Summary
Biz geliştirdik
Abstract
Plasmodium falciparum, sıtma ölümcül formu etkeni ve insan immün yetmezlik virüsü tip-1 (HIV-1) yılda 1 4 milyon ölümlerin toplam sorumlu olmak, dünyadaki en önemli sağlık sorunları arasındadır. Özellikle gelişmekte olan bölgelerde, Sahra-altı Afrika'da, sıtma ve HIV-1 ile ortak enfeksiyonları sık görülür, ama iki hastalık arasındaki etkileşim içinde onların geniş örtüşme nedeniyle yeterince bilinmemektedir. Epidemiyolojik raporları sıtma enfeksiyonu geçici HIV-1 replikasyonunu artırır ve co-enfekte kişilerde 2,3 HIV-1 viral yükü artırdığını ileri sürmüşlerdir. Bu viremi antimalaryaller tedavisinden sonra birkaç hafta boyunca yüksek kalır çünkü, bu fenomeni hastalığın ilerlemesini ve şanzıman üzerinde bir etkisi olabilir.
Bu gözlemlerin arkasında hücresel immunolojik mekanizmalar güçlükle çalışılmıştır. In vitro çalışmalar investig içinde birkaçHIV-1 sıtma etkisi ating çözünür sıtma antijenlere maruz bağışıklık hücreleri, HIV-1 enfeksiyonu ve reaktivasyonu artırabilir göstermiştir. Ancak bu çalışmalar P. tam hücre ekstreleri kullanılır falciparum şizont sahne parazitler ve periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC), sıtma bileşen (ler) gözlenen etkileri ve ne hedef ana hücreleri 4,5 olduğu için sorumlu olduğu deşifre etmek zorlaşacak. Son çalışmalar bu makrofajların 8 HIV-1 enfeksiyonu azaldığı sıtma pigment hemozoin için olgunlaşmamış monosit türevli dendritik hücreler maruz CD4 + T hücreleri 6,7 HIV-1 aktarabilme yeteneğine arttırdı, ama oldu. Bu karmaşık süreç, sıtma parazit ve farklı ilgili insan birincil hücre popülasyonlarının HIV-1 arasındaki etkileşimin sistematik bir analizini ışık tutacak eleştirel gereklidir.
H etkisini araştırmak için çeşitli tekniklerMikro-organizma fagositozunu ve HIV-1 replikasyon böyle patojenlerin etkisi IV-1 tarif edilmiştir. Burada P. etkilerini araştırmak için bir yöntem sunmak insan birincil monosit kökenli makrofajlar HIV-1 çoğaltma falciparum-enfekte eritrosit. Enfekte makrofajlar tarafından yayımlanan virüs miktarına etkisi ölçülerek belirlenir ise, HIV-1 transkripsiyon / translasyon olayları parazit maruz kalmanın etkisi bir lusiferaz raportör gen Env gen yerini aldığı tek çevrim pseudotyped virüsler kullanılarak izlenir Hücre süpernatanlar ELISA ile p24 HIV-1 kapsid proteini.
Protocol
Not: HIV-1 ve Plasmodium falciparum ile deneyler uygun biyogüvenlik düzeyi laboratuarlarda yapılmalıdır (parazitler için BSL2 ve BSL3 HIV-1 ve ko-enfeksiyon) ve potansiyel enfekte insan kanı kullanırken özel önlem alınmalıdır.
1. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) Arınma (8 ve 9 dayanarak)
- Antikoagülan (heparin, sitrat, asit sitrat, dekstroz ya sitrat fosfat dekstroz) ile muamele sağlıklı donörlerden (500 ml) taze insan kanı ile başlar. Arındırıcı ve tecrit PBMC ve protokol geri kalanı boyunca ne zaman endotoksin ücretsiz reaktifler kullanın.
- % 70 etanol ile tüp dahil olmak üzere kan torbası, dezenfekte, tüpü kesip dikkatli bir T150 balona kan aktarın.
- 50 ml konik tüp (Ficoll oda sıcaklığına ulaştığını emin olun) başına 15 ml Lenfositler Ayırma Orta (Ficoll) 16 tüpleri hazırlayın.Üstüne taze kan dikkatlice tabakası 30 ml.
- 20 30 dakika için 400 xg'de Santrifüj ° off sonları ile C.
