentration idéale de particules d'or (au moins pour une utilisation avec des monocytes). L'optimal densité des nanoparticules d'or sur la lame doit être déterminée expérimentalement pour chaque type cellulaire utilisé, les caractéristiques des différentes cellules vont dicter leur force de mouvement sur les lamelles. Si la concentration de particules d'or est insuffisant, ajouter un supplément de 0,5-1 ml de la solution d'or colloïdal pour les lamelles recouvertes de gélatine.
En fonction de la taille des cellules, la concentration appropriée de particules d'or et peut varier, ce qui va finalement dépendre de la taille de la cellule examinée pour la motilité. Par exemple, avec des monocytes humains étant de petite taille des cellules (~ 10-20 um 28), une plus forte concentration de particules d'or a été nécessaire dans nos analyses. La répartition appropriée des nanoparticules d'or fournit au chercheur la possibilité de facilement et efficacement distinguer les bords de pistes cellulaires. Une concentration de particules d'or qui est trop élevé nuit à la capacité des cellules à se déplacer et donc de mesurer avec précisionleur motilité, tandis que la concentration de particules d'or qui est trop faible limite les capacités de délimiter une plage précise de la motilité.
Note importante: Si la synthèse de nanoparticules d'or est problématique, des nanoparticules d'or synthétisées sont commercialement disponibles dans les tailles de 5 nm à 400 nm. En outre, des microsphères fluorescentes ont également été utilisés dans des études de 29 motilité cellulaire. Toutefois, l'utilisation de ces microsphères nécessite un microscope à fluorescence pour l'analyse de la migration des cellules.
- Placer le plat à 24 puits avec colloïdales d'or recouvertes de lamelles dans un incubateur à 37 ° C et incuber 1 h à partir du jour au lendemain.
- Après l'incubation, rincer / extraire l'or non lié par trempage des lamelles (3x) en phosphate stérile (PBS, pH 7,4).
- Placez ces colloïdales revêtues d'or lamelles dans un endroit propre et plat de 12 (es) contenant du PBS.
- Conservez ces lamelles à 4 ° C jusqu'au moment deutiliser (parafilm la plaque avant de les placer dans un réfrigérateur).
Remarque importante: Toujours garder les colloïdales revêtues d'or lamelles dans un certain type de liquide / médias comme les particules d'or peuvent s'écailler des lamelles si on les laisse sécher. Les lamelles d'or colloïdal doit être utilisé dans les 2-3 mois à compter de la date à laquelle elles ont été faites.
Contrôle de la qualité: Dans un dosage unique piste phagokinetic motilité, il est essentiel d'utiliser des lamelles qui se caractérisent par une concentration analogue de particules d'or. Ce point simple permettra aux différences quantitatives dans la motilité cellulaire entre les échantillons d'être uniquement due à la nature du traitement et de ne pas les propriétés physiques des colloïdales revêtues d'or lamelles. Nous sommes favorables à l'utilisation des lamelles seulement faites en même temps dans des expériences individuelles, mais nous avons montré que, tant que la densité des nanoparticules d'or sont égaux, l'utilisation de lamellesà partir de différentes préparations est approprié.
3. L'analyse de la motilité cellulaire
- Placer les colloïdes d'or revêtues de lamelles dans un milieu approprié cellulaires pour les cellules d'intérêt.
- Transfert des cellules traitées de manière appropriée sur les colloïdales revêtues d'or lamelles placées dans un plat de 24 puits (s)
Remarque: Le nombre de cellules transférées au bien unique doit être déterminée pour chaque type cellulaire étudié. Idéalement, les cellules doivent être également répartis sur l'or colloïdal enduit de lamelle, qui à son tour permettra l'analyse statistique des seules traces créées par une seule cellule. Si les cellules sont étalées à une concentration trop élevée, il devient très probable que les pistes se chevauchent de plusieurs cellules on le verra. Pistes qui se chevauchent ne peuvent pas être quantifiés avec précision et, par conséquent, ils ne peuvent pas être pris en compte dans les analyses finales du mouvement des cellules testées. Chevauchement titres à la suite d'l'implication de plusieurs cellules sont généralement faciles à observer, comme la fusion ou croisement des routes (dans le domaine de l'analyse) dans lequel deux ou plusieurs cellules peuvent être observées dans la même zone contiguë effacé.
