Summary
우리는 DNA glycosylase 및 세포 핵 lysates의 에이피 endonuclease 활동의 양적, 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 분석은 운동 분석 의무의 DNA 복구 활동의 속도를 얻을 조직과 종양의 lysates 또는 정화 단백질과 DNA를 복구 활동의 부량에 대한 적응이다.
Abstract
우리는 기본 절단 수리 (BER) 분자 비콘을 사용하여 DNA를 glycosylase 및 세포 핵 lysates의 에이피 endonuclease 활동의 양적, 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 기판 (비콘)은 6 Carboxyfluorescein (6 식구들) 5'end과 oligonucleotide의 3 '끝까지 복합 Dabcyl 잔기에 복합 잔기와 하나의 기본 병변을 포함 deoxyoligonucleotide 구성되어 있습니다. BER 분자 신호의 길이는 43 기지이며, 순서는 줄기 1,2의 루프와 15 기본 쌍 13 세포핵과 줄기 루프 구조의 형성을 촉진하도록 설계되었습니다. 이 구성에 접혀 때 6 식구들 잔기는 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 3,4 통해 비 형광등 방식으로 Dabcyl에 의해 침묵하고 있습니다. 병변은 6 식구들 잔기를 포함하는 나머지 다섯베이스 oligonucleotide는 줄기에서 발표되는 등 그 다음의 기본 병변 제거 및 스트랜드 절단에 위치하고 있습니다. 풀어DNA 수리의 수준에 비례이다 형광의 증가 끄는 (Dabcyl) 결과에서 차 초연. 복수를 수집하여 형광 값 읽기, BER 활동의 실시간 평가는 가능합니다. 표준 정량 실시간 PCR 악기의 사용은 많은 샘플의 동시 분석이 가능합니다. 이러한 BER 분자 비콘의 디자인은 하나의 기본 병변으로 운동 분석, BER의 부량 및 억제제 검증 의무가 있으며 조직과 종양 세포 lysates의 DNA를 복구 활동의 부량 또는 단백질 정제와 적응이다. 이러한 분자 비콘을 사용하여 종양 lysates이나 조직 aspirates의 BER 활동의 분석은 기능적인 biomarker 측정에 적용할 수 있습니다. 또한, 이러한 양적 분석을 사용하여 단백질을 정제와 BER 활동의 분석 BER 억제제의 발견 및 검증을위한 신속한 높은 처리량 방법을 제공합니다.
Protocol
1. 분자 표지 디자인
1.1 설계 및 분자 신호를 주문
귀하의 분자 비콘의 디자인은 다음 사항을 고려해야합니다 :
- 우리는 43-메르의의 DNA oligonucleotides와 함께 좋은 결과를 가지고. GC 함량이> 32 %가됩니다. 5 '끝에 G 기지를 제외합니다.
- 요청 6 식구들 (6 Carboxyfluorescein) 5 '끝 그리고 3 등 Dabcyl'수정에 활용.
- 병변의 위치는 5 '끝에서 기지 # 6에 있어야합니다.
- 막대 또는 머리 핀의 자형 이중의 길이가 15 BP 최소이어야합니다.
- 권장 루프 길이는 13 기지입니다.
- 신호기의 전체 구조는 그림 1에 표시됩니다.
- 시퀀스 및 병변 유형이 결정되면, oligonucleotide 가장 Oligonucleotide 기업 주문할 수 있습니다. 우리는 IDT에서 우리 oligonucleotides를 주문하고 oligonucleotides는 HPLC 정화하고 provid 것을 요청분말 또는 말린 형식 에드.
1.2 귀하의 분자 신호를 풀림
- 40 μm의의 집중 분자 비컨 주식 솔루션을 제공하기 위해; (0.1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 MM 트리스-HCL, 산도 8.0) Oligo 희석 버퍼에 동결 건조된의 DNA oligonucleotides를 해산.
- BER 반응 버퍼를 (아래 참조)를 사용하여 40 μm의 분자 비컨 주식 솔루션에서 200nM 분자 비컨 작업 솔루션을 준비합니다. 멸균 블랙 1.5 ML 관에 200 nm의 분자 비컨 작업 솔루션을 추가합니다.
- 3 분 동안 끓는 물을 큰 비커에 200 nm의 분자 비컨 작업 솔루션을 포함하는 튜브를 품어.