- Santrifüj içinde, tüp başına oda sıcaklığında Hank'in dengeli tuz Çözelti (HBSS) 25 ml ile 8 x 50 ml konik bir tüp hazırlanır.
- Dikkatle HBSS (tüp başına havuzu 2 hücre halkalar) içeren 50 ml tüp için arayüzünde bulutlu hücre halkası (PBMC içerir) aktarın. HBSS ile 50 ml'ye birimleri tamamlayın.
- 20 az 15 dakika boyunca 150 xg'de Santrifüj ° molalar C.
- Bulanık hücre halkasının santrifüjleme sırasında, Ficoll adımı, bir 50 ml konik bir tüp doldurmak için havuz plazmadan sarı bir üst katman toplayabilir. ° C'de 30 dakika süre ile 1800 x g'de 10 dakika dönmeye 56 at 50 ml tüp ısıtarak plazmada tamamlayıcı inaktive. Supernatant (aşamadan sonra orta takviyesi olarak kullanılabilir içeren seyreltilmiş otolog plazma) tutun.
- Dikkatle süpernatan ve resuspen kaldırmakd 50 ml tüp başına HBSS ve havuz 2 pelet 25 ml adım 1.7 'den hücre peleti. 20 ° C'de 8 dk boyunca 300 xg'de Spin
- Dikkatle süpernatantı ve bir 50 ml tüp içinde 10 ml HBSS ve havuzdaki peletler tekrar süspansiyon.
- , Bir kısım atın ölüm değerlendirmek için tripan mavi dışlama gerçekleştirmek ve sonra PBMC sayarız.
- HBSS ve 300 x g hızında 10 dakika döndürme ile 50 ml tam hacim. Süpernatant kaldırmak ve (bir 500 ml kan 400-500 x 10 6 PBMC yaklaşık almalıdır) 5x10 6 hücre / ml 'de RPMI 1640 içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
2. Monositler-Türetilmiş Makrofajlar (MDM) Farklılaşma (8 ve 9 dayanarak)
- RPMI 1640 (25 ml / çanak) ile 15 cm yemekleri Tohum yaklaşık 1.25 x 10 8 PBMC.
- Hücreler% 5 CO2 atmosfer ile 37 ° C'de 1-2 saat boyunca izin yapışır.
- Yeni bir balon içerisinde olmayan yapışık hücreleri aktarın ve 15 ml endotoksin içermeyen PBS iki kez (5 plaka yıkayındak, 300 x g). Yapıştırılır hücreler izole monositler vardır.
- Taze izole monositler MDM içine ayırt etmek için izin vermek için,% 5 otolog plazma (adım 1.8) ilave edilmiş RPMI 1640 ortamında, 20 ml ekleyin. Rekombinant insan makrofaj koloni stimüle edici faktör (M-CSF, 25 ng / ml) ve penisilin / streptomisin çözeltisi (PS, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin) eklenir. 2 gün boyunca inkübe, orta değiştirmek ve 37% 5 ° C CO 2 atmosferinde 2-3 ekstra gün inkübe edin.
- Eski orta çıkarın ve endotoksin içermeyen PBS bir kez yıkayın, PBS yavaşça ekleyin ve hemen emdiriniz. Tamamen ayırt MDM ayırmak için, bir% 5 CO 37 ° C'de 15-20 dakika için ~ 7 ml Accutase (Accutase, plastik çanak gelen hücrelerinin ayrılması izin proteaz ve kollajenolitik aktivitesinin bir ticari olarak temin karışımı) ile muamele hücreleri 2 atmosfer, orta zaman hafifçe sallayın.
- (Hücrelerin korunmasına yardımcı olmak için ise her plaka 3-5 ml otolog plazma (Adım 1.8) ekle) kazıma.
- Yavaşça orta 50 ml'lik bir tüp içinde her zaman ve transfer / havuzda hücrelerini kapsayan emin hücreleri kazıyın.
- Mümkün olduğunca çok hücre kurtarmak için endotoksin içermeyen PBS ile plakalar durulayın.
- Süpernatant atmak, 200 xg'de 5 dakika Spin.
- 5 ml MDM kültür ortamı (RPMI 1640% 10 tamamlayıcı-inaktive edilmiş fetal bovin serumu (iFBS), PS, 25 mM HEPES ile desteklenmiş) ve sayım hücreleri (MDM toplam PBMC genellikle 2-8 verim:%) içinde Pastör pipetiyle pelet. Not: MDM bir kısım akım sitometri ile hücre popülasyonu saflık değerlendirmek için bu adımı alınabilecek; genellikle% 99 MDM ekspres CD14 aldı.
