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Immunology and Infection

एक Published: August 15, 2012 doi: 10.3791/4166
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Infectious Disease Research Center, CHUL (CHUQ), Quebec City, Quebec, Canada

Summary

हम एक विकसित किया है

Protocol

नोट: एचआईवी -1 और प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम के साथ प्रयोग उचित जैव सुरक्षा स्तर प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन किया जाना चाहिए (परजीवी के लिए BSL2 है, और BSL3 एचआईवी -1 के लिए और सह संक्रमण) और विशेष एहतियात जब संभावित संक्रमित मानव रक्त का उपयोग कर लिया जाना चाहिए.

1. परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) शोधन (8 और 9 के आधार पर)

  1. स्वस्थ (500 मिलीलीटर) दाताओं anticoagulants (हेपरिन, साइट्रेट, एसिड साइट्रेट द्रक्षौज या साइट्रेट फास्फेट द्रक्षौज) के साथ इलाज से ताजा मानव रक्त के साथ शुरू करो. Endotoxin मुक्त अभिकर्मकों का उपयोग करें जब सफ़ाई और अलग PBMC के और प्रोटोकॉल बाकी भर.
  2. 70% इथेनॉल के साथ रक्त बैग, ट्यूब सहित, कीटाणुरहित करना, ट्यूब कटौती और ध्यान से एक T150 फ्लास्क में रक्त हस्तांतरण.
  3. 15 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब (सुनिश्चित करें कि Ficoll कमरे के तापमान तक पहुँच गया है) प्रति मिलीलीटर लिम्फोसाइटों पृथक्करण मध्यम (Ficoll) के साथ 16 ट्यूबों तैयार.ध्यान से परत शीर्ष पर ताजा रक्त की 30 मिलीलीटर.
  4. अपकेंद्रित्र 30 मिनट के लिए 400 XG पर 20 ° सी बंद टूट जाता है के साथ.
  5. Centrifugation के दौरान, कमरे के तापमान हांक ट्यूब प्रति संतुलित नमक समाधान (HbSS) के 25 मिलीग्राम के साथ 8 x 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूबों तैयार.
  6. ध्यान से 50 मिलीलीटर HbSS (पूल 2 ट्यूब प्रति सेल के छल्ले) युक्त ट्यूब इंटरफ़ेस में बादल सेल अंगूठी (PBMC शामिल हैं) को हस्तांतरण. संस्करणों पूरा HbSS 50 मिलीलीटर के साथ.
  7. अपकेंद्रित्र 15 मिनट के लिए 150 XG पर 20 ° पर टूट के साथ सी.
  8. बादल सेल अंगूठी की centrifugation के दौरान, Ficoll कदम, प्लाज्मा पूल करने के लिए एक 50 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब भरने से पीले रंग की ऊपरी परत जमा. 56 में 50 मिलीलीटर ट्यूब हीटिंग डिग्री सेल्सियस और 30 मिनट के लिए 10 मिनट १,८०० एक्स जी स्पिन प्लाज्मा में पूरक निष्क्रिय. सतह पर तैरनेवाला (शामिल पतला ऑटोलॉगस प्लाज्मा है कि बाद के चरणों में मध्यम पूरक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है) रखें.
  9. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला और resuspen निकालेंHbSS और पूल 50 मिलीलीटर ट्यूब के प्रति 2 गुटिकाओं के 25 मिलीलीटर में 1.7 कदम से सेल गोली. 20 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 300 XG पर स्पिन
  10. सतह पर तैरनेवाला ध्यान से निकालें और 10 मिली और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में HbSS पूल में छर्रों resuspend.
  11. एक नि: शेष भाजक लो, मृत्यु दर का आकलन trypan नीले बहिष्कार करने के लिए और फिर PBMC गिनती.
  12. HbSS और स्पिन x 300 ग्राम में 10 मिनट के साथ 50 मिलीलीटर की पूरी मात्रा. निकालें सतह पर तैरनेवाला और 1640 RPMI में कोशिकाओं 5x10 6 कोशिकाओं / एमएल (400-500 एक्स 10 6 PBMC के आसपास रक्त के 500 मिलीलीटर से प्राप्त करना चाहिए) resuspend के.