- 삼분 후 열원에서 비커를 제거하고 어닐링을 증진하는 것이 하룻밤 물에 분자 비콘을 품어. 열 단열 냉각 과정을 늦추기 위해 이상 비커 밑에 두 물질을 사용합니다.
- 멸균, 블랙 1.5 ML 튜브로 나누어지는 비콘, 각 튜브 100 μL.
- -30 ° C.에 저장
귀하의 분자 비컨 1.3 품질 평가
- BER 분자 비콘은 최적의 녹는 온도를 파악하고 가열하면 각 신호가 형광 것을 확인하기 위해, 온수까지 형광하지 않는 것이 확인 용해 곡선 분석을 수행합니다.
- 각 신호기는 200 nm의 분자 비컨 작업 솔루션과 BER 반응 버퍼의 지정된 볼륨을 추가할 경우, 같은 빠른 광학 96 - 웰 플레이트 6 우물 (응용 Biosystems, 고양이 # 4,346,906)으로, 표 1에 표시된.
- 같은 StepOnePlus (응용 Biosystems) 시스템 또는 유사한이 용해 곡선 분석하는 동안 식구들 염색 여기를 모니터링하는 등 실시간 PCR 장비를 사용하십시오.
- 프로그램하여 실시간 PCR 장비는 (StepOnePlus 시스템) 용해 곡선 분석을위한 작은 단위로 증가 온도의 함수로 식구들 염료 여기를 모니터링합니다. StepOnePlus 시스템은 식구들를 형광 측정하도록 프로그램되어있다25 제정신 및 진입로 ° C ~ 95 ° C ~ 0.5 ° C 간격 인치 전형적인 용해 곡선은 그림 2에 표시됩니다.
- 거의 없거나 전혀없는 배경 형광은 50 ° C. 아래의 온도에서 볼 수 있어야 순수하고 고품질 비콘을 나타내는 형광의 유니폼과 가파른 증가를 확인합니다. 약 60 TM 값 ° C ~ 80 ° C에서 유리한 위치하고 모든 dilutions에 대해 동일해야합니다.
- 이 분석에서 T는 최대, 최대한의 형광 [층 (최대)] 값의 온도를 확인합니다. 비컨 입력 (농도)에 T m 또는 T는 최대의 형광 값의 비례는 선형이어야합니다. T는 최대, FL (최대)의 형광 값 ° C에서 최소 5 배 37에서 배경 값을 초과해야합니다.
2. 원자력 Lysate 준비
2.1 기본 절단 수리 반응 완충액 5 준비
- 나열된 모든 구성 요소를 추가합니다표 2와 ddH 2 O에있는 900 ML에 버퍼의 볼륨을 가져에서
- 수산화 칼륨 8.0 N (시그마, 고양이 # 17-8)을 사용하여 7.8으로 산도를 조정합니다.
- ddH 2 O를 사용하여 1,000 ML에 버퍼의 볼륨을 지참
- 0.22 μm의 필터, Nalgene 1 패 필터 (CAT # 167-0020)를 사용하여 버퍼를 필터링합니다.
- BER 반응 버퍼를 사용하기 전에 즉시 Dithiothreitol (DTT)를 추가합니다.
2.2 세포 배양 및 세포 격리
- 그것은 90-100%에 합류하기 전까지 문화 세포에 추천됩니다. 분석의 전체 세트 (약 5 × 10 7 세포 총)에 대한 충분한 핵 lysate를 얻기 위해 4-6 요리 (150 ㎜)에서 세포를 분리.
- 그것은 생물 학적 각 분석을 위해 복제를 얻기 위해 세 독립 셀 알약 3 독립적인 문화를 준비하는 것이 좋습니다.
- 원자력 lysates은 쉽게 NucBuster 격리 절차 (EMD Bioscience Calbiochem 고양이 # 71183-3) alth를 사용하여 준비하고 있습니다ough 모든 핵 격리 프로토콜 (아래 참조, 섹션 2.3.) 적절할 것 같다.
2.3 원자력 lysate 준비
- 이전 시작하기 동결 건조된 테아제 억제제 칵테일 (Calbiochem, 고양이 # 539131, 설정 1)이 먼저 100x 재고를 준비하여 100 μl 멸균 물 속에서 다시 일시 중지되었습니다. 장기 보관 -20 ° C에서 aliquots에 즉시 사용하거나 냉동. 필요에 따라 매 10 7 추출된 세포를 위해 100x 주식 1 μl을 계산합니다.
