Summary
ونحن تصف طريقة لقياس الكمي في الوقت الحقيقي، من glycosylase الحمض النووي والأنشطة نوكلياز داخلية AP في lysates النووية الخلية. الفحص تؤدي معدلات النشاط وإصلاح الحمض النووي قابلة للتحليل الحركي ويمكن تكييفه لتقدير حجم النشاط وإصلاح الحمض النووي في الأنسجة وlysates ورم أو مع البروتينات تنقيته.
Abstract
ونحن تصف طريقة لقياس الكمي في الوقت الحقيقي، من glycosylase الحمض النووي والأنشطة نوكلياز داخلية AP في lysates النووية الخلية باستخدام قاعدة الختان إصلاح (ديسمبر) منارات الجزيئية. وتتألف الركيزة (منارة) لdeoxyoligonucleotide تحتوي على آفة قاعدة واحدة مع Carboxyfluorescein-6 (6-FAM) شاردة مترافق إلى 5'end وشاردة Dabcyl مترافق إلى نهاية 3 'للنيوكليوتيدات دقيقة. منارة الجزيئية BER هو 43 قواعد في طول وصمم تسلسل للترويج لتشكيل هيكل الجذعية حلقة مع 13 النيوكليوتيدات في حلقة وأزواج قاعدة ال 15 في 1،2 الجذعية. عندما مطوية في هذا التكوين تطفئ شاردة 6-FAM بواسطة Dabcyl بطريقة غير فلوري عبر نقل طاقة الرنين فورستر (الحنق) 3،4. يتم وضع هذه الآفة أن آفة قاعدة التالية إزالة وانفصال حبلا يتم تحرير ما تبقى قليل النوكليوتيد قاعدة 5 يحتوي على شاردة 6-FAM من الجذع. الافراج عنكتيبة الثانية من نتائج (Dabcyl) في فاكهه تقضي بزيادة قدرها مضان أن يتناسب مع مستوى من إصلاح الحمض النووي. من خلال جمع العديد من يقرأ من القيم مضان، في الوقت الحقيقي وتقييم نشاط BER هو ممكن. استخدام معيار كمي الصكوك PCR في الوقت الحقيقي ويسمح تحليل عينات عديدة في وقت واحد. تصميم هذه المنارات BER الجزيئية، مع آفة قاعدة واحدة، غير قابلة للتحليل الحركي، والتحقق من صحة تقدير BER المانع ويمكن تكييفه لتقدير حجم النشاط وإصلاح الحمض النووي في الأنسجة والخلايا السرطانية lysates أو مع تنقية البروتينات. قد تحليل نشاط BER في lysates الورم أو الأنسجة aspirates استخدام هذه منارات الجزيئية أن تنطبق على القياسات العلامات البيولوجية الوظيفية. علاوة على ذلك، تحليل للنشاط BER مع تنقية البروتينات باستخدام هذا الاختبار الكمي ويوفر السريع، والإنتاجية العالية لطريقة لاكتشاف والتحقق من مثبطات BER.
Protocol
1. الجزيئية منارة التصميم
1.1 تصميم ويأمر منارة الخاص الجزيئية
ويجب تصميم منارة الخاص الجزيئية مراعاة ما يلي:
- لدينا نتائج جيدة مع الحمض النووي [أليغنوكليوتيد] 43-مير. يجب أن يكون محتوى GC> 32٪. استبعاد وجود قاعدة G في نهاية 5 '.
- طلب 6-FAM (6-Carboxyfluorescein) اقتران في "نهاية وDabcyl باعتبارها 3 'ال 5 تعديل.
- وينبغي أن الموقف من آفة يكون على قاعدة رقم 6 من النهاية 5 '.
- وينبغي أن طول الساق أو على الوجهين تكون منعطف حاد لا يقل عن 15 شركة بريتش بتروليوم.
- وطول حلقة الموصى بها هي 13 قاعدة.
- وكما هو مبين في الهيكل العام للمنارة في الشكل 1.
- بمجرد قررت تسلسل وآفة النوع، يمكن أمر قليل النوكليوتيد من الشركات الأكثر نيوكليوتيدات دقيقة. نحن لدينا من أجل [أليغنوكليوتيد] IDT وطلب أن [أليغنوكليوتيد] هي HPLC المنقى ويقوم بتقديمإد على شكل مسحوق أو في شكل المجففة.
1.2 التليين منارة الخاص الجزيئية
- حل [أليغنوكليوتيد] الحمض النووي مجفد في التخفيف أليغو العازلة (10 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 0.1 ملي EDTA) لإعطاء المركزة سهم بيكون الجزيئية حل من 40 ميكرومتر.
- إعداد 200nM حل منارة الجزيئية عمل من 40 ميكرومتر الجزيئية منارة حل الأوراق المالية باستخدام العازلة رد فعل البر (انظر أدناه). إضافة 200 نانومتر حل منارة الجزيئية تعمل على أنبوب أسود معقم 1.5 مل.
- احتضان الأنبوب الذي يحتوي على 200 نانومتر حل منارة الجزيئية التي تعمل في كوب كبير من الماء المغلي لمدة 3 دقائق.
- بعد 3 دقائق، وإزالة كوب من مصدر الحرارة واحتضان منارات الجزيئية في الماء بين عشية وضحاها لتعزيز الصلب. استخدام مواد العزل الحراري على حد سواء فوق وتحت الكأس لإبطاء عملية التبريد.
- منارات في قسامة، أسود معقم أنابيب 1.5 مل، و 100 ميكرولتر لكل أنبوب.