2. Monocytes व्युत्पन्न मैक्रोफेज भेदभाव (एमडीएम) (8 और 9 के आधार पर)

  1. बीज 1.25 लगभग x 10 1640 RPMI (25 मिलीलीटर पकवान /) के साथ 15 सेमी बर्तन में 8 PBMC.
  2. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के वातावरण के साथ पालन.
  3. एक नई कुप्पी में गैर पालन कोशिकाओं के स्थानांतरण और 15 मिलीलीटर अन्तर्जीवविष के - मुक्त पीबीएस दो बार (5 के साथ प्लेट धोनेमिनट, 300 XG). पालन ​​कोशिकाओं पृथक monocytes हैं.
  4. हौसले से अलग monocytes को मध्याह्न भोजन में अंतर करने की अनुमति, RPMI 1640 मध्यम 5% ऑटोलॉगस प्लाज्मा (1.8 कदम से) के साथ पूरक के 20 मिलीलीटर जोड़ें. पुनः संयोजक मानव बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर (एम CSF, 25 एनजी / एमएल) और पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (पी एस, 100 यू / एमएल पेनिसिलीन, 100 μg / स्ट्रेप्टोमाइसिन मिलीलीटर) जोड़ें. 2 दिनों के लिए सेते हैं, मध्यम बदलने के लिए और 37 ° 5% में सी सीओ 2 के वातावरण में 2-3 अतिरिक्त दिन सेते हैं.
  5. पुराने मध्यम निकालें और अन्तर्जीवविष मुक्त पीबीएस एक बार से धो, पीबीएस धीरे जोड़ने और तुरंत महाप्राण (व्यंजन). पूरी तरह से विभेदित मध्याह्न भोजन को अलग करने के लिए, 37 ° C पर एक 5% सीओ में 15-20 मिनट के लिए ~ 7 मिलीग्राम Accutase (Accutase, proteases और collagenolytic गतिविधि है कि प्लास्टिक पकवान से कोशिकाओं की टुकड़ी की अनुमति के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिश्रण) के साथ कोशिकाओं का इलाज 2 वातावरण, मध्य - समय पर धीरे रॉक.
  6. एक थाली में 3-5 मिलीग्राम ऑटोलॉगस प्लाज्मा (1.8 कदम से) (मदद करने के लिए कोशिकाओं की रक्षा करते हुए) स्क्रैप.
  7. धीरे यकीन है कि मध्यम और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में हस्तांतरण / पूल बार में कोशिकाओं को शामिल किया गया है बनाने कोशिकाओं परिमार्जन.
  8. अन्तर्जीवविष मुक्त पीबीएस के साथ प्लेट कुल्ला करने के लिए संभव के रूप में कई कोशिकाओं के रूप में ठीक है.
  9. 5 मिनट 200 XG पर स्पिन, सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  10. 5 मिलीलीटर एमडीएम संस्कृति मध्यम (RPMI 1640 में 10% पूरक - निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय (iFBS) के सीरम, पी एस, 25 मिमी HEPES के साथ पूरक) और गिनती कोशिकाओं (एमडीएम कुल PBMC आमतौर पर 2-8% उपज) में resuspend गोली. नोट: इस चरण में मध्याह्न भोजन का एक नि: शेष भाजक लिया जा सकता है प्रवाह cytometry द्वारा सेल जनसंख्या शुद्धता का आकलन आमतौर पर 99% प्राप्त एमडीएम CD14 व्यक्त.
  11. बीज 1x10 प्रति 24 अच्छी तरह से प्लेट में मध्याह्न भोजन संस्कृति के माध्यम के 600 μl में 5 मध्याह्न भोजन.
  12. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संक्रमण से पहले एक 5% सीओ 2 माहौल में सेते हैं.

