Summary
O ensaio de pista phagokinetic motilidade é um método utilizado para avaliar o movimento das células. Especificamente, o ensaio mede quimiocinese (motilidade celular aleatória) ao longo do tempo de uma forma quantitativa. O ensaio tira vantagem da capacidade das células para criar uma faixa mensurável do seu movimento em coloidais de ouro revestidas com lamelas.
Abstract
Motilidade celular é um processo biológico importante para ambos os organismos unicelulares e multicelulares. É essencial para o movimento de organismos unicelulares para uma fonte de nutrientes ou de distância a partir de condições inadequadas, bem como em organismos multicelulares para o desenvolvimento do tecido, a vigilância imunitária e cicatrização de feridas, apenas para mencionar alguns papéis 1,2,3. Desregulação deste processo pode conduzir a graves doenças neurológicas, cardiovasculares e imunológicas, assim como a formação de tumores e exacerbada espalhar 4,5. Molecularmente, actina de polimerização e reciclagem do receptor têm sido mostrados para desempenhar um papel importante na criação de extensões celulares (lamellipodia), que orientam o movimento para a frente da célula 6,7,8. No entanto, muitas questões biológicas sobre a migração de células permanecem sem resposta.
O papel central para a motilidade celular na saúde humana e doenças sublinha a importância de compreender o mec específicahanisms envolvidos neste processo e torna os métodos precisos para avaliar a motilidade celular particularmente importante. Microscópios são geralmente usados para visualizar o movimento das células. No entanto, as células se movem muito lentamente, fazendo a medição quantitativa da migração de células de um processo que consome recursos exigindo câmeras caras e software para criar quantitativos tempo decorrido filmes de células móveis. Portanto, a capacidade para realizar uma medição quantitativa da migração de células que é de custo eficaz, não-trabalhoso, e que utiliza equipamento de laboratório comum é uma grande necessidade de muitos investigadores.
O ensaio de motilidade phagokinetic faixa utiliza a capacidade de uma célula que se deslocam para limpar as partículas de ouro a partir do seu caminho para a criação de uma faixa mensurável sobre uma lamela de vidro revestido a ouro coloidal 9,10. Com o uso de software disponível livremente, várias faixas podem ser avaliados para cada tratamento para realizar requisitos estatísticos. O ensaio pode ser utilizado para avaliarmotilidade de muitos tipos de células, tais como células cancerosas, 11,12, fibroblastos, neutrófilos 9 13, células do músculo esquelético, queratinócitos 14 15, 16 trofoblastos, células endoteliais e monócitos, 17 10,18-22. O protocolo envolve a criação de lâminas revestidas com nanopartículas de ouro (Au °) que são gerados por uma redução de ácido cloroáurico (Au 3 +) por citrato de sódio. Este método foi desenvolvido por Turkevich et al. Em 1951 23 e, em seguida, melhorado na década de 1970 por Frens et al. 24,25. Como um resultado deste passo de redução química, as partículas de ouro (10-20 nm de diâmetro) precipitar a partir da mistura de reacção e pode ser aplicado a lamelas de vidro, os quais são, então, pronto para utilização em análises de migração celular 9,26,27.
Em geral, o ensaio de motilidade phagokinetic pista é uma medida rápida, fácil e quantitativo da motilidade celular. Além disso, elepode ser utilizado como um ensaio de elevado débito simples, para ser utilizado com os tipos de células que não são passíveis de tempo caduco de imagem, assim como outras utilizações, dependendo das necessidades do investigador. Em conjunto, a capacidade de medir quantitativamente a motilidade celular de vários tipos de células, sem a necessidade de caros microscópios e software, bem como o uso de equipamento de laboratório comuns e produtos químicos, fazer o ensaio de motilidade phagokinetic faixa uma escolha sólida para cientistas com interesse na compreensão celular motilidade.
Protocol
1. Preparação de gelatina revestidos Lamelas
- Colocar o ácido-lavadas lamelas de vidro (15 mm de diâmetro) numa placa de plástico estéril milímetro 100 (ES). Coloque 8-9 lamínulas por placa e verifique se eles não estão tocando um ao outro ou os lados do prato ..