- 24-iyi plaka iyi başına MDM kültür ortamı 600 ul Tohumculuk 1x10 5 MDM.
- Enfeksiyonların önce bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir.
3. HIV-1 viral Stoklar Üretim ve kantitasyonu
- HEK293T hücreleri Follo kalsiyum fosfat transfeksiyon kullanarak viral stoklar üretinFortin ve ark kanat protokolü. 10.
- R pHCMV-G + ve 10 ug veya NL4.3 Luc 15 ug - ya NL4.3 Luc + Env 20 ug ile lusiferaz kodlama raportör genini içeren tek bir döngü virüsler, ko-transfekte HEK293T hücreler elde etmek için + Env - R + ve pJRFL env 15 g. + Kontrol glikoprotein eksikliği olan virüsler üretmek için Ar - NL4.3 Luc + Env 30 mikrogram kullanın. Tam replikatif virüsü için NL4.3Bal env 30 ug kullanın. Vektörler pHCMV-G ve pJRFL env sırasıyla, veziküler stomatit virüs zarf glikoprotein (VSV-G) kodlamak ve CXCR5-tropik HIV-1 (NL4.3Bal env farklı) bir. Plazmit ile ilgili ek bilgi 8 elde edilebilir. Plazmidler NIH AIDS Araştırma ve Referans Programı (NIAID, NIH) ile elde edilebilir.
- HIV-1 p24 kapsid proteini 11 için ELISA yöntemi ile tüm viral stokları ölçmekVe kullanmadan önce bunların potansiyel bulaşıcı doğrulayın. Biz TZM-bl göstergesi hücrelerin 12 kullanımı yoluyla virüs stoklarının enfektivite değerlendirmek.
4. Plasmodium falciparum Parazitler Kültür (13 dayanarak)
Parazitlerin 4.1 Genel kültür ve bakım
- P. koruyun % 0.5 (w / v) Albumax II, 25 ug / ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI 1640% 4'lük bir hematokrit (25 mM HEPES ve 25 mM NaHCO 3 ile tamponlanmış) de, insan eritrositleri (O kan grubuna +) içinde falciparum 3D7 asexual aşaması parazitler 37 ve at 370μM Hipoksantin azot içinde% 1 oksijen /% 5 karbon dioksit gazı, bir karışımı içinde ° C.
- Parazitemi kültürünün ince yayma yapma ve% 15 Giemsa solüsyonu ile boyanarak izlenebilir.
- Parazitler bir kontrol olarak kullanmak için her zaman olduğu gibi aynı koşullarda bulaşmamış kırmızı kan hücreleri (uRBC) kültürü çanak tutmak.
Geç dönem parasit elde etmek içines (trofozoit / erken şizont), aşağıdaki gibi parazitler senkronize:
4.2 Parazit senkronizasyon
- Sabah, 300 xg'de, spin 5 dk parazit kültürü hasat ve supernatant atın.
- % 5 (a / h) 37 ° D-sorbitol ve inkübe 5 dakika ile 5 ° C hematokrit in Pastör pipetiyle pelet
- 300 x g hızında 5 dakika çevirin, 30 ml kültür ortamı içinde yüzen, Pastör pipetiyle pelet atmak ve inkübatör geri koyun.
- Yaklaşık 8 saat sonra, tekrar sıkıca senkronize parazitleri almak için 4.2.3 4.2.1 adımları yineleyin. Geç evre parazitler (trofozoit / erken şizont) sonra deney gerçekleştirmek için ertesi sabah hasat edilebilir. Önce arıtma için, yaşam döngüsü aşamasında onaylamak için Giemsa boyama gerçekleştirin.
4.3 Plasmodium falciparum bulaşmış kırmızı kan hücreleri (iRBC) arıtma
- % 70 etanol ve p VarioMacs ayırıcı (stand ve mıknatıs) sterilizebiyolojik başlık altında dantel.
- CS sütunun altına üç yollu Fix.
- Miltenyi özel kesici iğne plastik koruyucusu sonunda kesin ve musluk altına iğne düzeltmek.
- Dikkatli bir mıknatıs içine sütun kilitleyin.