3. उत्पादन और एचआईवी -1 वायरल स्टॉक की Quantitation

  1. वायरल follo के HEK293T कोशिकाओं में कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक का उपयोग स्टॉक उत्पादनविंग Fortin एट अल के प्रोटोकॉल 10.
  2. आर + और ​​pHCMV जी के 10 μg या NL4.3 ल्यूक के 15 μg क्रम में ल्यूक NL4.3 + लि या तो 20 μg साथ है एक चक्र एन्कोडिंग संवाददाता luciferase जीन युक्त वायरस, सह - transfect HEK293T कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए + लि - + आर और pJRFL वातावरण की 15 μg. ल्यूक NL4.3 + लि के 30 μg का प्रयोग करें + आर नियंत्रण ग्लाइकोप्रोटीन की कमी वायरस उत्पन्न करने के लिए. पूरी तरह से replicative वायरस के लिए, NL4.3Bal वातावरण के 30 μg का उपयोग करें. pHCMV जी और pJRFL वातावरण वैक्टर vesicular stomatitis वायरस के लिफाफे glycoproteins सांकेतिक शब्दों में बदलना (VSV - जी) और एक CXCR5 - रेखा एचआईवी -1 (NL4.3Bal वातावरण से भिन्न), क्रमशः की. प्लास्मिड पर अतिरिक्त जानकारी के 8 से प्राप्त किया जा सकता है. प्लास्मिड NIH एड्स अनुसंधान और संदर्भ प्रोग्राम (NIAID, एनआईएच) के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है.
  3. P24 एचआईवी -1 capsid प्रोटीन 11 के लिए सभी वायरल एलिसा का उपयोग स्टॉक यों, और पहले उनके संक्रामक क्षमता को सत्यापित उपयोग करने के लिए. हम TZM - बीएल सूचक 12 कोशिकाओं के उपयोग के माध्यम से हमारे वायरस शेयरों की संक्रामकता का आकलन करें.

4. परजीवी प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम की संस्कृति (13)

4.1 जनरल और परजीवी की संस्कृति और रखरखाव

  1. पी. बनाए रखने के 1640 RPMI में एक 4% हेमाटोक्रिट (25 मिमी HEPES और 25 मिमी 3 NaHCO के साथ बफर) के साथ 0.5% (/ डब्ल्यू वी) Albumax द्वितीय, 25 / μg मिलीलीटर Gentamicin पूरक पर मानव एरिथ्रोसाइट्स (रक्त समूह ओ +) में फाल्सीपेरम 3D7 अलैंगिक चरण परजीवी और 37 में 370μM Hypoxanthine ° सी में 1% / 5% कार्बन डाइऑक्साइड नाइट्रोजन में ऑक्सीजन गैस मिश्रण.
  2. पेरासाइटिमिया संस्कृति की एक पतली धब्बा बनाने और एक 15% Giemsa समाधान के साथ धुंधला द्वारा नजर रखी जा सकती है.
  3. हमेशा एक uninfected लाल रक्त (uRBC) उसी स्थिति में संस्कृति पकवान कोशिकाओं को बनाए रखने के रूप में परजीवी एक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए.
    देर चरण parasit प्राप्त करनेतों (ट्रोफोजोइट्स / जल्दी schizonts), के रूप में परजीवी सिंक्रनाइज़:

4.2 परजीवी तुल्यकालन

  1. सुबह में, परजीवी संस्कृति फसल, 300 XG पर स्पिन 5 मिनट और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  2. Resuspend 5 (w / v)% डी Sorbitol सेते हैं और 37 डिग्री सेल्सियस से कम 5 मिनट के साथ 5 पैक सेल मात्रा में गोली
  3. स्पिन x 300 जी में 5 मिनट, 30 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम में सतह पर तैरनेवाला, resuspend गोली त्यागें और इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया.
  4. लगभग 8 घंटे बाद, दोहराने 4.2.3 4.2.1 कदम क्रम में कस सिंक्रनाइज़ परजीवी के प्राप्त है. देर से चरण परजीवी (/ ट्रोफोजोइट्स जल्दी schizonts) के तो निम्नलिखित सुबह काटा जा सकता है प्रयोग प्रदर्शन. पहले शुद्धि, Giemsa धुंधला प्रदर्शन करने के लिए जीवन चक्र मंच की पुष्टि.