Nota: As lamelas, agulhas e pinças devem ser estéreis para eliminar possíveis microorganismos contaminantes, assim como endotoxinas, que irão afectar as funções celulares, incluindo a motilidade.
- Pesa-se o pó de gelatina e ressuspender o pó em água desionizada para produzir uma solução de gelatina com uma concentração final de 0,5 g/300 ml. Em seguida, a solução de gelatina deve ser autoclavado.
- Pipetar 2-3 gotas de gelatina (~ 100-150 ml) em cada lamela.
Nota: Tenha cuidado para não permitir que a gelatina para tocar o prato ou você não será capaz de remover as lamelas do prato.
- Coza as lamelas revestidas com gelatina no prato de 100 mm em um forno a 90 ° C durante 10 min.
- Retire o excesso de gelatina por pipetagem suave.
- Secam-se as lamelas no prato de 100 mm, na estufa a 70 ° C durante 45 min.
- Depois de seco, retire as lamelas do prato de 100 mm usando um estéril, agulha endotoxina livre e pinças (a agulha é usada para gentilmente cutucar a lamela para torná-lo acessível para a pinça para remover suavemente).
- Coloque individuais de gelatina revestidos lamelas em poços separados de uma placa de 24 poços.
2. Preparação de ouro coloidal revestido Lamelas
- Pesar uma quantidade apropriada de ácido cloroáurico (tri-hidrato de ácido tetracloroáurico; HAuCl 4 · 3H 2 O), e em seguida ressuspender em água desionizada estéril para preparar uma solução final de 14,5 mM (tóxico). Preparar 1,5 ml da solução por 8-9 lamelas.
Aviso: ácido cloroáurico é hbraçada se ingerido, causa queimaduras na pele e lesões oculares graves e pode provocar uma reação alérgica na pele. Tóxico se ingerido.
- Pesar uma quantidade adequada de citrato de sódio (trissódico di-2-hidroxipropano-1 ,2,3-tricarboxilato; Na 3 C 6 H 5 O 7) e, em seguida, voltar a suspender o pó em água desionizada para se obter uma solução final de 0,5%. Prepare 1 ml da solução por 8-9 lamelas.
Aviso: O citrato de sódio pode causar irritação dos olhos e da pele. Ele também pode causar irritação do trato respiratório e digestivo.
- Em uma solução estéril, livre de endotoxinas proveta 1,5 ml de combinar a 14,5 mM estéril HAuCl solução 4 e 13,5 mL de água desionizada estéril; o resultado deve originar uma solução amarelo pálido. Os volumes acima referidos irá permitir por 8-9 lamelas de ouro coloidal a serem feitas.
- Enquanto agitando continuamente, aquecer a solução sobre uma placa quente até que comece a bóleo.
Aviso: O aquecimento da solução deve ser realizada no exaustor de fumos, como os vapores podem ser nocivos / tóxicos. Os vapores são destrutivas para o tecido das membranas mucosas e do trato respiratório superior.
- Retirar o copo da placa de aquecimento.
- Enquanto se agita, adicionar 0,7 ml da solução a 0,5% de citrato de sódio. O volume acima mencionado irá permitir por 8-9 lamelas de ouro coloidal a serem feitas.
- Continue mexendo esta solução combinada de cerca de 2 min (Nota: A cor da solução irá gradualmente mudar de amarelo fraco, para limpar, a cinza, a púrpura, a púrpura de profundidade, antes de finalmente chegar a um vinho tinto ou, de preferência, ferrugem cor) . Este produto é a sua solução de ouro coloidal.
- Arrefece-se a solução de ouro coloidal numa pipeta de 10 ml para 1-2 min (de modo a manter a camada de gelatina sobre a lamela de fusão, quando a solução de ouro coloidal é adicionada) e em seguida, adicionar 1,0-2,0 ml do colloidal solução de ouro em cada lamela de gelatina revestida previamente colocada em um prato de 24 cavidades (s) (a quantidade da solução de ouro coloidal, que adiciona as lamelas revestidas com gelatina depende de quão bem as partículas de ouro precipitou na solução - ver comentários abaixo).