- متجر في -30 درجة مئوية.
1.3 تقييم الجودة من منارة الخاص الجزيئية
- إجراء تحليل منحنى ذوبان للتأكد من أن منارات BER الجزيئية لا يتألق حتى ساخنة، لتحديد درجة حرارة انصهار الأمثل وللتأكد من أن كل منارة سوف يتألق عند تسخينها.
- لكل منارة إضافة الحجم المشار إليه من منارة 200 نانومتر حل الجزيئية العمل وBER العازلة رد فعل، كما هو مبين في الجدول رقم 1، إلى 6 آبار من لوحة 96-جيدا بصري سريع (النظم البيولوجية التطبيقية، القط # 4346906).
- استخدم أداة PCR في الوقت الحقيقي مثل (النظم البيولوجية التطبيقية) StepOnePlus نظام أو ما شابه ذلك لرصد FAM-صبغ إثارة خلال تحليل منحنى ذوبان.
- برنامج جهازك PCR الوقت الحقيقي (StepOnePlus نظام) لمراقبة FAM صبغ إثارة بوصفها وظيفة من زيادة درجة الحرارة في زيادات صغيرة لتحليل منحنى ذوبان. وتمت برمجة النظام StepOnePlus لقياس FAM فلورةNCE والمنحدر من 25 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية في فترات 0،5 درجة مئوية. ويبين منحنى ذوبان نموذجي في الشكل 2.
- وينبغي أن القليل او لا مضان الخلفية تكون مرئية في درجات حرارة دون 50 درجة مئوية. تحقق من وجود زيادة حادة في الزي الرسمي ومضان، مما يدل على منارات جودة عالية ونقية. قيم TM حوالي 60 درجة مئوية إلى 80 درجة مئوية مواتية ويجب أن تكون متساوية للجميع التخفيفات.
- تي تحديد حد أقصى، ودرجة الحرارة القصوى في مضان القيم [ط (حد أقصى)]، من هذا التحليل. وينبغي أن تناسب القيم مضان في م تي أو تي ماكس للمدخلات منارة (تركيز) أن تكون خطية. يجب أن تكون قيمة مضان في أقصى تي، فلوريدا (حد أقصى)، تتجاوز القيم الأساسية عند 37 درجة مئوية على الأقل 5 أضعاف.
2. النووية المحللة التحضير
2.1 إصلاح قاعدة الختان رد فعل عازلة 5 إعداد
- إضافة كافة العناصر المدرجةو 2 في الجدول جلب حجم المخزن المؤقت إلى 900 مل مع DDH 2 O.
- ضبط درجة الحموضة إلى 7.8 باستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم 8.0 N (سيغما، القط # 17-8).
- جلب حجم المخزن المؤقت إلى 1000 مل باستخدام DDH 2 O.
- تصفية العازلة باستخدام فلتر 0.22 ميكرون، Nalgene 1 لتر فلتر (القط # 167-0020).
- إضافة Dithiothreitol (DTT) فورا قبل استخدام الاحتياطي رد فعل البر.
2،2 خلية ثقافة والعزلة الخلية
- ويقترح لخلايا ثقافة متكدسة حتى 90-100٪. عزل خلايا 4-6 أطباق (150 ملم) للحصول على المحللة النووية كافية لمجموعة كاملة من التحليلات (ما يقرب من 5 × 10 7 خلايا الكلية).
- ينصح لإعداد 3 الثقافات مستقل لمدة 3 الكريات خلية مستقلة للحصول على البيولوجية مكررات في كل تحليل.
- وتعد بسهولة lysates النووية باستخدام الإجراء العزلة NucBuster (EMD القطة Calbiochem العلوم البيولوجية # 71183-3) although فإن أي بروتوكول العزلة النووية يكون من المناسب (انظر أدناه، القسم 2.3).
2.3 إعداد المحللة النووية
- قبل البدء، هو أول مثبط للبروتياز مجفد كوكتيل (Calbiochem، القط # 539131، مجموعة 1) إعادة معلقة في الماء المعقم 100 ميكروليتر لإعداد الأوراق المالية 100X. استخدامها على الفور أو تجمد في aliquots عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. حساب 1 ميكرولتر من الأوراق المالية 100X لكل الخلايا المستخرجة 7 10، حسب الحاجة.
- يجب أن يتم تنفيذ كل الخطوات أثناء عملية الاستخراج على الجليد أو عند 4 درجة مئوية لضمان استقرار البروتين.
- تسمية 15 مليلتر أنابيب الصقر ومكان على الجليد.
- إزالة وسائل الاعلام من نمو الخلايا وغسل مرتين مع 7.5 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
- أضف 5 مل من برنامج تلفزيوني الباردة إلى كل طبق والخلايا كشط من لوحة لاستعمال المصعد الخلية. نقل الخلايا إلى مبرد 15 مل أنبوب الصقر.
- الطرد المركزي بسرعة منخفضة (500x ز، 4 درجات مئوية) لمدة 5 دقائق. إزالة طافوتقدير حجم الخلية معبأة من خلال المقارنة. (يمكن معالجة ما يصل إلى 250 ميكرو لتر حجم خلية معبأة في أنبوب واحد 1.5 مل)
- الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في ز 500x وإزالة ما تبقى في برنامج تلفزيوني مع ماصة. Resuspend لبيليه في خلية الكاشف استخراج NucBuster 1 وفقا لحجم وحدة التخزين خلية معبأة: 150 استخراج NucBuster ميكرولتر الكاشف 1 في 50 ميكرولتر حجم الخلية معبأة. (بدلا من ذلك، يمكن أن يكون بيليه خلية السريعة المجمدة على الثلج الجاف أو مع النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى على استعداد للشروع).