4.3 प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम से संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं (iRBC) शुद्धि

  1. 70% इथेनॉल और पी के साथ VarioMacs (स्टैंड और चुंबक) विभाजक जीवाणुरहितयह जैविक हुड के अंतर्गत फीता.
  2. सीएस स्तंभ नीचे करने के लिए तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी को ठीक करें.
  3. Miltenyi विशेष कटर के साथ सुई प्लास्टिक रक्षक के अंत में कटौती और पानी निकलने की टोंटी नीचे सुई को ठीक.
  4. चुंबक में स्तंभ ध्यान से लॉक करें.
  5. धीरे किट संलग्न पानी निकलने की टोंटी के बाईं ओर पर दबाव डाला सिरिंज के साथ मध्याह्न भोजन संस्कृति के माध्यम के 10 मिलीग्राम इंजेक्शन लगाने के द्वारा स्तंभ में सभी हवाई बुलबुले निकालें.
  6. स्तंभ ~ 20 मिलीलीटर मध्याह्न भोजन संस्कृति के माध्यम से धो लें.
  7. संस्कृति की थाली से फसल आरबीसी, 10 मिलीलीटर एमडीएम मध्यम (300 XG, 5 मिनट) के साथ एक बार धोने और 12 मिलीलीटर मध्याह्न भोजन संस्कृति के माध्यम में आरबीसी गोली resuspend. धीरे धीरे कॉलम को जोड़ने और के माध्यम से निलंबन का प्रवाह करते हैं (केवल संक्रमित लाल रक्त trophozoite या schizont चरण में परजीवी युक्त कोशिकाओं hemozoin क्रिस्टल की उपस्थिति के कारण चुंबकीय क्षेत्र द्वारा बनाए रखा जाएगा).
  8. 20 मिलीलीटर मध्यम के साथ एक बार धो और तरल प्रवाह को रोकने जब यह स्तंभ के शीर्ष पर सफेद डिस्क तक पहुँचता है.
  9. और 12 मिलीलीटर एमडीएम संस्कृति मध्यम के साथ एक साफ बाँझ ट्यूब elute iRBC में चुंबक से स्तंभ निकालें.
  10. स्मियर बरामद iRBC की एक नि: शेष भाजक और Giemsa जीवन चक्र मंच की पुष्टि धुंधला प्रदर्शन.
  11. गिनती बरामद iRBC एक रुधिरकोशिकामापी (पृथक आरबीसी 100% iRBC) का उपयोग कर.
  12. गोली कोशिकाओं (300 XG, 5 मिनट), सतह पर तैरनेवाला त्यागने और 500 μl ताजा + अटल बिहारी मानव सीरम (opsonisation 14 कदम) के साथ कोशिकाओं का इलाज.
  13. एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  14. 10 मिलीलीटर एमडीएम संस्कृति मध्यम (x 300 ग्राम, 5 मिनट), और resuspend वांछित एकाग्रता iRBC के साथ एक बार धो लें. आमतौर पर, लगभग 10% पेरासाइटिमिया 15 सेमी संस्कृति पकवान ~ 0.5-1x10 8 कसकर सिंक्रनाइज़ iRBC देता है.

5. एमडीएम की प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम को एक्सपोजर

  1. मध्याह्न भोजन uRBC या iRBC बेनकाब करने के लिए, कोशिकाओं एमडीएम संस्कृति माध्यम में resuspended किया जाना चाहिए क्रम में uRBC / iRBC का अनुपात प्राप्त: 75:1 का एमडीएम. पहले मेंतैयार 24 अच्छी तरह से मध्याह्न भोजन युक्त प्लेट, एक अच्छी तरह से उपयुक्त आरबीसी निलंबन मात्रा में जोड़ें. तीन प्रतियों में सभी प्रयोग करते हैं.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 4 घंटे के लिए सह संस्कृतियों सेते हैं.
  3. अन्तर्जीवविष - मुक्त पीबीएस 3 बार 600 μl के साथ कोशिकाओं धो, Pbs धीरे जोड़ सकते हैं और तुरंत महाप्राण (व्यंजन).
  4. शेष आरबीसी lyse करने के लिए, 20 सेकंड और महाप्राण (व्यंजन) के लिए बहुत ठंडा बाँझ पानी के 200 μl जोड़कर कुओं को धो लो.
  5. 600 μl मध्याह्न भोजन संस्कृति के माध्यम जोड़ें और 37 ° C पर एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 24 घंटे सेते हैं.