- 추출 절차를 수행하는 동안 모든 단계는 단백질의 안정성을 보장하기 위해 ° C 얼음 또는 4에서 수행해야합니다.
- 라벨 15 ML 팔콘 튜브 얼음에 장소.
- 세포에서 성장 미디어를 제거하고 차가운 PBS의 7.5 ML로 두 번 씻는다.
- 셀 리프터를 사용 판에서 각 요리와 자국 세포에서 차가운 PBS의 5 ML을 추가합니다. 냉장 15 ML 팔콘 튜브에 세포를 전송합니다.
- 5 분간 저속 (500x g, 4 ℃)에서 원심 분리기. 뜨는 제거와 비교하여 포장 셀 볼륨을 예상됩니다. (최대 250 μl 포장 셀 볼륨이 하나의 1.5 ML 관에서 처리할 수)
- 또 다른 하나 500x g에서 1 분 피펫으로 나머지 PBS를 제거를위한 원심 분리기. 150 μl NucBuster 추출 시약 1 당 50 μl 포장 셀 볼륨 : 포장 셀 볼륨의 크기에 따라 NucBuster 추출 시약 1 세포 펠렛을 Resuspend. (또는 세포 펠렛 드라이 아이스 또는 액체 질소로 급속 냉동이어야하며 ° C에서 준비까지 진행 -80에 저장된 수 있습니다.)
- 다시 정지 후 미리 냉장 1.5 ML 관에 lysate를 전송.
- 높은 5 분 빙판에 품어 속도, 및 와동 고속으로 다시 15 초 소용돌이 15 초.
- 4 ° C.에 15 분 13,000 XG에 원심 분리기
- 뜨는가 세포질 분획이 포함되어 있습니다. 제거하고 -80 ° C에서 저장 또는 폐기.
- 한 재 정지 100x 테아제 억제제 칵테일의 μl, 1 & m의 혼합물에 펠릿를 다시 중지U, 100 밀리미터 DTT와 50 μl 포장 셀 볼륨 당 75 μl NucBuster 추출 시약 2 리터.
- 고속으로 소용돌이 15 초은 높은 속도로 5 분간 얼음에 품어, 다시 와동 15 초.
- 4 ° C.에 15 분 13,000 XG에 원심 분리기 뜨는은 핵 단백질이 포함되어 있습니다. 뜨는 수집하고 다음 단계로 진행합니다.
2.4 투석, 단백질 양을 정함과 aliquoting
- 투석 과정 동안의 모든 단계는 추출물의 품질을 향상시키기 위해 미리 냉장 솔루션, 자료와 장비를 수행해야합니다.
- 표 3에 설명된대로 투석 버퍼 (샘플 당 필요한 1 패)을 준비합니다. 중요 : 버퍼 (4 ℃) 추운 있어야합니다. 우리는 적어도 하루 전에 준비하는 것이 좋습니다. 필터링 투석 버퍼는 4에 저장할 수 ° C에서 무기한 DTT가 추가되지 않은 경우.
- 사전 오한 비커 (샘플 당 2 1 L의 비커), 투석 버퍼, 투석 챔버, 마이크로 원심 분리기튜브, 주사기 및 바늘.
- 바로 직전에 사용 - 투석 버퍼의 리터당 1 ML 1 M DTT를 추가합니다.
- 4에서 90 분간 0.5 L 미리 냉장 투석 버퍼의 단계 2.3에서 준비 lysate를 Dialyze ° C 어다 슬라이드-A-Lyzer 투석 카세트를 (7,000 MW의 컷오프와 0.5-3 ML 투석 카세트)를 사용하여 부드럽게 저어과.
- 0.5 L 미리 냉장 투석 버퍼를 포함하는 두 번째 비커에 투석 카세트 전송과 4에서 90 분간 lysate를 dialyze ° C를 부드럽게 저어과 함께.