- بعد اعادة تعليق، ونقل إلى أنبوب المحللة السابقة للمبرد 1.5 مل.
- دوامة 15 ثانية على سرعة عالية، واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق، ودوامة ثانية 15 ثانية على سرعة عالية.
- الطرد المركزي في 13000 XG لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- طاف يحتوي على نسبة حشوية. إزالة وتخزين في -80 درجة مئوية أو تجاهل.
- اعادة تعليق على بيليه في خليط من 1 ميكرولتر من إعادة علقت 100X البروتياز كوكتيل المانع، 1 & Mش؛ لتر من DTT 100 ملم و 75 استخراج NucBuster ميكرولتر الكاشف 2 في 50 ميكرولتر حجم الخلية معبأة.
- دوامة 15 ثانية على سرعة عالية، واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق، ومرة أخرى دوامة ثانية 15 وعلى سرعات عالية.
- الطرد المركزي في 13000 XG لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. طاف تحتوي على بروتينات النووية. جمع طاف، والشروع في الخطوة التالية.
2،4 غسيل الكلى، البروتين الكمي وaliquoting
- يجب أن يتم تنفيذ كل الخطوات أثناء عملية غسيل الكلى مع المواد، وقبل حلول المبردة والمعدات لضمان جودة استخراج.
- إعداد العازلة غسيل الكلى (1 L المطلوبة لكل عينة) كما هو مفصل في الجدول رقم 3. المهم: المخزن المؤقت يجب أن تكون باردة (4 درجة مئوية). نقترح إعداد على الأقل قبل يوم واحد. ويمكن تخزين العازلة التي تمت تصفيتها لغسيل الكلى في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى إذا لم DTT المضافة.
- قبل البرد الأكواب (L 2 أكواب من 1 في العينة)، عازلة لغسيل الكلى، وغرف غسيل الكلى، والطرد المركزي الصغيرة،الأنابيب والحقن والإبر.
- قبل استخدام حق - إضافة 1 1 مل M DTT للتر الواحد من عازلة لغسيل الكلى.
- Dialyze والمحللة أعدت في الخطوة 2.3 في 0.5 العازلة L غسيل الكلى قبل المبردة لمدة 90 دقيقة في 4 درجة مئوية مع التحريك لطيف باستخدام الشرائح-A-Lyzer بيرس غسيل الكلى كاسيت (0.5-3 أشرطة غسيل الكلى مل مع قطع ميغاواط 7000).
- نقل كاسيت غسيل الكلى إلى دورق ثانية تحتوي على 0،5 العازلة L غسيل الكلى قبل المبردة وdialyze المحللة لمدة 90 دقيقة في 4 مع التحريك لطيف درجة مئوية.
- جمع مدال حل بروتين النووي من كاسيت لغسيل الكلى باستخدام محقنة (فيشر، القط # 309659). استخدم طوقا مختلفة من المستخدمة سابقا لحقن البروتين في كاسيت لغسيل الكلى. لاحظ أن استخراج قد تبلورت نتيجة لتركيزات عالية من البروتين. في محاولة لتشمل غائم بلورات عندما تبحث إزالة مدال حل بروتين نووي.
- قسامة العينة الصغيرة أنابيب الطرد المركزي، و 20 ميكرو لتر لكل منهما. سريع تجميد الثلج الجاف وستوره في -80 درجة مئوية حتى استخدامها.
- تحديد تركيز البروتين مدال باستخدام البروتوكولات القياسية. وترد أمثلة من المتوقع تركيزات المحللة النووية في الجدول رقم 4.
- أخيرا، ينبغي تقييم lysates لمراقبة الجودة. وتقييم لlysates تختلف مع التجربة. كما هو موضح سابقا، نحن نحلل بصورة روتينية lysates للتعبير عن البروتينات BER عدة عبر 1،2 طخة مناعية.
- وتستخدم هذه الخطوة لغسيل الكلى لاتخاذ رد فعل موحد حل عبر خطوط خلية لتسهيل المقارنة. قد حذف الخطوة غسيل الكلى تؤثر على معدلات الأنزيمية والتحليل الحركي منذ حلول الملح وظروف لم تعد رد فعل مماثل في خطوط مختلفة من الخلايا والاستعدادات بسبب التخفيفات المختلفة المطلوبة. ومع ذلك، فقد لاحظنا أن استخدام lysates أكبر من 5 ميكروغرام / ميكروليتر وإضافة ما يكفي من رد فعل عازلة لا تسمح إغفال الخطوة غسيل الكلى (لا تظهر البيانات). لعشر دراسات المانعفي لا تتطلب المقارنة بين lysates مختلفة من الخلايا، قد لا تكون هناك حاجة لغسيل الكلى. ومع ذلك، نوصي غسيل الكلى كما هو محدد.
3. الجزيئية منارة الفحص
الاحتياجات من المعدات 3.1
- كمي صك PCR في الوقت الحقيقي، مثل StepOnePlus qRT-PCR أو قابلة للمقارنة، أو مقياس التألق لوحة 96-جيدا قادرة على كشف وقياس FAM مضان في الوقت الحقيقي. ملاحظة: هذا الإجراء ينطبق على أي آلة قادرة على قراءة القيم مضان منارات وتسجيلها في الوقت الحقيقي. وينبغي أن الجهاز، ومع ذلك، تسمح للمستخدم للوصول إلى القيم الخام مضان لتحليل البيانات.