6. मध्याह्न भोजन की एक पूरी तरह से एचआईवी -1 Replicative साथ संक्रमण

  1. पी. के क्रम में प्रभाव का आकलन करने के लिए मध्याह्न भोजन में एचआईवी -1 प्रतिकृति पर फाल्सीपेरम, चित्रा 1 ए, p24 के 10 एनजी उपयुक्त कुओं में NL4.3Bal वायरस वातावरण (एमडीएम मीडिया के 300 μl में) में उल्लिखित योजना के अनुसार, जोड़ने, केवल नियंत्रण कुओं में मध्याह्न भोजन मध्यम जोड़ने .
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5 में 2 घंटा सेते हैं% 2 वातावरण सीओ.
  3. अन्तर्जीवविष - मुक्त पीबीएस 3 बार के साथ कोशिकाओं धो, Pbs धीरे जोड़ सकते हैं और तुरंत महाप्राण (व्यंजन). 600 प्रति ताजा मध्याह्न भोजन में अच्छी तरह से मध्यम की μl जोड़ें.
  4. 37 ° C पर एक 5% सीओ 2 के वातावरण में सेते हैं.
  5. 3 दिन, 6 बजे, 9 और 12 वायरल संक्रमण की शुरुआत के बाद, फसल प्रत्येक सतह पर तैरनेवाला के 200 μl, ताजा मध्याह्न भोजन मध्यम के 200 μl उसके बाद जोड़ने. प्रमुख एचआईवी 1 capsid p24 प्रोटीन की एलिसा द्वारा quantitation Fortin एट अल. 10 के बाद के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर काटा supernatants रखें.

7. मध्याह्न भोजन की एक साइकिल वायरस एन्कोडिंग luciferase साथ संक्रमण

  1. + आर (क्रम में मध्याह्न भोजन में एचआईवी -1 जीन अभिव्यक्ति पर परजीवी के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, चित्रा 1 बी में उल्लिखित, 10 एनजी (एमडीएम माध्यम के 300 μl में) या तो NL4.3 ल्यूक + लि p24 योजना के अनुसार जोड़ने, VSV-G), NL4.3 ल्यूक + लि आर + (JRFL) वातावरण या NL4.3 के ल्यूक +पर्यावरण - आर इसी कुओं में + वायरस.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 2 घंटा सेते हैं.
  3. अन्तर्जीवविष - मुक्त पीबीएस 3 बार 600 μl के साथ कोशिकाओं धो, Pbs धीरे जोड़ सकते हैं और तुरंत महाप्राण (व्यंजन). 600 प्रति ताजा मध्याह्न भोजन में अच्छी तरह से मध्यम की μl जोड़ें.
  4. 37 ° C पर एक 5% सीओ 2 के वातावरण में सेते हैं.
  5. मध्यम 72 घंटा निम्नलिखित संक्रमण निकालें और lysis बफर 1X luciferase परख किट के साथ आपूर्ति की 200 μl जोड़ें. कोशिकाओं कोमल झटकों के साथ कमरे के तापमान पर lyse. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  6. पिघलना प्लेट और एक luminometer 96 में अच्छी तरह से थाली lysate की 40 μl हस्तांतरण, luciferase सब्सट्रेट 100 μl (luciferase परख किट के साथ आपूर्ति) जोड़ने और निर्माता के निर्देशों का पालन luminometer में luciferase गतिविधि (जुगनू luciferase) को मापने.

8. प्रतिनिधि परिणाम

हमारे सह संक्रमण मॉडल का उपयोग करना, हम कि exposur दिखापी. की ई मध्याह्न भोजन के लिए फाल्सीपेरम एचआईवी -1 संक्रमण के लिए उनकी संवेदनशीलता कम हो जाती है. दरअसल, एक महत्वपूर्ण कमी (पी <0.05, 2 तरह एनोवा, दिन 12) वायरल कणों के रूप में एचआईवी -1 से सतह पर तैरनेवाला में p24 प्रोटीन capsid द्वारा मापा के रिलीज में, परजीवी (चित्रा 2A) के साथ pretreated मध्याह्न भोजन में मनाया जाता है. इस अवलोकन एन्कोडिंग luciferase - रिपोर्टर जीन वायरस से संक्रमित कोशिकाओं में पुष्टि की है. ऐसे वायरस या तो बहिर्जात VSV जी या एचआईवी -1 glycoproteins को शरण देने के साथ मध्याह्न भोजन संक्रमण काफी (<0.05 पी, छात्र के टी - परीक्षण) पी. उजागर करने के लिए कोशिकाओं में कम luciferase उत्पादन की ओर जाता है फाल्सीपेरम (चित्र 2B). यह उल्लेखनीय है कि VSV जी pseudotyped वायरस उनके JRFLenv समकक्षों की तुलना में बहुत अधिक luciferase गतिविधि मिले, यह अधिक से अधिक VSV जी pseudotyped 15 कणों के संक्रमण की दक्षता के कारण है. यह देखते हुए कि परजीवी प्रदर्शनी एमडीएम प्रभावों के लिए वायरस के दोनों प्रकार, यह पता चलता है कि यह वायरल जीन पूर्व में कुछ कदम को प्रभावित करती हैअभिव्यक्ति (चित्र 2B). यह भी उल्लेख है कि सेल व्यवहार्यता को एमडीएम प्रदर्शनी iRBC (नहीं दिखाया डेटा) प्रभावित नहीं किया गया था, यह दर्शाता है कि मनाया निषेध विशिष्ट और कोशिका मृत्यु दर के कारण नहीं है महत्वपूर्ण है.