- 주사기를 사용하여 투석 카세트 (피셔, 고양이 # 309659)에서 dialyzed 핵 단백질 솔루션을 수집합니다. 투석 카세트로 단백질을 주입하기 위해 이전에 사용하는 것보다 다른 근육을 사용합니다. 추출물은 높은 단백질 농도에 의한 크리스털했을 수 있습니다. dialyzed 핵 단백질 용액을 제거 흐림보고 결정을 포함하도록하십시오.
- 마이크로 원심 분리기 튜브, 20 μl 각으로 나누어지는 샘플을. 드라이 아이스와 stor에 대한 빠른 동결-80에서 전자 ° C에서 사용까지.
- 표준 프로토콜을 사용 dialyzed 단백질의 농도를 결정합니다. 예상 핵 lysate의 농도의 예는 표 4에 표시됩니다.
- 마지막으로, lysates은 품질 관리에 대해 평가해야합니다. lysates의 평가는 실험과 다릅니다. 이전에 설명한 바와 같이, 우리는 정기적으로 immunoblot 1,2 통해 여러 BER 단백질의 표현을위한 lysates를 분석합니다.
- 투석 단계는 비교를 용이하게 세포 라인에 걸쳐 균일한 반응 솔루션을 만드는 데 사용됩니다. 소금 솔루션 및 반응 조건이 요구되는 다양한 dilutions로 인해 서로 다른 세포 라인과 준비에 더 이상 동일 때문에 투석 단계를 생략하는 것은 효소 요금과 운동 분석에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나보다 큰 5 μg / μl의 lysates을 사용하고 충분한 반응 버퍼를 추가하면 투석 단계 (데이터가 표시되지 않음)의 생략을 허용 않는 것으로 관찰되었습니다. 억제제 연구 일에 대한다른 세포 lysates 간의 비교를하지 않아도에서 투석이 필요하지 않을 수도 있습니다. 지적으로 그러나 투석을 권장합니다.
3. 분자 비컨 분석
3.1 장비 요구 사항
- 이러한 StepOnePlus qRT-PCR 또는 비교하거나, 실시간으로 식구들 형광을 감지하고 측정할 수있는 96 - 웰 플레이트 fluorometer 등 정량 실시간 PCR 기기. 참고 :이 절차를 비콘의 형광 값을 읽고 실시간으로 그들을 기록할 수있는 시스템에 적용됩니다. 기계 그러나, 사용자가 데이터 분석을위한 원시 형광 값을 액세스할 수 있도록해야합니다.
- 사용중인 광학 qRT-PCR 튜브 또는 플레이트와 호환 원심 분리기.
- Microsoft Excel에서는 데이터가 수집 분석할 수 있습니다.
3.2 버퍼 및 시약
- 광 qRT-PCR 튜브 또는 해당 커버가있는 접시.
- BER 반응 버퍼 (참조bove과 표 2).
- Dialyzed 핵 단백질은 단계 2.3 및 2.4에서 준비하고 DTT가 포함된 BER 반응 완충액으로 2 μg / μL 단백질로 희석 추출합니다.
- 분자 비콘은 분자 비콘 작업 솔루션 (위 참조) 만들 BER 반응 버퍼와 200 μm의로 희석.
3.3 분석 설정 (표 5)
- 실행 방법 변경해야하므로 qRT-PCR 기계는 일반적으로 fluorimeter로 사용되지 않습니다.
- 프로그램 첫 무대를 180 사이클 (또는 그 이상, 수리 분석 설계에 따라 다름)의 최소 20 초의 사이클 타임 (측정 시간 점)와 37 ° C로 반응 온도를 설정합니다. 주기 동안 데이터를 수집해야합니다. 따라서 기계는 1 시간 총 데이터마다 20 초 수거합니다.
- 특정 신호기의 티맥스으로 온도, 최대한의 형광과 온도, 경사로 그대로 억제하는 두 번째 단계 만들기단계 1.3 (분자 비콘의 품질 평가)에서 채굴. 사이클 시간은 다시 15 사이클 총 20 초이어야합니다. 이것이 신호기의 가능한 최대한의 형광에서 5 분 동안 데이터마다 20 초 수집합니다. 티맥스의주기 동안에 측정된 형광 값은 각도의 형광 값 (단계 4.2a)를 정상화하는 데 사용됩니다. 여러 가지 표지를 사용하는 경우 것은 또한 그 비콘의 티맥스 비슷한 반복적인 가치를 제공하는 단계를 포함해야합니다.