- منبذة متوافق مع أنابيب qRT-PCR أو بصرية أو لوحات المستخدمة.
- مايكروسوفت اكسل لتحليل البيانات التي تم جمعها.
3.2 المخازن والكواشف
- بصري qRT-PCR أنابيب أو لوحات مع أغطية المطابق.
- BER العازلة رد فعل (انظر 1بوف والجدول 2).
- بروتين نووي مدال مقتطفات كما أعدت في خطوات 2.3 و 2.4 و تخفيفه إلى 2 ميكروغرام / بروتين ميكرولتر مع العازلة التي تحتوي على رد فعل BER DTT.
- منارات الجزيئية تخفيفه إلى 200 ميكرومتر مع عازلة رد فعل البر لإنشاء حل منارات الجزيئية العمل (انظر أعلاه).
3.3 الفحص مجموعة المتابعة (الجدول 5)
- ليست آلة qRT-PCR تستخدم عادة بمثابة مقياس التألق لذلك يجب تغيير طريقة التشغيل.
- برنامج المرحلة الأولى وتعيين درجة حرارة التفاعل إلى 37 درجة مئوية مع دورة الزمن (نقاط لقياس الوقت) من 20 ثانية مع حد أدنى من 180 دورات (أو أكثر، اعتمادا على تصميم إصلاح فحص). تأكد لجمع البيانات خلال دورات. ولذلك، فإن آلة جمع البيانات كل 20 ثانية ليصبح المجموع 1 ساعة.
- إنشاء المرحلة الثانية التي سلالم درجة الحرارة إلى Tmax من منارة خاصة، ودرجة الحرارة القصوى مع مضان، كما ردعالملغومة في خطوة 1.3 (تقييم جودة منارة الخاص الجزيئي). وينبغي أن يكون في الوقت دورة ثانية و 20 ثانية مع ما مجموعه 15 دورة. وهذا جمع البيانات كل 20 ثانية لمدة 5 دقائق في مضان القصوى الممكنة للمنارة. يتم استخدام القيم المقاسة مضان خلال دورات في Tmax لتطبيع القيم مضان في كل بئر (الخطوة 4.2a). إذا باستخدام إشارات عديدة ومختلفة للتأكد من الخطوات التي تشمل توفير قيم متكررة مماثلة لتلك التي Tmax من منارات كذلك.
- تعيين حجم رد الفعل إلى 25 ميكروليتر.
- انشاء وتصميم لوحة على الجهاز qRT-PCR باستخدام البرمجيات والنظم البيولوجية التطبيقية و. نحن مهتمون فقط في القيم مضان الخام، وحدد لذلك "المنحنى القياسي" - نوع التجربة.
- استكمال تخطيط لوحة. ويرد على سبيل المثال في الجدول 5. لا يضيف شيئا إلى آبار اختياره منحنى القياسية.
3.4 تشغيل فحص
- عفريتortant: استخدام ما قبل مبرد المادية والحلول. تبقي باردة حتى التشغيل والكشف.
- إضافة كمية مناسبة من DTT إلى BER العازلة رد فعل لاستخدامها.
- تمييع الحل البروتين إلى تركيز من 2 ميكروغرام / ميكرولتر باستخدام BER العازلة رد فعل (مع DTT).
- عن التجارب الأولية نقترح استخدام 10 ميكروغرام من المحللة النووية مدال لكل بئر (5 ميكروليتر / جيد) و 1 pmole من الركيزة، ومنارة الجزيئية في تركيز نهائي 40 نانومتر (5 ميكروليتر / جيد). لقد حصلنا على الدوام ذات جودة عالية ونتائج استنساخه مع 10 ميكروغرام من المحللة الخلية، على الرغم من أنه من الممكن أن lysates مختلفة من الخلايا أو ركائز منارة قد تملي تركيزات بروتين أعلى أو أدنى.
- مكونات فحص في كل بئر هي 15 رد فعل BER ميكروليتر العازلة (5)، منارة ميكرولتر و 5 المحللة النووية ميكرولتر. تشغيل كل مجموعة منارة / المحللة في ثلاث نسخ.
- ويلزم عدة ضوابط السلبية لكل منارة، بما في ذلك عينات من دون منارة مثل 25 ومو، L من عازلة رد فعل البر فقط، و 20 رد فعل BER ميكروليتر العازلة مع 5 المحللة ميكرولتر و 20 ميكرولتر من العازلة رد فعل BER مع 5 ميكرولتر من منارة دون المحللة.
- ويلزم مراقبة عينات عدة لكل المحللة النووية. وتشمل هذه المراقبة السلبية [15 رد فعل BER ميكروليتر العازلة (5)، منارة سيطرة ميكرولتر (أي آفة) و 5 المحللة عينة ميكرولتر]. نقترح أيضا لتشمل الضوابط الإيجابية التجريبية مثل إدراج THF التي تحتوي على إشارات التي تحاكي موقع abasic تحتوي على oligos ومنقوش بسهولة [15 رد فعل BER ميكروليتر العازلة (5)، منارة THF ميكرولتر و 5 المحللة عينة ميكرولتر]. وبطبيعة الحال، فإن مراقبة دقيقة إيجابية تعتمد على التصميم التجريبي بشكل عام.
- كمثال على ذلك، اتبع الجدول 5 أدناه للحصول على تخطيط لوحة.