चित्रा 1
आकृति 1. ए) मध्याह्न भोजन संक्रमण के लिए एक पूरी तरह से replicative वायरस के साथ प्लेट योजना नकली: असंक्रमित कोशिकाओं. uRBC: को असंक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं को उजागर कोशिकाओं. iRBC: प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम से संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं के संपर्क में कोशिकाओं. बाल:. NL4.3Bal वातावरण बाल / uRBC के साथ संक्रमित कोशिकाओं: कोशिकाओं uRBC से अवगत कराया और NL4.3Bal वातावरण बाल / iRBC के साथ संक्रमित: मध्याह्न भोजन संक्रमण के लिए प्लेट योजना से अवगत कराया. IRBC और NL4.3Bal वातावरण बी के साथ संक्रमित कोशिकाओं) के साथ एकल चक्र luciferase एन्कोडिंग वायरस नकली असंक्रमित कोशिकाओं. uRBC: को असंक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं को उजागर कोशिकाओं. iRBC: कोशिकाओं प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम मैं से अवगत करायालाल रक्त कोशिकाओं nfected. Δenv: ल्यूक NL4.3 + पर्यावरण से संक्रमित कोशिकाओं + आर JRFL NL4.3 ल्यूक + लि के साथ संक्रमित कोशिकाओं + आर (JRFL वातावरण). VSV जी: ल्यूक NL4.3 + लि के साथ संक्रमित कोशिकाओं आर + (VSV जी) Δenv / uRBC: कोशिकाओं uRBC को उजागर और NL4.3 ल्यूक लि आर + Δenv / iRBC से संक्रमित कोशिकाओं iRBC से अवगत कराया और ल्यूक NL4.3 + पर्यावरण से संक्रमित + आर JRFL / uRBC: uRBC के लिए संपर्क और ल्यूक NL4.3 + लि के साथ संक्रमित कोशिकाओं + आर (JRFL वातावरण). है. / JRFL iRBC: iRBC के लिए संपर्क और ल्यूक NL4.3 + लि के साथ संक्रमित कोशिकाओं आर + (JRFL के वातावरण). vsv-g/uRBC: uRBC के लिए संपर्क और ल्यूक NL4.3 + लि के साथ संक्रमित कोशिकाओं - आर (VSV जी) + vsv-g/iRBC: कोशिकाओं iRBC से अवगत कराया और ल्यूक NL4.3 + लि के साथ संक्रमित आर + (VSV - छ).

चित्रा 2 चित्रा 2. मध्याह्न भोजन में एचआईवी -1 वायरल उत्पादन पर) प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम के प्रभाव एमडीएम अनुपात 75:1 (uRBC iRBC / से uRBC या iRBC के लिए खुल गए थे: एमडीएम) और 4 घंटे के लिए बड़े पैमाने पर धोया. कोशिकाओं 10ng NL4.3Bal वातावरण 2 घंटे के लिए p24 वायरल उत्पादन से संक्रमित थे. एचआईवी -1 प्रारंभिक वायरल संक्रमण के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला में p24 के लिए एलिसा द्वारा निगरानी की. एक प्रतिनिधि प्रयोग बी) मध्याह्न भोजन में एचआईवी -1 वायरल प्रतिलेखन पर प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम के प्रभाव दिखाया गया है मध्याह्न भोजन अनुपात 75:1 (uRBC iRBC / में uRBC या iRBC से संक्रमित:. एमडीएम). + आर, NL4.3 ल्यूक लि + - + आर (JRFL वातावरण) या NL4.3 ल्यूक लि + कोशिकाओं को फिर से संक्रमित थे (या तो NL4.3 ल्यूक + लि 10ng एकल चक्र वायरस के p24 के आर (VSV - छ)). Luciferase अभिव्यक्ति सेल प्रारंभिक वायरस के संक्रमण के बाद 72 घंटा lysates में मूल्यांकन किया गया था. एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाया गया है.