Observação: Uma vez que pode haver variações na eficácia da precipitação de partículas de ouro, é aconselhável primeiro adicionar 0,5-1 ml da solução de ouro coloidal para as lamelas revestidas com gelatina e, em seguida, colocar o prato de 24 cavidades na incubadora durante 0,5 hr . Após este período de incubação, as lamelas devem ser verificadas sob o microscópio de luz para a densidade apropriada de partículas de ouro sobre as lamelas. Ver Figura 1 para a 20x de imagens de microscopia exemplos de muito baixa e uma concentração demasiado elevada de partículas de ouro. Ver Figura 2 para imagens de microscopia de 40x a concentração ideal de partículas de ouro (pelo menos para o uso com os monócitos). O optdensidade Imal das nanopartículas de ouro sobre a lâmina deve ser determinado experimentalmente para cada tipo de células utilizado, tal como as características das diferentes células vai ditar a sua força de movimento sobre as lamelas. Se a concentração de partículas de ouro é insuficiente, adicionar um ml 0,5-1 adicionais da solução de ouro coloidal para as lamelas revestidas com gelatina.
Dependendo do tamanho da célula, a concentração apropriada de partículas de ouro pode variar e, portanto, em última análise depende do tamanho da célula examinadas para a motilidade. Por exemplo, com monócitos humanos que são de tamanho pequeno de células (~ 10-20 uM 28), uma maior concentração de partículas de ouro foi requerido na nossa análise. A distribuição apropriada de nanopartículas de ouro fornece o pesquisador, com a capacidade para facilmente e eficientemente distinguir as bordas de faixas celulares. A concentração de partículas de ouro que é demasiado elevado dificulta a capacidade das células para se mover e, por conseguinte, para medir com precisãosua motilidade, enquanto que uma concentração de partículas de ouro que é demasiado baixo para os limites de capacidade delinear uma faixa precisa de motilidade.
Nota importante: se a síntese de nanopartículas de ouro é problemática, nanopartículas de ouro sintetizados estão comercialmente disponíveis em tamanhos de 5 nm a 400 nm. Além disso, a microesferas fluorescentes também têm sido utilizadas em estudos da motilidade celular 29. No entanto, o uso destas microesferas exige um microscópio fluorescente para a análise de migração celular.
- Coloque o prato de 24 cavidades com o ouro coloidal-cobertas lamelas em uma incubadora a 37 ° C e incuba-se a partir de 1 hora até durante a noite.
- Após a incubação, lavar / remover o ouro não ligado por imersão das lamelas (3x) em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS, pH 7,4).
- Colocar estes coloidais de ouro revestidas com lamelas numa placa de 12 poços limpos (es) contendo PBS.
- Armazenar estas lamelas a 4 ° C até estar pronto parausar (parafilme a placa antes de colocar no frigorífico).
Nota Importante: Sempre manter as coloidais revestidas de ouro lamínulas em algum tipo de líquido / mídia como as partículas de ouro pode descamar as lamelas de se secar. As lamelas de ouro coloidal deve ser usado dentro de 2-3 meses a partir da data em que foram feitas.
Controlo de Qualidade: Em um ensaio de motilidade phagokinetic única faixa, é crítica a utilização lamelas que são caracterizadas por uma concentração semelhante de partículas de ouro. Este ponto simples permitirá que as diferenças quantitativas na motilidade celular entre as amostras a ser unicamente devido a natureza do tratamento e não as propriedades físicas dos coloidais de ouro revestidas com lamelas. Nós favorecer a utilização de lamelas apenas feitos ao mesmo tempo em experiências individuais, embora tenhamos mostrado que, enquanto a densidade das nanopartículas de ouro são iguais, a utilização de lamelasa partir de diferentes preparações é apropriado.
3. Análise de Motilidade Celular
- Colocar os coloidais de ouro revestidas com lamelas em meio apropriados celulares para as células de interesse.