- الماصة في أنابيب ضوئية أو لوحات في حين على الجليد أو موقف تبريد للتقليل من رد فعل قبل بدء الكشف عن إشارة.
- العازلة الماصة رد فعل BER الأولى في جميع الآبار.
- و منارات الماصة ن وفقا لتخطيط لوحة في آبار الصحيح والماصة دائما lysates مشاركة في الآبار للحد من بدء رد فعل من قبل الكشف عن إشارة.
- أنابيب ختم أو لوحة تماما، خلط وتدور مع جهاز للطرد المركزي لجمع الحلول إلى أسفل الأنابيب أو لوحة
- تضاف إلى لوحة qRT-PCR وتبدأ آلة فحص.
- بعد الانتهاء، وتصدير البيانات الخام، ويفضل أن يكون ذلك في شكل اكسل. بالنسبة للنظام StepOnePlus هناك حاجة فقط إلى البيانات المتعددة العناصر. هذا ويتضمن كل القيم مضان في العديد من يقرأ مرتبة حسب لون صبغ وبصحة جيدة.
4. الجزيئية تحليل منارة الفحص
كنا مايكروسوفت اكسل البرنامج لأداء هذه التحليلات والحسابات. نوصي القوالب إنشاء وحدات الماكرو التي تسمح تحليل سهلة وسريعة ويعرض الرسم البياني استنادا إلى بيانات مستمدة من النماذج القياسية 96-جيدا.
4.1 إزالة الخلفية
">4،2 فلوريدا (Tmax) تطبيع
لمواجهة التقلبات في pipetting وكشف مضان في الآبار المختلفة، ونحن تطبيع البيانات لقيم مضان القصوى (التي ترتبط مع مدخلات منارة).
- حساب القيم متوسط مضان دورات في أقصى تي بالنسبة للفرد أيضا: فلوريدا (تي ماكس) (الخطوة 3.3aii).
- حساب النسب ط (دورة X) / فلوريدا (تي ماكس) ومضاعفة من قبل 100. في ظل افتراض أن من المرجح فلوريدا (تي ماكس) يتوافق مع القيمة القصوى مضان ممكن عندما قطعي تماما، وتمثل هذه البيانات تطبيع٪ خالية FAM (= منارة BER٪ قطعي).
- الجمع بين عينات من ثلاث نسخ عن طريق حساب متوسط البيانات (٪ خالية FAM) من الآبار 3 لكل دورة (دورة حتى 180) وحساب الأخطاء في كل منها.
- حساب مرات بضرب و 20 ثانية على كل دورة.
- منذ التباين بشكل جيد إلى جيد في الكشف عن مضان يمكن أن تكون كبيرة، ونحن نوصي لإضافة صبغة الفلورسنت مثل ROX إلى المخزون منارة الجزيئية التي تخدم معيار كما لإعادة ضبط قيم مضان من الآبار الفردية. في هذه الحالة، يمكن استخدام صبغة ROX كمعيار داخلي (إشارة سلبية) في كل واحدة أيضا. ROXالإثارة وانبعاث الطيف (الإثارة - 588 نانومتر، وانبعاث 608 نانومتر) تختلف عن تلك الصبغة 6-FAM المستخدمة في فحص (الإثارة - 495 نانومتر، والانبعاثات - 520 نانومتر). والصبغة ROX تمكين خطوة مماثلة لإجراءات التطبيع RT-PCR التقليدية التي تسمح للتطبيع بشكل جيد الى جيد الخلافات التي قد تحدث بسبب القطع الأثرية. قد تنجم عن هذه pipetting أخطاء أو قد تنشأ من جيد الى جيد الاختلاف في كفاءة كشف مضان.
4.3 المؤامرة
- مؤامرة البيانات مضان تطبيع (٪ مجانا FAM) مع الزمن (في ثانية) في مؤامرة مبعثر مع الأخطاء المقابلة.
- من المستحسن تحليل حركية الإصلاح في ما لا يقل عن ثلاثة مختلفة الاستعدادات المحللة النووية تمثل مكررات البيولوجية. لتقييم الفرق، يجب عرض ما بين التجريبية الأخطاء المحسوبة من المتوسط من كل تجربة على حدة.
- ويشير تحليل ممثل اثنين من lysates الخلية السرطانية: LN428، وهو دبقيخط خلية لديهم مستويات غير قابلة للكشف من الحمض النووي الميثيل glycosylase البيورين (MPG) وLN428/MPG، خط الخلية نفسها هندسيا للتعبير مرتفعة من مؤسسة ماكس بلانك، وكلاهما خطوط الخلايا لديهم مستويات يعادل نوكلياز داخلية ا ف ب 1 (APE1) 1،2. تم بحث كل لAPE1 النشاط والنشاط ميلا في الغالون باستخدام THF BER الجزيئية منارة (الشكل 3) وHX BER الجزيئية منارة (الشكل 4)، حيث THF = رباعي هيدرو الفوران (ركيزة لAPE1) وHX = هيبوزانتين (ركيزة لميلا في الغالون) . ملاحظة: في الشكل 3 (THF الركيزة)، والنتائج من lysates LN428/MPG تظهر انخفاض ومضان المطلقة القصوى بالمقارنة مع lysates LN428. هذا هو نتيجة لانخفاض قيمة منارة المدخلات كما هو محدد باستخدام قيم Tmax (انظر 3.3a). عندما تم استخدام هذه القيمة المنخفضة لتطبيع النتائج، فإنه يؤدي إلى حدوث تغيير كبير في المؤامرة. هذا يوضح لطيف على أهمية تطبيع البيانات. والمتهم بالتآمر في القيم المطلقة مضان وحدها تشير الى repaمعدلات الأشعة تحت الحمراء بين LN428 والخلايا LN428/MPG مختلفة. ومع ذلك، عندما يتم تطبيع البيانات للنظر في التغير بشكل جيد إلى جيد، يظهر معدل إصلاح APE1 بوساطة فرق أن يكون الحد الأدنى.