- 25 μL의 반응 볼륨을 설정합니다.
- 응용 Biosystems의 소프트웨어를 사용 qRT-PCR 시스템의 플레이트 디자인을 설정합니다. 실험 유형 - 우리가 오직 원시 형광 값에 관심이있다, 그래서 "표준 곡선"를 선택합니다.
- 플레이트 레이아웃을 작성합니다. 예제는 표 5에 표시됩니다. 표준 곡선 선정 우물에 아무 것도 추가하지 마십시오.
3.4 실행 분석
- 꼬마 도깨비ortant 사용 사전 냉장 소재 및 솔루션을 제공합니다. 실행 및 탐지 때까지 유지 해야죠.
- 사용되는 BER 반응 버퍼에 DTT의 적절한 금액을 추가합니다.
- BER 반응 버퍼를 (DTT가있는)를 사용하여 2 μg / μL의 농도에 단백질 용액을 희석.
- 초기 실험을 위해 우리는 10 dialyzed 핵 lysate의 μg 당 아니라 (물론 5 μL /) 및 기판 1 pmole, 40 nm의 최종 농도의 분자 신호를 (5 μL / 잘) 사용을 권장합니다. 그것이 다른 세포 lysates 또는 비컨 기판이 높거나 낮은 단백질 농도를 지시할 수도 있지만 우리는 지속적으로 높은 품질과 세포 lysate 10 μg과 재현성 결과를 획득했습니다.
- 각도의 분석 구성 요소는 15 μL BER 반응 버퍼, 5 μL 신호기 및 5 μL 핵 lysate입니다. 세중의 각 비컨 / lysate 조합을 실행합니다.
- 몇 가지 부정적인 컨트롤 등 25 & 같은 신호기없이 샘플을 포함하여 모든 신호기가 필요합니다무, 오직 BER 반응 버퍼, 5 μl lysate와 lysate없이 신호기의 5 μL와 BER 반응 완충액 20 μL있는 20 μl BER 반응 버퍼의 패.
- 여러 컨트롤 샘플은 각 원자력 lysate 필요합니다. 이러한 부정적인 제어 [15 μL BER 반응 버퍼, 5 μL 제어 신호 (아무 병변) 5 μL 시료 lysate]를 포함합니다. 우리는 또한 oligos를 포함하는 abasic 사이트를 모방하고 쉽게 [15 μL BER 반응 버퍼, 5 μL THF 신호와 5 μL 시료 lysate의]를 베인되는 비콘을 포함하는 THF의 포함과 같은 실험 긍정적인 컨트롤을 포함하도록 권장합니다. 물론, 정확한 긍정적인 컨트롤은 전체적인 실험 설계에 따라 달라집니다.
- 예를 들어, 플레이트 레이아웃을 위해 테이블 아래 5 따릅니다.
- 신호 검출되기 전에 반응 개시를 최소화하기 위해 얼음이나 냉각 스탠드에있는 동안 광학 튜브 또는 접시에 Pipet.
- 모든 우물에 첫번째 Pipet의 BER 반응 버퍼.
- N 개의 pipet 표지는 올바른 우물 항상 pipet으로 판 레이아웃에 따라 신호를 감지하기 전에 반응 개시를 최소화하기 위해 우물에 마지막 lysates.
- 인감 튜브 또는 판은 철저하게, 믹스 앤 튜브 또는 접시의 바닥에 대한 해결책을 수집하기 위해 원심 분리기 같이 해요
- qRT-PCR 기계에 플레이트를 삽입하고 분석을 시작합니다.
- 완료 후 Excel 형식으로 선호, 원시 데이터를 내보냅니다. StepOnePlus 시스템에 대해서만 다중 구성 요소 데이터가 필요합니다. 이것은 염료 색상과 잘으로 정렬 읽고 여러 번에 모든 형광 값을 포함하고 있습니다.
4. 분자 비컨 분석 분석
우리는이 분석하고 계산을 수행하기 위해 Microsoft Excel과 소프트웨어를 사용했습니다. 우리는 표준 96 - 웰 형식에서 파생된 데이터를 바탕으로 쉽고 빠른 분석 및 그래프 디스플레이를하실 수 수립 템플릿과 매크로를 권장합니다.