- Transferir as células tratadas apropriadamente para as coloidais de ouro revestidas com lamelas colocadas numa placa de 24 poços (es)
Nota: O número de células transferidas para o único poço tem de ser determinado para cada tipo de célula estudada. Idealmente, as células têm de ser distribuídos igualmente sobre a lamela de ouro coloidal revestido, que por sua vez vai permitir a análise estatística de faixas apenas criados por uma única célula. Se as células são plaqueadas a uma concentração demasiado elevada, torna-se altamente provável que as faixas sobrepostas de várias células pode ser vista. Faixas sobrepostas não podem ser quantificados com precisão e, por conseguinte, não podem ser tidos em conta nas análises finais do movimento das células testadas. Sobreposição faixas como resultado deo envolvimento de células múltiplas são geralmente facilmente observado, como fundidos ou cruzado faixas (no campo da análise), na qual duas ou mais células podem ser observados na área contígua mesma apagada.
- Incubar a 37 ° CO C / 5% 2, durante 24 horas (ou durante qualquer momento adequado, por exemplo, nós analisamos a motilidade dos monócitos entre 6 hr e 24 hr células pós-tratamento e endoteliais a 12 hr pós-tratamento). O período de tempo óptimo para determinar e medir a motilidade celular irá variar com o tipo de célula estudada e, assim, deve ser determinado experimentalmente para cada tipo de célula (um bom ponto de partida, no entanto, é 6-12 tratamento pós-hr).
Nota: Se experimentais coloidais de ouro revestidas com lamelas têm de ser armazenados e / ou analisados em um momento posterior, as células e nanopartículas de ouro devem ser fixados sobre as lamelas. Para realizar esta etapa de fixação; Passo seguinte 3.3, a primeira lavagem lamínulas cuidadosamente duas vezes com 1xPBS (imersão de lamelas é preferível, como uma remoção de nanopartículas de ouro a partir de lamelas devem ser evitados), em seguida, utilizar um método de fixação padrão de células, tal como a incubação com paraformaldeído à temperatura ambiente de 3%. Após uma incubação de 15 min, a 3% de paraformaldeído deve ser retirado e lavado cuidadosamente as lamelas 3 vezes com PBS 1x. As lamelas fixas podem ser armazenados num frigorífico.
- Usando um microscópio de luz, capturar imagens das faixas criados por uma única célula em movimento (Nota: A ampliação usado para tirar fotografias de pistas celulares irão certamente variar dependendo do tipo de célula em estudo). Exemplos de pistas celulares criadas por células não-móveis e móveis sobre coloidais de ouro revestidas com lamelas são mostrados na Figura 2.
Nota: As nanopartículas de ouro do tamanho usado no ensaio phagokinetic faixa motilidade foi encontrado para ser totalmente não tóxico para as células 30. Se necessário, A viabilidade das células analisadas pode ser avaliada por coloração com azul de tripano ou examinados para outros marcadores de viabilidade celular. Um teria que ter em conta a necessidade de um tipo de fixação, de fixação, etc, se este passo tem de ser realizada.
- Usando o software livremente disponível, tal como o software ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) ou NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ), desenvolvidos no National Institutes of Health, ou ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ) desenvolvido na Universidade do Texas Health Science Center em San Antonio, a área média (em unidades arbitrárias) de ouro coloidal apuradas pela 10-20 ou mais células (por exemplo) é determinado para cada braço experimental a partir das imagens captadas. As estatísticas podem então ser realizadas em tele colecionou resultados. Por exemplo, os resultados podem ser representados como média ± o erro padrão das médias (SEM) com teste t de Student realizados, e um valor de P de <0,05 utilizadas como a medida de significância estatística entre as amostras. Figuras 3 e 4 passos mostram na análise da área de ouro coloidal apuradas pela célula.