- Incuber à 37 ° C CO / 5% 2 pendant 24 heures (ou à toute heure convenable, par exemple, nous avons analysé la motilité des monocytes entre 6 h et 24 h cellules de post-traitement et endothéliales à 12 h post-traitement). Le délai optimal pour déterminer et mesurer la motilité cellulaire varie en fonction du type cellulaire étudié, et donc doit être déterminée expérimentalement pour chaque type de cellule (un bon point de départ, cependant, est de 6 à 12 heures après le traitement).
Remarque: Si expérimentales colloïdales revêtues d'or lamelles doivent être stockés et / ou analysées à un moment plus tard, les cellules et les nanoparticules d'or doivent être fixés sur les lamelles. Pour accomplir cette étape de fixation; Étape suivante 3.3, premier lavage des lamelles de soin 2 fois avec 1xPBS (trempage des lamelles est préférable, comme le retrait de nanoparticules d'or à partir des lamelles doit être évité), puis utiliser une méthode de fixation de cellules standard, telles que l'incubation avec du paraformaldéhyde température ambiante de 3%. Après une incubation de 15 min, le paraformaldéhyde 3% doivent être enlevés et les lamelles soigneusement lavés 3 fois avec du PBS 1x. Les lamelles fixes peuvent être stockés dans un réfrigérateur.
- L'utilisation d'un microscope optique, capter des images des morceaux créés par une seule cellule mobile (Remarque: Le grossissement utilisé pour prendre des photos de pistes cellulaires vont certainement varier selon le type de cellule à l'étude). Des exemples de voies cellulaires créés par les cellules non-mobiles et immobiles sur colloïdales d'or revêtues de lamelles sont présentés dans la figure 2.
Remarque: Les nanoparticules d'or de la taille utilisée dans le test de motilité piste phagokinetic a été trouvé pour être complètement non toxique pour les cellules 30. Si nécessaire, La viabilité des cellules examinées peut être évaluée par coloration au bleu trypan ou examinés pour d'autres marqueurs de la viabilité cellulaire. Il faudrait tenir compte de la nécessité pour la fixation, le type de fixation, etc, si cette étape doit être réalisée.
- En utilisant le logiciel librement disponible, comme logiciel ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) ou NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ), développés à l' National Institutes of Health, ou ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ) développé à l'Université du Texas Health Science Center à San Antonio, la superficie moyenne (en unités arbitraires) de l'or colloïdal autorisé par 10-20 ou plusieurs cellules (par exemple) est déterminé pour chaque groupe expérimental à partir des images capturées. Les statistiques peuvent alors être exécutés sur til a recueilli les résultats. Par exemple, les résultats peuvent être tracées en moyenne ± l'erreur-type des moyens (SEM) avec des tests t de Student effectués, et une valeur de P <0,05 utilisés comme mesure de la signification statistique entre les échantillons. Figures 3 et 4 montrent des étapes de la analyse de la zone de l'or colloïdal dégagé par la cellule.