배경 4.1 제거
">4.2 층 (티맥스) 정상화
pipetting과 다른 우물의 형광 검출의 다양성을 해결하기 위해, 우리는 최대한의 형광 값 (신호기 입력와 연관 해당)로 데이터를 정상화.
- 층 (T 최대) (단계 3.3aii) : 잘 개별하기 위해 T 최대의 사이클의 평균 형광 값을 계산합니다.
- 비율 층 (사이클 X) / 층 (T 최대)를 계산 및 100으로 곱하면됩니다. 완전 베인 때 층 (T 최대값) 최대한 가능한 형광 값에 해당하는 가능성 가정하에,이 정규화된 데이터는 % 무료 식구들를 (= %의 BER 베인 컨) 나타냅니다.
- 매 사이클에서 3 개 우물의 데이터 (% 무료 식구들) (주기 180까지) 평균하여 세중의 샘플을 결합하고 각 오류를 계산합니다.
- 매 사이클 20 초를 곱하여 시간을 계산합니다.
- 형광 검출에 잘 - 투 - 잘 분산이 중요할 수 있으므로, 우리는 개별 우물을 다시 조정 형광 가치에 같은 표준 역할을 분자 비컨 주식 그러한 ROX 같은 형광 염료를 추가하는 것이 좋습니다. 이 경우에는 ROX의 염료가 잘마다 하나의 내부 표준 (수동 기준)로 사용됩니다. ROX여기 및 발광 스펙트럼은 (여기 - 588 nm의, 방사 608 nm의) 검정 (- 495 nm의, 방출 - 520 nm의 여기)에서 채용 6 식구들 염료와는 별개입니다. ROX 색소는 유물로 인해 발생할 수있는 잘 - 투 - 잘 차이점을 정상화 수 있도록 기존의 RT-PCR 절차와 유사한 정상화 단계를 사용합니다. 이러한 오류를 pipetting이나 형광 검출 효율에 잘 - 투 - 잘 변화에서 발생한 수도에서 비롯될 수도 있습니다.
4.3 플롯
- 해당 오류가있는 분산형 음모의 시간 (초)을 상대로 음모 표준화된 형광 데이터 (% 무료 식구들).
- 우리는 생물 학적 복제를 대표 적어도 세 가지 다른 핵 lysate를 준비에 수리 동력학을 분석하는 것이 좋습니다. 분산을 평가하기 위해 각 실험의 평균으로부터 계산된 상호 실험적 오류가 표시됩니다.
- 이 종양 세포 lysates의 대표 분석 : LN428, glioma메틸 purine DNA glycosylase (MPG)와 LN428/MPG, MPG의 높은 표현을 위해 설계 같은 세포 라인의 감지 수준 세포주, 두 세포 라인이 AP endonuclease 1 (APE1) 1,2의 동등한 레벨들을 가지고 있어요. 각 BER THF 분자 비컨 (그림 3)과 BER Hx 분자 비컨 (그림 4)를 사용 APE1 활동과 MPG 활동에 대한 탐지 곳 THF = tetrahydrofuran (APE1 용 기판) 및 Hx = hypoxanthine (MPG 용 기판) . 참고 : LN428 lysates에 비해 그림 3 (THF 기판)에서 LN428/MPG lysates의 결과가 낮은 최대 절대 형광을 보여줍니다. 이것은 티맥스 값 (3.3a 참조)을 사용하여 결정 낮은 비콘 입력 값의 결과입니다. 이 낮은 값을 결과를 정상화하는 데 사용되었을 때, 그것은 줄거리의 큰 변화에 대한 결과입니다. 이것은 멋지게 데이터를 정규화의 중요성을 보여줍니다. 혼자 절대 형광 값을 세우고있는 것은 repa을 제안LN428와 LN428/MPG 세포 사이의 IR 요금이 다릅니다. 그러나 데이터가 잘 - 투 - 잘 다양성을 고려하는 정상화되면 APE1-매개 수리 속도 차이가 최소한으로 표시됩니다.