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Representative Results
É mostrado um exemplo de imagens tomadas com um microscópio de luz, mostrando a área eliminada por via de uma única célula (a partir de monócitos nossas experiências é mostrado na Figura 2). As células não-móveis criar característica oval, pequeno ou em forma de círculo em torno de si tractos indicando um baixo nível basal de movimento para estas células não estimuladas (figuras 2A e 2B). Em contraste, as células altamente motile [no nosso sistema, o citomegalovírus humano (HCMV), as células infectadas] são caracterizados por um movimento direccional mostrada nas Figuras 2C e 2D, como as áreas de pista alongada. Após a obtenção de várias imagens de áreas de faixa usando um microscópio invertido com uma objetiva de 40x, as áreas totais de pista foram marcados com o software ImageJ (Figura 3); resultados semelhantes podem ser obtidos com outras aplicações de software. Nós somos a favor do software ImageJ, porque é livre e fácil de usar. Células móveis não criar padrões geométricos, em forma de faixas dutocar o seu movimento, assim, uma forma conveniente para marcar a área a ser analisada é seleccionar a ferramenta à mão livre no software ImageJ, a fim de marcar a forma da pista criado pelo movimento das células (Figura 3). Tendo delineado a área de pista a ser analisada, a medição quantitativa dos dados é feita clicando em "Análise" na barra de menu e escolher ImageJ "medida" do menu suspenso. Um exemplo dos resultados obtidos em unidades arbitrárias por análise das áreas de pista celulares recolhidos a partir dos dados apresentados na Figura 3 é mostrada na Figura 4A. Os resultados obtidos a partir do software ImageJ podem então ser analisados numa folha de cálculo de escolha a fim de permitir o cálculo da área de pista apagada média por célula, como mostrado na Figura 4B.
Na nossa experiência, a etapa mais problemática do protocolo é a produção dos coloidais de ouro revestidas de lamelas, o motivo de preocupação é a generation de lamelas com uma cobertura uniforme de nanopartículas de ouro (questões relacionadas com esta preocupação são discutidos em 2.8 acima). A cobertura, apropriado uniforme de nanopartículas de ouro sobre um coveslip é apresentado na Figura 2. Cobertura que é muito densa (Figuras 1A e 1B) ou muito escassa (Figuras 1C e 1D) vai impedir a migração de células ou alterar a análise reprodutível do tamanho e da forma da área de pista. O segundo ponto-chave conforme discutido em 3.2 acima, é a densidade das células plaqueadas e a necessidade de evitar a sobreposição ou a partir de células fundidas faixas múltiplas.
Figura 1. Problemas potenciais com a densidade de ouro coloidal sobre as lamelas. Mostrado nesta figura são exemplos de coloidais de ouro revestidas com lamelas de cobertura, quer com uma Painéis demasiado elevadas (
Figura 2. Exemplos de pistas criadas por não-móveis (Painéis A e B) e móveis (Painéis C e D), as células no coloidais de ouro revestidas com lamelas. Virus livres de meios de comunicação (falsamente infectadas) ou meios contendo partículas virais (HCMV-infectados) foram adicionado PERIFÉRICOS isoladomonócitos do sangue ai 10,18-22. Os monócitos foram incubados a 37 ° C / 5% de CO2 durante 1 hora e depois plaqueadas sobre coloidais de ouro revestidas com lamelas de 24 hr a 37 ° C / 5% de CO 2. Fotos foram tiradas usando uma objetiva de 40x. Setas brancas marcar monócitos na sua localização final. Como já anteriormente demonstrado 10,18-22, os monócitos não infectadas são caracterizadas por um baixo nível basal de motilidade, enquanto que as células infectadas com HCMV apresentam características de motilidade elevada. Bar tamanho corresponde a 25 um de comprimento.
Figura 3. Marcando a Área das Faixas celulares usando software ImageJ. Exemplos mostrados são instantâneos de faixas, em que o software Image J foi utilizado durante a análise das faixas criadas por não-móveis (Painéis A e B) e móveis (Painéis C eD) sobre células coloidais revestidas de ouro lamelas (Nota: Faixas estão circundadas por uma linha branca usando a ferramenta mão livre ImageJ). As imagens de exemplo, os mesmos que os mostrados na Figura 2, foram utilizados nesta figura para medir as áreas de pista compensados por uma única célula. Estas são as imagens representativas de monócitos e de simulação-HCMV infectado, no entanto, geralmente 10-20 imagens são analisadas por amostra. Bar tamanho corresponde a 25 um de comprimento.