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Representative Results
Montré est un exemple de photos prises au microscope optique montrant une zone de piste effacée par une seule cellule (un monocyte de nos expériences est illustré à la figure 2). Cellules non-mobiles de créer typique de petite taille, de forme ovale ou un cercle en forme de tracts autour d'eux indiquant un faible niveau basal de mouvement de ces cellules non stimulées (Figures 2A et 2B). En revanche, les cellules très mobiles [dans notre système, le cytomégalovirus humain (HCMV)-cellules infectées] sont caractérisées par un mouvement directionnel montré dans les figures 2C et 2D comme des zones allongées piste. Après avoir obtenu plusieurs images des zones de piste à l'aide d'un microscope inversé avec un objectif 40x, les zones de piste au total ont été marqués à l'aide du logiciel ImageJ (figure 3); résultats similaires peuvent être obtenus avec d'autres applications logicielles. Nous privilégions le logiciel ImageJ, car il est gratuit et facile à utiliser. Cellules mobiles ne créent pas standard, géométriques en forme de pistes dusonner leur mouvement: ainsi, un moyen pratique pour marquer la zone à analyser est de sélectionner l'outil à main levée dans le logiciel ImageJ afin de marquer la forme de la piste créée par la cellule mobile (figure 3). Après avoir délimité la zone de la piste à analyser, la mesure quantitative des données est réalisée en cliquant sur "Analyse" dans la barre de menu ImageJ et en choisissant "Mesure" dans le menu déroulant. Un échantillon de nos résultats en unités arbitraires obtenues en analysant les domaines de piste cellulaires recueillies à partir des données présentées dans la figure 3 est représenté à la figure 4A. Les résultats recueillis à partir du logiciel ImageJ peuvent ensuite être analysées dans un tableur de choix pour permettre le calcul de la zone de piste moyen approuvé par cellule, comme indiqué sur la figure 4B.
Dans notre expérience, l'étape la plus difficile de ce protocole est la production des colloïdales revêtues d'or lamelles, le sujet de préoccupation est le gGÉNÉRATION des lamelles avec une couverture uniforme de nanoparticules d'or (questions liées à ce problème sont discutées à la section 2.8 ci-dessus). Le cas échéant, une couverture uniforme de nanoparticules d'or sur un coveslip est présenté à la figure 2. Une protection qui est trop dense (figures 1A et 1B) ou trop clairsemées (figures 1C et 1D) empêchera la migration cellulaire ou modifier l'analyse reproductible de la taille et de la forme de la zone de la piste. Le deuxième point important tel que discuté à la section 3.2 ci-dessus, est la densité des cellules étalées et la nécessité d'éviter les chevauchements ou fusionné pistes à partir de plusieurs cellules.
Figure 1. Problèmes potentiels avec la densité de l'or colloïdal sur les lamelles. Représenté sur cette figure sont des exemples de colloïdales revêtues d'or lamelles soit avec un Panels trop élevés (
Figure 2. Exemples de pistes créées par des non-mobiles (Panneaux A et B) et mobiles (panneaux C et D) sur les cellules colloïdales revêtues d'or lamelles. Virus sans médias (maquette infecté) ou des supports contenant des particules virales (HCMV infectés) ont été ajouter à Peripher isolémonocytes sanguins al 10,18-22. Les monocytes ont été incubées à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 1 heure et ensuite plaquées sur colloïdales revêtues d'or lamelles de 24 heures à 37 ° C / 5% de CO 2. Les photos ont été prises en utilisant un objectif 40x. Les flèches blanches marquent monocytes dans leur emplacement final. Comme nous l'avons démontré précédemment 10,18-22, monocytes non infectées sont caractérisées par un faible niveau basal de la motilité, tandis que les cellules infectées par HCMV présentent des caractéristiques de grande mobilité. Taille bar correspond à 25 mm de longueur.
Figure 3. Marquage de la zone des pistes cellulaire en utilisant le logiciel ImageJ. Exemples présentés sont des instantanés de pistes, dans lequel le logiciel Image J a été utilisé lors de l'analyse des traces laissées par les non-mobiles (panels A et B) et mobiles (panneaux C etD) les cellules sur colloïdales revêtues d'or lamelles (Remarque: Les pistes sont encerclés par une ligne blanche à l'aide de l'outil à main levée ImageJ). Les exemples de photos, les mêmes que ceux de la figure 2, ont été utilisés dans cette figure pour mesurer les zones de piste compensés par une seule cellule. Ce sont des images représentatives de monocytes maquettes et HCMV infectés, cependant, habituellement 10-20 images sont analysées par échantillon. Taille bar correspond à 25 mm de longueur.