- Yavaş stopcock sol tarafında vidalı kiti-ekteki şırınga ile MDM kültür ortamı 10 ml enjekte edilerek sütundaki tüm hava kabarcıkları çıkarın.
- ~ 20 ml MDM besiyeri ile sütun yıkayın.
- Kültürü plakası ile hasat alyuvar, 10 ml MDM ortamı (300 x g, 5 dakika) ile bir kez yıka, 12 ml MDM kültür ortamında RBC pelletini. Yavaşça sütun eklemek ve (trofozoit veya şizont aşamada parazit içeren enfekte kırmızı kan hücreleri nedeniyle hemozoin kristallerinin varlığı manyetik alan tarafından muhafaza edilecektir) ile süspansiyon akmasına izin ver.
- 20 ml besiyeri ile bir kez yıkayın ve sütun üstüne beyaz disk ulaştığında sıvı akışı durur.
- 12 ml MDM kültür ortamı ile temiz bir steril bir tüp içinde manyetik ve elüt edilmesi iRBC den Sütun çıkarın.
- Smear, bir geri iRBC bir tablet ve Giemsa yaşam döngüsü aşamasında onaylamak için boyama gerçekleştirin.
- Bir haemocytometer (izole RBC% 100 iRBC vardır) kullanılarak geri iRBC sayın.
- Pelet hücreleri (300 xg, 5 dk), süpernatant atın ve 500 ul taze AB + insan serum (opsonisation adım 14) ile hücre tedavisi.
- % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir.
- Istenen konsantrasyonuna iRBC 10 ml MDM kültür ortamına (300 x g, 5 dakika), ve Pastör pipetiyle ile bir kez yıka. Genellikle,% 10 parazitemi 15 cm kültür çanak kabaca ~ 0.5-1x10 8 sıkıca senkronize iRBC verir.
5.. Plasmodium falciparum için MDM Pozlama
- 75:1 MDM: uRBC ya iRBC için MDM ortaya çıkarmak için, hücreler uRBC / iRBC bir oranı elde etmek için MDM kültür ortamı içinde tekrar süspanse edilmesi gerekir. Daha önce deMDM içeren hazırlanmış 24-iyi plakaları, her kuyuya uygun eritrosit süspansiyonu hacmi ekleyin. Üç nüsha halinde tüm deney yapın.
- % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 4 saat süreyle inkübe co-kültürler.
- Endotoksin içermeyen PBS 3 kez 600 ul hücreleri yıkayın, hafifçe PBS ekleyin ve hemen emdiriniz.
- Geriye kalan eritrosit lyse için, 20 sn ve aspirasyon için buz steril su, 200 ul ilave edilerek kuyu yıkanır.
- 600 ul kültür ortamı MDM ekleyin ve bir 5% 2 CO atmosferinde 37 ° C 'de 24 saat inkübe edilir.
6. Bir Tam Replikatif HIV-1 ile MDM Enfeksiyon
- P. etkisini değerlendirmek için MDM HIV-1 çoğaltma falciparum, Şekil 1A, uygun kuyulara NL4.3Bal env virüslerin p24 ve 10 ng (MDM ortam 300 ul içinde) belirtilen şemasına göre, eklemek; kontrolü kuyu sadece orta MDM ekleme .
- Bir 5 içinde 37 ° C'de 2 saat inkübe% 2 atmosfer CO.
- Endotoksin içermeyen PBS 3 kez hücre yıkayın, hafifçe PBS ekleyin ve hemen emdiriniz. De başına taze MDM orta 600 ul ekleyin.
- % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edilir.
- Gün 3, 6, 9 ve 12 hasat daha sonra taze MDM orta 200 ul ekleyerek, her bir 200 ul süpernatan, viral enfeksiyonun başlangıç takiben. Fortin ve ark. 10 takiben, ELISA ile büyük HIV-1 kapsid p24 proteini kantitatif için -20 ° C 'de hasat edilmiş süpernatanlar tutmak.
7. Tek Döngü Virüs Kodlama Lusiferaz ile MDM Enfeksiyon
- R + (- MDM HIV-1 gen ifadesi üzerindeki etkisi parazit belirlemek amacıyla, 10 ng p24 (MDM orta 300 ul içinde) NL4.3 Luc + Env birinin, Şekil 1B özetlenen şemasına göre, ekleme VSV-G), NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env) veya NL4.3 Luc +Env - ilgili kuyularda R + virüsler.
- % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 2 saat inkübe.
- Endotoksin içermeyen PBS 3 kez 600 ul hücreleri yıkayın, hafifçe PBS ekleyin ve hemen emdiriniz. De başına taze MDM orta 600 ul ekleyin.
- % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edilir.
- Orta 72 saat aşağıdaki enfeksiyonu temizlemek ve lizis tamponu 1X (lusiferaz kit ile birlikte) 200 ul ekleyin. Hücreler nazik çalkalama ile oda sıcaklığında lyse edelim. -20 ° C de saklayınız
- Plaka çözülme ve 96-iyi luminometre plakasına lizatı 40 ul aktarmak; lusiferaz substrat 100 ul (lusiferaz kit ile birlikte) ekleyin ve üreticinin talimatlarına bir luminometreye lusiferaz (Ateşböceği lusiferaz) aktivitesini ölçmek.
8. Temsilcisi Sonuçlar
Co-enfeksiyon modeli kullanarak, bu exposur göstermekP. e MDM için falciparum HIV-1 enfeksiyonu onların duyarlılık azalır. Gerçekten de, önemli bir azalma (p <0.05; 2 yönlü ANOVA, günde 12) olarak süpernatant HIV-1 p24 kapsid proteini ile ölçülen viral parçacıkların, sürümünde, parazitler (Şekil 2A) ile ön tedavi MDM görülmektedir. Bu gözlem, bir lusiferaz-raportör gen kodlayan virüsler tarafından enfekte olmuş hücrelerin içinde onaylanır. Eksojen VSV-G veya HIV-1 glikoprotein ya barındıran bu tür virüsleri ile MDM enfeksiyonu P. maruz kalan hücrelerdeki düşük (p <0.05, Student t-testi) daha az lusiferaz üretime yol açar falciparum (Şekil 2B). Bu VSV-G-pseudotyped virüsler bunların JRFLenv muadilleri den çok daha büyük lusiferaz aktivitesi vermiştir dikkati çekmektedir; Bu VSV parçacıkları-G pseudotyped 15 arasında daha büyük verimlilik enfeksiyonu nedeniyle. Parazit fuar MDM etkileri virüsler, her iki tür, bu viral gen eski bazı adımı etkilediğini düşündürmektedir göz önüne alındığındapression (Şekil 2B). Bu kadar hücre canlılığı gözlenen inhibisyon hücre ölüm nedeniyle belli değil, belirten, iRBC (veriler gösterilmemiştir) MDM fuar etkilenmedi söz etmek de önemlidir.
Şekil 1.. Tam replikatif virüs MDM enfeksiyonu için) Levha şeması Mock:. Olmayan hücrelerde. uRBC: Enfekte olmayan kırmızı kan hücreleri maruz kalan hücreler. iRBC: Plasmodium falciparum bulaşmış kırmızı kan hücrelerinin maruz kalan hücreler. Bal:. NL4.3Bal env Bal / uRBC ile enfekte hücreler: Hücre uRBC maruz kalan ve NL4.3Bal env Bal / iRBC ile enfekte:.. MDM enfeksiyon için iRBC ve NL4.3Bal env B ile enfekte maruz kalan hücreleri) Levha şeması ile tek çevrim lusiferaz kodlama virüs Mock:. olmayan hücrelerde. uRBC: Enfekte olmayan kırmızı kan hücreleri maruz kalan hücreler. iRBC: hücreleri Plasmodium falciparum-i maruzkırmızı kan hücreleri nfected. Δenv: NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücreler - R + JRFL:. NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücreler - R + (env JRFL). vsv-g: NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin - R + (vsv-g) Δenv / uRBC:.. hücreleri uRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env-R + Δenv / iRBC ile enfekte: hücreleri iRBC maruz ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte - R + JRFL / uRBC: uRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin - R + (JRFL env.). JRFL / iRBC: iRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin - R + (JRFL env). vsv-g/uRBC: uRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte olmuş hücrelerin - R + (vsv-g) vsv-g/iRBC:. hücreleri iRBC maruz kalan ve NL4.3 Luc + Env ile enfekte - R + (VSV-g).