Figura 4. A avaliação quantitativa da motilidade celular Usando Software ImageJ e planilha. A) as áreas de pista de medição limpos pelas células, como representado nas figuras da amostra (Figura 2 e 3), utilizando o software ImageJ. Os resultados calculados # 1, # 2, # 3 e # 4 correspondem aos Painéis A B, C e D nas figuras 2 e 3, respectivamente, B) A representação gráfica das áreas médias (meio,. em unidades arbitrárias) eliminada por células e analisadas pelo software ImageJ. Neste exemplo, o erro padrão da média não é mostrado, porque, no exemplo, um número insuficiente de repetições é analisada. Nota: O software ImageJ fornece a área medida de faixas em unidades arbitrárias, por isso, é muito importante para comparar imagens de faixas tomadas sob a mesma ampliação. O método mais simples para comparar os resultados de experimentos separados é comparar as alterações vezes entre amostras examinadas.
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Discussion
O ensaio de motilidade phagokinetic faixa apresentada neste artigo é um método simples e altamente eficaz para a análise quantitativa da migração celular. Porque vários tipos de células pode ser analisada 9-17, este método tem o potencial de uso amplo em várias disciplinas. A utilização de lamelas de ouro coloidal revestido de vidro permite a medição de uma área de faixa, compensado por uma célula em movimento. O ensaio pode medir o efeito de diferentes estímulos (por exemplo, factores de crescimento purificados ligandos de ECM, vírus, bactérias) sobre a motilidade celular. Além disso, a falta do requisito para a fixação das células permite o monitoramento da migração de células em diferentes pontos de tempo experimentais. Além disso, o teste exige apenas um microscópio de luz padrão, uma câmara normal utilizando um sensor de imagem CCD (dispositivo acoplado de carga) e um software de acesso livre. Portanto, os microscópios sofisticados e câmeras não são necessários, nem são suites de software especiais. Mesmo que a bundaay é simples na sua concepção, é uma ferramenta poderosa para estudar estatisticamente a motilidade dos vários tipos de células sob múltiplas condições experimentais. Por exemplo, nesta matéria, o ensaio pode ser utilizado eficazmente para estudar um pequeno número de amostras experimentais, bem como para servir eficazmente como um ensaio de elevado rendimento de rastreio. Uma vez que as lamelas de cobertura pode ser examinado não fixo, o ensaio pode também permitir a análise de mover as células ao longo do tempo, sem a necessidade de um microscópio com um pavimento humidificado, aquecido incubadora de CO 2. Além disso, o ensaio de motilidade phagokinetic pista é útil no estudo de uma motilidade de células não passíveis de uma imagem de lapso de tempo, como uma fotodegradação de fluoróforo manchados de células é uma preocupação menor no ensaio de motilidade ouro coloidal-baseado. A avaliação quantitativa de áreas de pista compensados por uma única célula é conseguido usando o software ImageJ livremente disponível, embora outro software pode ser utilizado. Além disso, o conjunto graphical análises e estatísticas obtidas apenas necessita de um conhecimento básico de cálculos, planilhas e estatísticas.
Deve notar-se que o método original descrito o uso de albumina de soro bovino (BSA) para cobrir o vidro lamelas 9. No entanto, a utilização de BSA foi encontrado para ser pouco fiável como um agente para permitir o ouro coloidal uniforme monocamada 27. A substituição de gelatina para BSA, como revestimento da lamela, aumentou a aderência de nanopartículas de ouro com a lamela. Modificações adicionais introduzidos por Scott et al. 27 para o protocolo melhorado muito a qualidade do revestimento de nanopartículas de ouro. No entanto, verificou-se, com base na Turkevich et al. 23, que o uso de citrato de sódio como agente redutor criado a monocamada mais uniforme das nanopartículas de ouro. Portanto, preferimos este método e, como tal, isto é descrito em nosso protocolo.