5. ممثل النتائج
ونحن تصف طريقة لقياس الكمي في الوقت الحقيقي، من glycosylase الحمض النووي والأنشطة نوكلياز داخلية AP في lysates النووية الخلية باستخدام قاعدة الختان إصلاح (ديسمبر) منارات الجزيئية (الشكل 1). مطوع مرة واحدة، فإننا نقترح إجراء تحليل منحنى ذوبان (الجدول 1) وتقييم جودة منارة الخاص الجزيئي (الشكل 2). ويمكن أن تكون lysates النووية ثم أعدت، وذلك باستخدام مكونات عازلة المدرجة في الجدول رقم 2. Dialyze والمحللة في 0،5 L العازلة غسيل الكلى قبل المبردة لمدة 90 دقيقة في 4 درجة مئوية مع التحريك لطيف باستخدام غسيل الكلى الشرائح-A-Lyzer كاسيت بيرس ضد المخزن المؤقت لغسيل الكلى المدرجة في الجدول رقم 3. جمعمدال حل بروتين النووي من كاسيت لغسيل الكلى باستخدام حقنة. استخدم طوقا مختلفة من المستخدمة سابقا لحقن البروتين في كاسيت لغسيل الكلى. تحديد تركيز البروتين مدال باستخدام البروتوكولات القياسية. وترد أمثلة من المتوقع تركيزات المحللة النووية في الجدول رقم 4. تشغيل رد فعل على النحو المبين أعلاه (الخطوة 3.4)، وذلك باستخدام تخطيط لوحة كما هو مبين في الجدول رقم 5. ويشير تحليل ممثل اثنين من lysates الخلية السرطانية: LN428، خط خلية دبقي مع مستويات غير قابلة للكشف من الحمض النووي الميثيل glycosylase البيورين (MPG) وLN428/MPG، خط الخلية نفسها هندسيا للتعبير مرتفعة من مؤسسة ماكس بلانك، وكلاهما خطوط الخلايا لديهم مستويات يعادل AP نوكلياز داخلية 1 (APE1) 1،2. تم بحث كل لAPE1 النشاط والنشاط ميلا في الغالون باستخدام THF BER الجزيئية منارة (الشكل 3) وHX BER منارة الجزيئي (الشكل 4)، حيث THF = رباعي هيدرو الفوران (ركيزة لAPE1) وHX = هيبوزانتين(ركيزة لميلا في الغالون). أخيرا، وذلك باستخدام اليورانيوم المنضب BER / منارة الجزيئية التي تقارير عن نشاط glycosylase اليوراسيل، وتبين لنا أن الناتج إشارة أو قوة الإشارة القصوى في 10μg من البروتين وتنخفض إلى مستوى لا يمكن الكشف عنها عند 0.62 ميكروغرام من البروتين (الشكل 5).
الشكل 1. الهيكل العام للمنارة BER الجزيئية. ظاهر هو تسلسل والتصميم العام للمنارات BER الجزيئية المستخدمة هنا في جزيء واحد الذين تقطعت بهم السبل، بعد الصلب، ومرة أخرى بعد الذوبان. في جزء الغامق المائل، من تسلسل هو الجذعية (15 قواعد) وجزء من تسلسل وأكد هو حلقة (13 قاعدة). FAM = صبغ 5 'فلوري 6 Carboxyfluorescein [على 5'end؛ Abmax = 495 نانومتر، Emmax = 520 نانومتر، ومعامل الانقراض (260 نانومتر): 20960، معامل الانقراض (في أقصى الامتصاصية): 75،000] وDabcyl = لل 3 'تبريد وكيل اللمسة سيل [على 3'end؛ Abmax = 453 نانومتر؛ المدى تسقيه = 425-520 نانومتر] X = الآفة (يختلف اعتمادا على سؤال البحث) وY = قاعدة العكس الآفة (يختلف اعتمادا على السؤال البحثي). .
الشكل 2. تذوب المنحنى. ويرد منحنى ذوبان ممثل للمنارة BER التحكم الجزيئي (A)، ومنارات BER الجزيئية التي تحتوي على (THF) رباعي هيدرو الفوران شاردة (B) أو (HX) هيبوزانتين شاردة (C) وتراوحت تركيزات قليل النوكليوتيد من 0 نيوتن متر (الأزرق الداكن)، و 8 نيوتن متر (أحمر)، و 16 نيوتن متر (الأخضر)، و 32 نيوتن متر (اللون الأرجواني)، و 64 نانومتر الأزرق إلى 128 نيوتن متر (البرتقال). وكما هو موضح في الخطوة 1.3، يسخن [أليغنوكليوتيد] صلب من 25 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية في فترات 0،5 درجة مئوية، ويتم برمجة الجهاز لقياس StepOnePlus FAM مضان في كل فاصل زمني 0.5 درجة مئوية.