Discussion

हम यहाँ दो अलग अलग दृष्टिकोण सचित्र है या तो वायरल जीन की अभिव्यक्ति या संतान वायरस और monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज में उत्पादन प्रतिकृति का विश्लेषण करके एचआईवी -1 वायरल चक्र, अर्थात् पर मलेरिया परजीवी का प्रभाव का विश्लेषण. इसी तरह के दृष्टिकोण को अन्य एचआईवी-1-परजीवी 16 सह संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, इन नए आंकड़ों के सह मलेरिया संक्रमण एचआईवी -1 की जांच में एक कदम आगे हैं. दरअसल, Diou एट अल 8 hemozoin का प्रभाव, एचआईवी -1 प्रतिकृति पर नहीं रहते परजीवी, अध्ययन, हमारे परिणामों के साथ समझौते में, वे मनाया कि hemozoin के ही मध्याह्न भोजन के द्वारा वायरल उत्पादन रोकना पर्याप्त था, और नहीं दोपहर भोजन योजना.

वर्णित प्रयोगात्मक लेआउट का उपयोग करना, हम ने कहा कि पी. फाल्सीपेरम मैक्रोफेज में एक स्पष्ट एचआईवी -1 replicative चक्र पर हानिकारक प्रभाव डाल रही है: वायरल उत्पादन का एक महत्वपूर्ण निषेध परजीवी पूर्व उजागर मैक्रोफेज में मनाया जाता है (figur2A ई) और वायरल प्रतिलेखन पर परजीवी की एक विशिष्ट प्रभाव चित्रा 2B में सचित्र है. हालांकि, हम वायरल प्रविष्टि या संलयन पर किसी भी परजीवी की अतिरिक्त प्रभाव, (decapsidation), या के बाद एकीकरण तंत्र, जैसे प्रोटीन संश्लेषण या वायरल कण विधानसभा के और नवोदित पर नहीं छोड़ सकते हैं. इसके अलावा, यह संभव है कि एचआईवी -1 प्रतिकृति पर एक अलग प्रभाव अगर परजीवी या तो एक ही है या वायरस के साथ निम्न मध्याह्न भोजन संक्रमण समय में जोड़ा गया था प्राप्त किया जाएगा.