5. 대표 결과
우리는 기본 절단 수리 (BER) 분자 비콘 (그림 1)을 사용하여 DNA를 glycosylase 및 세포 핵 lysates의 에이피 endonuclease 활동의 양적, 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 일단 annealed, 우리는 분자 비콘의 품질 평가 (그림 2)로 용해 곡선 분석 (표 1)을 수행하는 것이 좋습니다. 핵 lysates 다음 표 2에 나와있는 버퍼 구성 요소를 사용, 준비가 될 수 있습니다. 4에서 90 분간 0.5 L 미리 냉장 투석 버퍼의 lysate를 Dialyze ° C 표 3에 나열된 투석 버퍼로부터 카메 슬라이드--Lyzer 투석 카세트를 사용하여 부드럽게 저어과. 를 수집주사기를 사용하여 투석 카세트에서 dialyzed 핵 단백질 솔루션입니다. 투석 카세트로 단백질을 주입하기 위해 이전에 사용하는 것보다 다른 근육을 사용합니다. 표준 프로토콜을 사용 dialyzed 단백질의 농도를 결정합니다. 예상 핵 lysate의 농도의 예는 표 4에 표시됩니다. 표 5와 같이 플레이트 레이아웃을 사용하여 (단계 3.4) 위에 명시된대로 반응을 실행합니다. 두 세포 라인이 AP의 동등한 수준을 가지고, LN428, 메틸 purine DNA glycosylase (MPG)와 LN428/MPG, MPG의 높은 표현을 위해 설계 같은 세포 라인의 감지 수준 glioma 세포주 두 개의 종양 세포 lysates의 대표적인 분석 endonuclease 1 (APE1) 1,2. 각각 THF = tetrahydrofuran (APE1 용 기판) 및 Hx가 = hypoxanthine BER THF 분자 비컨 (그림 3)과 BER Hx 분자 비컨 (그림 4)를 사용 APE1 활동과 MPG 활동에 대한 탐지되었습니다(MPG 용 기판). 마지막으로, uracil의 glycosylase 활동에 대한 보고서, 저 신호 출력 또는 신호 강도가 단백질 10μg에서 최대한이며 단백질의 0.62 μg (그림 5)에서 감지 수준으로 감소 표시되는 BER DU / 분자 신호를 사용합니다.
1 그림. BER 분자 비컨의 전체 구조. 표시는 어닐링 후 다시 용해 후, 시퀀스와 단일 좌초된 분자로 본 사용 BER 분자 비콘의 전반적인 디자인입니다. 시퀀스의 굵게, 기울임꼴 부분은 줄기 (15베이스)이고 순서의 밑줄 부분은 루프 (13베이스)입니다. 우리 식구들 = 5 '형광 색소 6 Carboxyfluorescein [5'end에; Abmax = 495 nm의, Emmax = 520 nm의, 흡광 계수 (260 nm의) : 20,960, 흡광 계수 (흡광도 최대시) : 75,000] 및 Dabcyl = 3 '담금질 대리인 DAB cyl [3'end에; Abmax = 453 nm의; 담금질 범위 = 425-520 nm의] X = 병변 (연구 질문에 따라 다름)와 Y 병변 반대 =베이스 (연구 문제에 따라 다릅니다.) .
그림 2. 대표 용융 곡선은 () BER 분자 비컨 컨트롤에 대해서만 표시됩니다. 곡선을 녹일하고, tetrahydrofuran (THF) 잔기 (B) 또는 Hypoxanthine (Hx) 잔기 (C)를 포함하는 BER 분자 비콘. Oligonucleotide 농도 128 NM (주황색)에 푸른 0 NM (진한 파란색), 8 nm의 (적색), 16 NM (녹색), 32 NM (보라색), 64 NM에서 원거리. 와 같은 단계 1.3에서 설명한 annealed oligonucleotides은 25에서 가열되었다 ° C ~ 95 ° C에서 0.5 ° C 간격과 StepOnePlus 시스템이 각각 0.5 ° C 간격으로 식구들 형광을 측정하도록 프로그램되어있다.
그림 3. BER THF 분자 신호를 사용하는 대표적인 데이터는. abasic 사이트 아날로그 tetrahydrofuran (THF)의 가수 분해에 대한 구체적인 에이피 endonuclease 활동 제어 세포주 (LN428)와 MPG 과잉 발현 세포주 (LN428/MPG)에서 핵 lysates로 측정되었다 . 또는 BER THF 분자 비컨 (파란색 LN428; LN428/MPG, 빨강), 각각의 lysate는 어느 BER 분자 비컨 컨트롤 (LN428/MPG, 보라색 LN428, 녹색)를 사용하여 분석되었다. 결과로보고됩니다 (A) 평균 형광 반응 단위와 (B) 상기 4 항 (THF = tetrahydrofuran)에 설명된대로 비콘 입력에 정상화 동일한 데이터입니다.