الشكل 3. بيانات تمثيلية باستخدام منارة BER الجزيئية THF. وتم قياس نشاط AP نوكلياز داخلية محددة من أجل التحلل من رباعي هيدرو الفوران موقع التناظرية abasic (THF) في lysates النووية من مراقبة خط الخلية (LN428)، وميلا في الغالون المبالغة في التعبير عن خط الخلية (LN428/MPG) . وتم تحليل كل المحللة باستخدام التحكم BER منارة الجزيئية (LN428، الخضراء، LN428/MPG والأرجواني) أو THF BER الجزيئية منارة (LN428، الأزرق؛ LN428/MPG، الحمراء). وأفادت النتائج على النحو (A) يعني وحدة استجابة مضان و (ب). نفس البيانات طبيعية لإدخال منارة كما هو موضح في الفقرة 4 أعلاه (THF = رباعي هيدرو الفوران)
الشكل 4. ممثل البيانات باستخدام الحمض النووي HX BER منارة الجزيئية نشاط glycosylase محددة لإزالة MPG ح الركيزةوقد تم قياس ypoxanthine (HX) في lysates النووية من سيطرة خط الخلية (LN428)، وميلا في الغالون على التعبير عن خط الخلية (LN428/MPG). وتم تحليل كل المحللة باستخدام التحكم BER منارة الجزيئية (LN428، الخضراء، LN428/MPG والأرجواني) أو HX BER الجزيئية منارة (LN428، الأزرق؛ LN428/MPG، الحمراء). وأفادت النتائج على النحو (A) يعني وحدة استجابة مضان و (ب). نفس البيانات تطبيع كما هو موضح في الفقرة 4 أعلاه (= هيبوزانتين HX)
الشكل 5. وتم قياس البيانات ممثل باستخدام اليورانيوم المنضب BER / منارة الجزيئية في مستويات البروتين المختلفة. glycosylase الحمض النووي (أونغ) نشاط محدد لإزالة اليوراسيل (DU / A) في lysates النووي من خلايا T98G. تم تحليل المحللة T98G باستخدام التحكم BER منارة الجزيئية أو دو BER / منارة الجزيئية، في مستويات البروتين من 10، 5، 2.5، 1.25 أو 0.62 ميكروغرام، كما هو مبين في وigure. النتائج هي بيانات تطبيع كما هو موضح في الفقرة 4 أعلاه.
| تركيز بيكون (نيو مكسيكو) | 0 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 |
| الجزيئية حل بيكون العمل (200nM) المضافة (ميكرولتر) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 |
| BER الواق رد فعل (ث / س DTT) (ميكرولتر) | 25 | 24 | 23 | 21 | 17 | 9 |
الجدول رقم 1. التخطيط لتجربة منحنى ذوبان.
| 1 لتر المجموع | يحتاج حجم محلول المخزون | يخدع. من محلول المخزون | كون النهائي. |
| HEPES-KOH | 25 مل | 1M pH7.8 | 25 ملم </ TD> |
| بوكل | 75 مل | 2 M | 150 ملم |
| EDTA | 1 مل | 0.5M pH8.0 | 0.5 ملم |
| الغليسيرول | 10 مل | N / A | 1٪ |
| DTT (إضافة قبل الاستخدام) | 0.5 مل | 1 م | 0.5 ملم |
| H 2 O | 888.5 مل | N / A | N / A |
الجدول 2. BER رد فعل العازلة.
| 1 لتر المجموع | يحتاج حجم محلول المخزون | يخدع. من محلول المخزون | كون النهائي. |
| HEPES-KOH | 50 مل | 1M pH7.5 | 50 ملي |
| بوكل | 50 مل | 2 M | 100 ملي مول |
| EDTA | 1 مل | 0.5M pH8.0 | 0.5 ملم |
| الغليسيرول | 200 مل | N / A | 20٪ |
| DTT (إضافة قبل الاستخدام) | 1 مل | 1 م | 1 مم |
| H 2 O | 698 مل | N / A | N / A |
الجدول 3. غسيل الكلى العازلة.
| خط خلوي | تركيز بروتين (ميكروغرام / ميكرولتر) |
| LN428 | 5.34 |
| LN428/MPG | 4.79 |
الجدول 4. نتائج بروتين تقدير.
| السلبية تحكم 25μL BER الواق | (التحكم الخلفية) 20μL BER الواق 5μL كون منارة NO المحللة | (اختبار في ثلاث نسخ) <ر /> 15μL BER الواق 5μL كون منارة 5μL LN428 المحللة | (اختبار في ثلاث نسخ) 15μL BER الواق 5μL كون منارة 5μL LN428/MPG المحللة |
| السلبية تحكم 25μL BER الواق | (التحكم الخلفية) 20μL BER الواق 5μL THF منارة NO المحللة | (اختبار في ثلاث نسخ) 15μL BER الواق 5μL THF منارة 5μL LN428 المحللة | (اختبار في ثلاث نسخ) 15μL BER الواق 5μL THF منارة 5μL LN428/MPG المحللة |
| السلبية تحكم 20μL BER الواق 5μL المحللة | (التحكم الخلفية) 20μL BER الواق 5μL HX منارة NO المحللة | (اختبار في ثلاث نسخ) 15μL BER الواق 5μL HX منارة 5μL LN428 المحللة | (اختبار في ثلاث نسخ) 15μL BER الواق 5μL HX منارة 5μL LN428/MPG لايأشبع |
| السلبية تحكم 20μL BER الواق 5μL المحللة |
الجدول 5. الجزيئية الفحص بيكون انشاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك أكثر من 600 الاستشهادات باستخدام 'منارة الجزيئي "على المدى لكشف وقياس جزيئات عديدة والأنشطة الأنزيمية، بما في ذلك النشاط helicase 6، نشاط الحمض النووي بوليميريز 7،8، الحمض النووي يغاز النشاط 9، نشاط التيلوميراز 10، الحمض النووي photolyase نشاط 11 والحمض النووي / الجيش الملكي النيبالي الهجينة 12، ضمن أشياء أخرى كثيرة. بالإضافة إلى استخدام منارات الجزيئية لقياس أنشطة إصلاح الحمض النووي المذكورة أعلاه، وقد أثبتنا وغيرهم فائدة هذه التحقيقات لتحليل نشاط BER 1،2،13-15.