Figure 4. L'évaluation quantitative de la motilité cellulaire en utilisant le logiciel ImageJ et Tableur. A) les zones défrichées piste mesurées par les cellules, comme décrit dans les exemples de photos (figures 2 et 3), en utilisant le logiciel ImageJ. Les résultats calculés # 1, # 2, # 3 et # 4 correspondent à des parties A B, C et D dans les figures 2 et 3, respectivement B) Une représentation graphique de surfaces moyennes (moyennes;. dans des unités arbitraires) dégagé par les cellules et analysées par le logiciel ImageJ. Dans cet exemple, l'erreur type de la moyenne ne s'affiche pas, parce que dans l'exemple d'un nombre insuffisant de répétitions est analysé. Remarque: Le logiciel ImageJ permet la superficie mesurée de pistes en unités arbitraires, par conséquent, il est essentiel de comparer des photos de pistes prises en vertu de la même grossissement. La méthode la plus simple de comparer les résultats des expériences séparées est de comparer l'évolution de pliage entre échantillons examinés.
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Discussion
Le dosage de piste phagokinetic motilité présenté dans cet article est une méthode simple et très efficace pour l'analyse quantitative de la migration cellulaire. Parce que plusieurs types de cellules peuvent être analysées 9-17, cette méthode présente l'utilisation vaste potentiel dans de multiples disciplines. L'utilisation de lamelles de verre colloïdales revêtues d'or permet la mesure d'une zone de route autorisée par une cellule mobile. Le test permet de mesurer l'effet de stimuli différents (facteurs de croissance purifiés, c.-à-ligands ECM, virus, bactéries) sur la motilité cellulaire. En outre, l'absence de l'exigence de fixation cellulaire permet la surveillance de la migration cellulaire à différents moments expérimentaux. En outre, le test ne nécessite qu'un microscope optique standard, un appareil photo standard à l'aide d'un capteur d'image CCD (dispositif à couplage de charge) et des logiciels disponibles gratuitement. Par conséquent, les microscopes sophistiqués et les caméras ne sont pas nécessaires, ni les suites logicielles spéciales. Même si le culay est simple dans sa conception, il est un outil puissant pour étudier statistiquement la motilité de plusieurs types de cellules sous une multitude de conditions expérimentales. Par exemple, dans ce qui concerne, le test peut être utilisé pour étudier efficacement un petit nombre d'échantillons expérimentaux, ainsi que pour servir efficacement comme un test de criblage à haut débit. Parce que les lamelles peuvent être examinées non fixée, le dosage peut également permettre l'analyse de déplacer des cellules au cours du temps sans avoir besoin d'un microscope avec un joint humidifié, chauffée incubateur à CO 2. En outre, le dosage piste phagokinetic motilité est utile pour l'étude d'une motilité des cellules ne se prêtent pas à une imagerie time-lapse, comme un photoblanchiment des fluorophores cellules colorées est moins préoccupante dans le test de motilité à base d'or colloïdal. L'évaluation quantitative des zones défrichées piste par une seule cellule est réalisée en utilisant le logiciel librement disponible ImageJ, bien que d'autres logiciels peuvent être utilisés. En outre, le graphica globaleanalyses et statistiques obtenu l exigent seulement une connaissance de base des calculs, des tableurs et des statistiques.
Il convient de noter que la méthode originale décrit l'utilisation d'albumine de sérum bovin (BSA) pour couvrir le verre de lamelles 9. Cependant, l'utilisation de BSA a été jugée peu fiable en tant qu'agent pour permettre l'uniforme monocouche d'or colloïdal 27. La substitution de la gélatine pour la BSA, en tant que revêtement de la lamelle, a augmenté l'adhésion des nanoparticules d'or pour la lamelle. D'autres modifications introduites par Scott et al. 27 à protocole grandement amélioré la qualité de l'enrobage des nanoparticules d'or. Néanmoins, on trouve, sur la base de Turkevich et al. 23, que l'utilisation de citrate de sodium comme agent réducteur créé la monocouche plus uniforme de nanoparticules d'or. Par conséquent, nous sommes favorables à cette méthode et en tant que telle, elle est décrite dans notre protocole.