Şekil 2. . 4 saat MDM) ve yaygın yıkanmış: A MDM HIV-1 viral üretim Plasmodium falciparum ile) Etkisi MDM bir oran 75:1 (uRBC / iRBC az uRBC veya iRBC maruz bırakıldı. Hücreler 2 saat boyunca p24 NL4.3Bal env 10ng ile enfekte edilmiştir. Viral üretimi başlangıç viral enfeksiyon sonrası farklı zaman noktalarında hücre içermeyen yüzer kısım, HIV-1 p24 için ELISA ile takip edildi. . Bir temsilci deney MDM HIV-1 viral transkripsiyon üzerine Plasmodium falciparum B) etkisi gösterilmiştir MDM bir oran 75:1 (uRBC / iRBC az uRBC veya iRBC ile enfekte edildi. MDM). Luc + Env R + (JRFL env) veya NL4.3 - - R +, NL4.3 Luc + Env - Hücreler daha sonra tek çevrim virüs p24 ile 10ng (ya NL4.3 Luc + Env ile enfekte olan R + (vsv- g)). Lusiferaz ifade hücre ilk virüs enfeksiyonunu takiben 72 saat lizatları değerlendirildi. Temsili bir deneyde gösterilmiştir.
Discussion
Biz viral gen ekspresyonu veya monosit kökenli makrofajlar döl virüs üretim ve çoğaltma ya da analiz ederek, HIV-1 viral döngüsü, yani üzerinde sıtma parazit etkisini analiz etmek için burada iki farklı yaklaşım gösterdik. Bu yaklaşım, diğer HIV-1-parazit co-enfeksiyonların 16 için kullanılmıştır. Ancak, bu yeni veriler sıtma, HIV-1 co-enfeksiyonların soruşturma ileri bir adımdır. . Nitekim, Diou ark 8 HIV-1 çoğaltma hemozoin etkisi, canlı değil parazitler, okudu; bizim sonuçlarımız ile anlaşarak, onlar MDMs hemozoin MDM viral üretimini önlemek için tek başına yeterli olduğu gözlendi, değil.
Açıklanan deney düzeni kullanarak, gözlenen P. falciparum makrofajlarda HIV-1 replikatif döngüsü net bir zararlı etki gösterir: viral üretimin önemli bir inhibisyon makrofajlar parazitleri için önceden maruz görülmektedir (Figüre 2A) ve viral transkripsiyon üzerine parazit belirli bir etkisi Şekil 2B 'de gösterilmiştir. Ancak, viral giriş veya füzyon üzerinde parazit Ek etkileri (decapsidation), ya da protein sentezi veya viral partikül montaj ve tomurcuklanma gibi post-entegrasyon mekanizmalarının üzerinde terk edemez. Dahası, parazit virüs ile de aynı zamanda ya da aşağıdaki MDM enfeksiyon ya da ilave edildi halinde HIV-1 replikasyon üzerinde farklı bir etki elde edilebilir olasıdır.
Bizim in vitro ko-enfeksiyon modelinde HIV-1 / P. detaylı incelemeler gerçekleştirmek için güçlü bir araç sağlar konak hücre içinde falciparum etkileşimleri. Örneğin, hedef ve viral retrotranscription ve konak hücrenin genomu için viral genomun entegrasyon spesifik basamakları ölçmek için niceliksel gerçek zaman PCR, diğer teknikler ile, bu deney düzeni kombinasyonu oldukça mümkün olan ve daha da insi vermelidirco-enfeksiyonları dahil mekanizmalarına ghts. Ayrıca, özel testler ile viral replikasyon üzerindeki etkisini analiz etmek için bu temel protokolü uygulanabilir viral döngüsü (viral füzyon, decapsidation, giriş kantitatif) erken adımları değerlendirmek. Hatta çok standart HIV-1 revers transkriptaz kantitatif testler tasavvur HIV-1 p24 için ELISA yerini alabilir trityum etiketli nükleotidleri kullanarak: Bu değişiklikler bu protokol, HIV-1 kantitatif ve algılama ile ilgili nasıl esnek göstermektedir. MDM ek olarak, bizim sistemin diğer hücre türleri, monositler ve dendritik hücreler gibi HIV-1-sıtma etkileşimleri, ilgili adapte olmasını bekliyoruz. MDM yapışmış olan hücrelerin olması, herhangi bir makrofajlar ortadan kaldırmadan, içinde alınmadığı veya MDM ile temas halinde olduğunu iRBC dışarı yıkama kolay izin veren, onların manipülasyon kolaylaştırır. Böyle bir avantaj se komplike, süspansiyon kültürlenmiştir dendritik hücreler ve monositler için geçerli değildirBu tür hücre ve şu anda bu sorunu ele alıyor ile uRBC ve ücretsiz iRBC elde edilmesine. Sistemimizde, aynı zamanda bu gibi co-kültürü deneylerinde CD4-pozitif T-hücreleri gibi diğer bağışıklık hücreleri, HIV-1 viral döngüsünde Plasmodium-maruz monosit-türetilmiş hücrelerden etkiler gibi daha karmaşık etkileşimler incelemek için yararlı olabilir. Son olarak, iletişim kuralı P. etkisini bakarak deneyler için uygun olabilecek HIV-1 ile enfekte bireyler için PBMC HIV-1 reaktivasyonu üzerine falciparum iRBCs.