हमारे इन विट्रो मॉडल सह संक्रमण एचआईवी -1 / पी. की विस्तृत जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है मेजबान सेल में फाल्सीपेरम बातचीत. उदाहरण के लिए, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर, जो लक्ष्य और वायरल retrotranscription और वायरल जीनोम मेजबान सेल जीनोम के लिए एकीकरण में विशिष्ट कदम यों कर सकते हैं जैसे अन्य तकनीकों के साथ इस प्रयोगात्मक लेआउट के संयोजन काफी संभव है और आगे insi उपज चाहिएसह - संक्रमण में शामिल तंत्र में ghts. इसके अलावा, विशिष्ट assays वायरल चक्र (वायरल संलयन, decapsidation,, प्रविष्टि quantitation) के प्रारंभिक चरणों का मूल्यांकन करने के लिए इस बुनियादी प्रोटोकॉल को लागू किया जा सकता है आगे वायरल प्रतिकृति पर प्रभाव का विश्लेषण. इन संशोधनों दिखा लचीला कैसे इस प्रोटोकॉल एचआईवी -1 quantitation और पहचान से संबंधित है: वास्तव में, यहां तक ​​कि मानक एचआईवी -1 रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस quantitation assays ट्रिटियम लेबल nucleotides का उपयोग अटकल एचआईवी एक p24 के लिए एलिसा की जगह ले सकता है. मध्याह्न भोजन के अलावा, हम हमारी प्रणाली अन्य कोशिका प्रकार monocytes और वृक्ष के समान कोशिकाओं के रूप में एचआईवी -1 मलेरिया बातचीत के लिए प्रासंगिक के लिए अनुकूलनीय होने की उम्मीद है. तथ्य यह है कि एमडीएम पक्षपाती कोशिकाओं रहे हैं उनके हेरफेर की सुविधा, आसान के लिए अनुमति iRBC में नहीं लिया है, या कि मध्याह्न भोजन के साथ संपर्क में हैं के बाहर धोने किसी भी मैक्रोफेज को नष्ट करने के बिना. इस तरह के एक लाभ वृक्ष के समान कोशिकाओं और monocytes, जो निलंबन में संवर्धित कर रहे हैं के लिए लागू नहीं है, से उलझीऐसी कोशिकाओं और हम वर्तमान में इस मुद्दे को संबोधित कर रहे हैं के साथ uRBC और मुक्त iRBC paration. हमारा सिस्टम भी प्लाज्मोडियम उजागर सीडी 4 सकारात्मक सह संस्कृति प्रयोगों में टी कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं में एचआईवी -1 वायरल चक्र पर एककेंद्रकश्वेतकोशिका व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रभाव के रूप में और अधिक जटिल बातचीत का अध्ययन उपयोगी हो सकता है. अंत में, हमारे प्रोटोकॉल पी. के प्रभाव में देख रहे प्रयोगों के लिए उपयुक्त हो सकता है एचआईवी -1 से संक्रमित व्यक्तियों के लिए एचआईवी -1 PBMC में पुनर्सक्रियन पर फाल्सीपेरम iRBCs.

आचार बयान

मानव PBMC स्वस्थ दाताओं का रक्त से प्राप्त किया गया, केंद्र Hospitalier de l'Université Laval रिसर्च सेंटर के जैवनैतिकता समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार में. एक लिखित सहमति के सभी रक्त दाताओं से प्राप्त हुई थी.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम एक उत्प्रेरक सह संक्रमण और सह morbidities के अनुदान के माध्यम से स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा के द्वारा समर्थित किया गया. मानव एरिथ्रोसाइट्स केंद्र Hospitalier de l'Université Laval रक्त बैंक के द्वारा उपलब्ध कराए गए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Multicell 350-000-CL
PBS-endotoxin free Sigma D8662
FBS Wisent 080-150 Heat-inactivated at 56 °C for 30 min
Accutase eBiosciences 00-4555-56
Albumax II Gibco 11021-037 Dissolved in RPMI 1640, filter-sterilized
Lymphocyte separation medium Multicell 305-010-CL
White luminometer plates Promega Z3291
CS Macs separation columms Miltenyi Biotech 130-041-305
VarioMacs separator Miltenyi Biotech 130-090-282
Penicillin/Streptomycin solution Wisent 450-201-EL
D-sorbitol Sigma-Aldrich S1876
Cell scraper (25 cm) Sarstedt 83.1830
24-Well Cell Culture Plates BD Falcon 353047
150 x 20 mm culture dish Sarstedt 83.1803.003
M-CSF Genscript Z02001
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Human serum AB+ Valley Biomedical HP1022
HBSS Wisent 311-505-CL
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9636
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761
Luciferase Assay System Promega E1500
Human red blood cells Obtained purified from CHUL blood bank.

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References

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इम्यूनोलॉजी 66 अंक संक्रमण चिकित्सा मलेरिया एचआईवी -1 monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज PBMC लाल रक्त कोशिकाओं वृक्ष के समान कोशिकाओं सह संक्रमण परजीवी,
एक<em&gt; इन विट्रो में</em&gt; सह - संक्रमण का अध्ययन करने के लिए मॉडल<em&gt; प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम</emमानव प्राथमिक monocyte व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं में&gt; एचआईवी -1 सहभागिता
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Andreani, G., Gagnon, D., Lodge, R., … More

Andreani, G., Gagnon, D., Lodge, R., Tremblay, M. J., Richard, D. An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells. J. Vis. Exp. (66), e4166, doi:10.3791/4166 (2012).

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