Pour permettre ahaute degré de reproductibilité de l'analyse, il est important de suivre scrupuleusement les volumes et les températures indiquées dans le protocole, que les écarts peuvent fortement influencer le résultat final. Comme indiqué plus haut, l'un des obstacles techniques à l'utilisation du test de motilité piste phagokinetic implique la production de nanoparticules d'or dans la solution, puis à obtenir une concentration appropriée uniforme de l'or nanoparticules sur la lamelle. Ainsi, même si l'étape de précipitation de nanoparticules d'or est reproductible, nous mettons l'accent sur l'évaluation de la couleur de la solution finale de nanoparticules d'or précipitées. De plus, c'est notre raison d'être seule ajoutant la moitié du volume normal de la solution finale sur chacune des lamelles, et puis après 0,5 h, l'évaluation de la densité et l'uniformité des particules d'or sur les lamelles (avec la possibilité d'ajouter une solution complémentaire, le cas nécessaire plus tard). Ces précautions sont prises pour éviter de créer un état où til lamelles de montrer soit trop élevé (figures 1A et 1B) ou trop basse (figures 1C et 1D) une concentration de nanoparticules d'or sur des lamelles de verre.
Dans l'ensemble, le dosage piste phagokinetic motilité est une méthode simple pour analyser le mouvement des cellules. Il donne un aperçu de la distance (via la zone de piste final) qu'une cellule déplacée sur une période de temps définie. En outre, le dosage est très ouvert à plusieurs stimuli, c'est-a examiné les cellules peuvent être testées dans une variété d'options de traitement. Par exemple, dans nos expériences monocytes, nous avons testé la motilité des monocytes infectés viralement, les cytokines traités, des facteurs de croissance, traité mitogène-traitée, et LPS-traitée. Par ailleurs, nous avons testé les monocytes activés sous une variété de conditions inhibiteurs / inhibiteurs pour examiner le rôle fonctionnel diverses voies biochimiques / moléculaires jouer dans la motilité des monocytes. Contrairement à un test de cicatrisation 31, measurinbc effet cumulatif de la prolifération cellulaire et la migration, ou une chambre de Boyden (trans-même) 32 test de migration, ce qui permet une analyse globale de la motilité cellulaire chimiotactique, la piste d'essai phagokinetic motilité évalue la migration des cellules du même. Cependant, si il ya un besoin pour un effet chimiotactique vrac à mesurer, une migration en trois dimensions / invasion être évaluées, une analyse plus détaillée d'un mouvement cellulaire, ou l'analyse du mouvement cellulaire dans des conditions in vivo, ce protocole serait suffit pas et l'utilisation de méthodes supplémentaires, comme un essai de migration trans-même, un essai de l'invasion matrigel 33, en direct du temps caduc microscopie / photographie 34,35, etc devraient être pris en considération.
Le dosage de piste phagokinetic motilité est un simple, l'évaluation quantitative / comparaison de la capacité des cellules à migrer sans avoir besoin de l'aide de microscopes coûteux et des logiciels dans les analyses. Elle est adressée au résearchers qui ont besoin d'un moyen rapide et facile, mais fiable, méthode de quantification de la motilité cellulaire, offrant la possibilité d'un simple test à haut débit.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health (AI050677, HD-051 998, et GM103433), un Malcolm Feist bourse de recherche cardio-vasculaire, et une bourse de l'American Heart Association prédoctoral (10PRE4200007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Coverslips (15mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| Gelatin 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| Tetrachloroauric Acid Trihydrate | Fisher Chemical | G54-1 | 14.5 mM (a final working solution) |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | BP327-500 | 0.5% (a final working solution) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 3% (a final working solution) |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Sarstedt | 83.1802 | |
| 12-Well Plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Oven Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | The standard laboratory oven will suffice |
| 10 ml Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-Aid Filler/Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 Single-Channel Manual Pipette | Rainin | PR-200 | |
| 200 ml Barrier Tips | CLP | BT200 | |
| ImageJ software | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | License: Public Domain | |
| Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera | Nikon | Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes. | |
| Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications. | |||
References
- Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
- Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
- Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
- Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
- Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
- Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
- Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
- Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, Humana Press. 379-392 (2010).
- Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
- Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
- Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
- Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
- Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
- McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
- Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
- Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
- Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
- Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
- Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
- Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
- Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
- Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
- Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
- Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
- Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).
- Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
- Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
- Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).