Etik beyanı
İnsan PBMC Merkezi Hospitalier de l'Université Laval Araştırma Merkezi Biyoetik Komitesi kurallarına uygun olarak, sağlıklı donörlerin kan elde edildi. Bir yazılı izni tüm kan vericilerden elde edildi.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Catalyst Co-enfeksiyonlar ve Co-morbiditeler hibe yoluyla Sağlık Araştırması Kanada Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. İnsan eritrosit Merkezi Hospitalier de l'Université Laval kan bankası tarafından temin edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Multicell | 350-000-CL | |
| PBS-endotoxin free | Sigma | D8662 | |
| FBS | Wisent | 080-150 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
| Accutase | eBiosciences | 00-4555-56 | |
| Albumax II | Gibco | 11021-037 | Dissolved in RPMI 1640, filter-sterilized |
| Lymphocyte separation medium | Multicell | 305-010-CL | |
| White luminometer plates | Promega | Z3291 | |
| CS Macs separation columms | Miltenyi Biotech | 130-041-305 | |
| VarioMacs separator | Miltenyi Biotech | 130-090-282 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Wisent | 450-201-EL | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.1830 | |
| 24-Well Cell Culture Plates | BD Falcon | 353047 | |
| 150 x 20 mm culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | |
| M-CSF | Genscript | Z02001 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Human serum AB+ | Valley Biomedical | HP1022 | |
| HBSS | Wisent | 311-505-CL | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Luciferase Assay System | Promega | E1500 | |
| Human red blood cells | Obtained purified from CHUL blood bank. |
References
- WHO. World Malaria Report. , (2005).
- Kublin, J. G., Patnaik, P., Jere, C. S. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365, 233-240 (2005).
- Cuadros, D. F., Branscum, A. J., Crowley, P. H. HIV-malaria co-infection: effects of malaria on the prevalence of HIV in East sub-Saharan Africa. Int. J. Epidemiol. 40, 931-939 (2011).
- Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. J. Infect. Dis. 177, 437-445 (1998).
- Froebel, K., Howard, W., Schafer, J. R. Activation by malaria antigens renders mononuclear cells susceptible to HIV infection and re-activates replication of endogenous HIV in cells from HIV-infected adults. Parasite Immunol. 26, 213-217 (2004).
- Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. Dendritic cells derived from hemozoin-loaded monocytes display a partial maturation phenotype that promotes HIV-1 trans-infection of CD4+ T cells and virus replication. J. Immunol. 184, 2899-2907 (2010).
- Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. Malaria hemozoin modulates susceptibility of immature monocyte-derived dendritic cells to HIV-1 infection by inducing a mature-like phenotype. Cell Microbiol. 12, 615-625 (2010).
- Diou, J., Gauthier, S., Tardif, M. R. Ingestion of the malaria pigment hemozoin renders human macrophages less permissive to HIV-1 infection. Virology. 395, 56-66 (2009).
- Davies, J. Q., Gordon, S. Isolation and culture of human macrophages. Methods Mol. Biol. 290, 105-116 (2005).
- Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity. J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).
- Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J. Virol. 76, 1004-1014 (2002).
- Wei, X., Decker, J. M., Liu, H. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
- Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193, 673-675 (1976).
- Turrini, F., Ginsburg, H., Bussolino, F., Pescarmona, G. P., Serra, M. V., Arese, P. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage. Blood. 80, 801-808 (1992).
- Akkina, R. K., Walton, R. M., Chen, M. L., Li, Q. X., Planelles, V., Chen, I. S. High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G. J. Virol. 70, 2581-2585 (1996).
- Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network. Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).