Para permitir ahigh grau de reprodutibilidade do ensaio, é importante seguir rigorosamente os volumes e temperaturas indicadas no protocolo, como desvios podem influenciar fortemente os resultados finais. Como discutido acima, um dos obstáculos técnicos no uso de ensaio de motilidade phagokinetic faixa envolve a produção das nanopartículas de ouro na solução e, em seguida, na obtenção de uma concentração apropriada uniforme de nanopartículas de ouro sobre a lamela. Assim, mesmo que o passo de precipitação de nanopartículas de ouro é reprodutível, colocamos uma ênfase na avaliação da cor da solução final de nanopartículas de ouro precipitados. Além disso, esta é a razão para a adição de apenas a metade do volume normal da solução final para cada lamelas e, em seguida, depois de 0,5 horas, a avaliação da densidade e uniformidade das partículas de ouro sobre as lamelas (com a possibilidade de adicionar uma solução adicional, caso necessário mais tarde). Estas precauções são tomadas para evitar a criação de um estado onde tele mostra lamelas ou muito alta (Figuras 1A e 1B) ou muito baixo (Figuras 1C e 1D) uma concentração de nanopartículas de ouro sobre lamelas de vidro.
Em geral, o ensaio de motilidade phagokinetic faixa é um método simples para analisar o movimento celular. Ele oferece um instantâneo da distância (através da área de faixa final) que uma célula se mudou ao longo de um período de tempo definido. Além disso, o ensaio é muito receptivo a estímulos múltiplos, isto é, examinaram as células podem ser testadas sob uma variedade de opções de tratamento. Por exemplo, nas nossas experiências de monócitos, nós testamos a motilidade dos monócitos infectados viralmente, citocina-tratada, factor de crescimento--tratadas, por mitogénio tratado e tratado com LPS. Além disso, nós testamos estes monócitos activados sob uma variedade de inibidores da / condições inibidoras para examinar o papel funcional de diversas vias bioquímicas / molecular desempenhar na motilidade dos monócitos. Ao contrário de um ensaio de cicatrização da ferida 31, measuringa efeito cumulativo da proliferação e migração celular, ou de uma câmara de Boyden (trans-bem) ensaio de migração 32, permitindo que uma maior parte da análise da motilidade quimiotáctica de células, o ensaio de motilidade phagokinetic faixa avalia a migração de célula única. No entanto, se houver uma necessidade de um efeito quimiotático volume a ser medido, uma migração tridimensional / invasão de ser avaliada, uma análise mais detalhada de um movimento celular, ou na análise do movimento da célula sob condições in vivo, este protocolo seria não é suficiente e a utilização de metodologia adicional, tal como um ensaio de migração trans-assim, num ensaio de invasão de matrigel 33, microscopia tempo caduco vivo / 34,35 fotografia, etc precisa ser considerado.
O ensaio de motilidade phagokinetic faixa é uma avaliação simples e quantitativa / comparação da capacidade das células para migrar, sem a necessidade de utilização de microscópios caros e software nas análises. Dirige-se a researqueiros que necessitam de uma rápida e fácil, mas de confiança do método, para quantificar a motilidade celular, oferecendo a possibilidade de um ensaio de elevado débito simples.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (AI050677, HD-051998, e GM103433), um Malcolm Feist cardiovascular pesquisa comunhão, e um da American Heart Association comunhão predoctoral (10PRE4200007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Coverslips (15mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| Gelatin 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| Tetrachloroauric Acid Trihydrate | Fisher Chemical | G54-1 | 14.5 mM (a final working solution) |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | BP327-500 | 0.5% (a final working solution) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 3% (a final working solution) |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Sarstedt | 83.1802 | |
| 12-Well Plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Oven Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | The standard laboratory oven will suffice |
| 10 ml Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-Aid Filler/Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 Single-Channel Manual Pipette | Rainin | PR-200 | |
| 200 ml Barrier Tips | CLP | BT200 | |
| ImageJ software | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | License: Public Domain | |
| Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera | Nikon | Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes. | |
| Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications. | |||
References
- Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
- Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
- Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
- Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
- Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
- Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
- Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
- Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, Humana Press. 379-392 (2010).
- Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
- Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
- Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
- Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
- Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
- McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
- Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
- Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
- Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
- Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
- Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
- Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
- Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
- Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
- Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
- Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
- Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).
- Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
- Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
- Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).