النشاط BER في الوقت الحقيقي فحص وصفنا هذا القانون يشتمل على قاعدة واحدة معدلة ويسمح للتقييم الكمي لمعدلات BER للآفات مختلفة، أو تغييرات في قاعدة العكس الآفة. يمكن لتطبيقات تتراوح ما بين دراسات الآلية الجزيئية لشاشات المانع. أثبتنا خصوصية BER بمقارنة lysaقسم التدريب والامتحانات من MPG معربا عن الخلايا مع عدم التعبير عن الخلايا، وانعدام النشاط في منارات السيطرة. الفحص حساس للغاية، مما يتيح للكشف عن عيوب في التعبير عن MPG البروتينات BER 2 أو XRCC1 (1) ويكفي للكشف عن التغييرات الطفيفة في إصلاح الحمض النووي المعلمات حركية وفعالية من مثبطات إصلاح الحمض النووي [مخطوطة في إعداد]. يقرأ متعددة في جميع أنحاء دعم إصلاح وقت نشط حساب معدلات الحركية وأهمية في أية تغييرات في تلك المعدلات الحركية. الفحص BER منارة الجزيئية وبالتالي مناسبة للالإنتاجية العالية دراسات للكشف عن الحمض النووي مثبطات انزيم اصلاح (شاشات المانع)، أو لإجراء دراسات حول دور المكونات النووية الفردية. تحليل lysates النووية يسمح للتقييم من إصلاح الحمض النووي في سياق كامل من مجمع البر وبالتالي تصور أيضا تعديلات غير المباشرة أو التأثيرات على آلات BER (على سبيل المثال، في مرحلة ما بعد الترجمة تعديلات أو الطفرات).
وبروتوكول، على النحو المبين، ينبغي أن تسفر عن نتائج استنساخه للغاية وكمي. ومع ذلك، هناك تفاصيل عدة للنظر لضمان تحليل سليم: (1) القيم الأساسية للضوابط السلبية قد تكون مرتفعة للغاية: هذا قد يكون بسبب سوء تخزينها أو تصنيع نيوكليوتيدات دقيقة. القيم الأساسية عالية في lysates بدون منارات تشير التباس مضان السيارات (أي تلوث أو التعبير الخلوية من البروتينات الفلورية خارجية). إذا التعبير عن بروتين فلوري أمر لا مفر منه، قد أطياف الإثارة / انبعاث لصبغ مراسل وبروتين فلوري لا تتداخل، (2) ط (Tmax) هو منخفض: تركيز الحمض النووي هو مختلفة من معين. فحص الحمض النووي عن طريق تركيز الطيفي (OD 260nm) على سبيل المثال، وذلك باستخدام Nanodrop. ارتفاع تركيز الحمض النووي مع ط منخفضة (Tmax) يدل على وجود التحميل FAM كافية عن منارات. HPLC تنقية يمنع التلوث مع الحمض النووي غير معدلة (انظر أعلاه)، (3) نشاط إصلاح سيئة: إذا كان (Tmax) القيم في فلوريداالدورات الماضية تشير إلى ما يكفي من المدخلات منارة وكشف مضان، وهذا قد يشير إلى أن إعداد مستخلص النووية باءت بالفشل. النووية جودة استخراج أمر بالغ الأهمية. وينبغي ضمان انخفاض درجات الحرارة في جميع أنحاء الداخلي بما في ذلك التخزين على المدى الطويل في -80 درجة مئوية و (4) منحنيات نشاط إصلاح بدء مع القيم العالية: تعرض حتى قصيرة جدا من العينات إلى درجة حرارة الغرفة قبل تحليل يبدأ الإصلاح. تبقي باردة في جميع الأوقات.
هذا الفحص BER حساسة للغاية وكمية ينطبق أيضا على تحليل تنقية البروتينات، وتمكين دراسات حول خصوصية الركيزة عن طريق تغيير منارات الجزيئية وفقا لذلك. وأخيرا، فإن تجربة قابلة للتطبيق على تحليل الأورام وlysates الأنسجة، وتوفير فرصة لقياس وظيفي النهاية إصلاح الحمض النووي والمؤشرات الحيوية للاستجابة أو الكفاءة العلاجية، كما اقترحنا لتقييم الأورام عن التقوية المانع PARP1 من temozolomide وكيل مؤلكل 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
RWS هو المستشار العلمي لTrevigen، وشركة أما بقية الكتاب أن تعلن عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة بيتسبرغ والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) [GM087798؛ CA148629؛ ES019498] لRWS. وقدم الدعم لمرفق UPCI Lentiviral إلى RWS من منحة دعم مركز السرطان من المعاهد الوطنية للصحة [P30 CA047904]. كما تم تقديم الدعم من قبل إدارة جامعة بيتسبرغ في علم الصيدلة والبيولوجيا الكيميائية في DS. كما تم تقديم الدعم من قبل ESTRO إلى السيرة الذاتية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
- Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
- Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
- Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
- Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
- Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
- Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
- Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
- Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
- Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
- Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
- Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
- Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