4 그림. MPG 기판 H의 제거를위한 BER Hx 분자 표지의 DNA glycosylase 활동이 특정 사용하는 대표적인 데이터ypoxanthine (Hx)은 제어 세포주 (LN428)와 MPG 과잉 발현 세포주 (LN428/MPG)에서 핵 lysates로 측정되었다. 또는 BER Hx 분자 비컨 (파란색 LN428; LN428/MPG, 빨강), 각각의 lysate는 어느 BER 분자 비컨 컨트롤 (LN428/MPG, 보라색 LN428, 녹색)를 사용하여 분석되었다. 결과로보고됩니다 (A) 평균 형광 반응 단위와 (B) (Hx = hypoxanthine) 위의 섹션 4에서 설명한 정상화 동일한 데이터입니다.
그림 5. BER DU / 다른 단백질 수준에서 분자 신호를 사용하는 대표적인 데이터입니다. uracil의 제거 (DU /)에 대한 구체적인 DNA를 glycosylase (엉) 활동은 T98G 세포에서 핵 lysates로 측정되었다. T98G의 lysate은 10 단백질 수준, 5, 2.5, 1.25 또는 0.62 μg에서 BER 분자 비컨 제어하거나 BER DU / 분자 비컨을 사용하여 분석되었다로서 F에 표시된igure. 결과는 상기 4 항에서 설명한 정규화된 데이터입니다.
| 비컨의 농도 (NM) | 0 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 |
| 분자 비컨 작업 용액 (200nM) 부가 (μL) | 0 | 일 | 2 | 4 | 8 | 16 |
| BER 반응 버퍼 (W / O DTT) (μL) | 25 | 24 | 23 | 21 | 17 | 9 |
표 1. 용해 곡선 실험의 레이아웃.
| 1 패 계 | 증권 솔루션의 볼륨이 필요 | 콘. 증권 솔루션 | 최종 콘. |
| HEPES-코이 | 25 ML | 1M pH7.8 | 25 MM </ TD> |
| KCl | 75 ML | 2 M | 150 MM |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 한 ML | 0.5M pH8.0 | 0.5 MM |
| 글리세린 | 10 ML | N / A | 1퍼센트 |
| DTT (사용하기 전에 추가) | 0.5 ML | 1 M | 0.5 MM |
| H 2 O | 888.5 ML | N / A | N / A |
표 2. BER 반응 버퍼.
| 1 패 계 | 증권 솔루션의 볼륨이 필요 | 콘. 증권 솔루션 | 최종 콘. |
| HEPES-코이 | 50 ML | 1M pH7.5 | 50 MM |
| KCl | 50 ML | 2 M | 100 MM |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 한 ML | 0.5M pH8.0 | 0.5 MM |
| 글리세린 | 200 ML | N / A | 20% |
| DTT (사용하기 전에 추가) | 한 ML | 1 M | 1 ㎜ |
| H 2 O | 698 ML | N / A | N / A |
표 3. 투석 버퍼.
| 세포주 | 단백질 농도 (μg / μL) |
| LN428 | 5.34 |
| LN428/MPG | 4.79 |
표 4. 단백질 결정의 결과입니다.
| 음성 제어 25μL BER 버퍼 | (배경 제어) 20μL BER 버퍼 5μL 콘 비컨 어떠한 lysate 없음 | (삼배하다의 시험) <BR /> 15μL BER 버퍼 5μL 콘 비컨 5μL LN428 Lysate | (삼배하다의 시험) 15μL BER 버퍼 5μL 콘 비컨 5μL LN428/MPG Lysate |
| 음성 제어 25μL BER 버퍼 | (배경 제어) 20μL BER 버퍼 5μL THF 비컨 어떠한 lysate 없음 | (삼배하다의 시험) 15μL BER 버퍼 5μL THF 비컨 5μL LN428 Lysate | (삼배하다의 시험) 15μL BER 버퍼 5μL THF 비컨 5μL LN428/MPG Lysate |
| 음성 제어 20μL BER 버퍼 5μL lysate | (배경 제어) 20μL BER 버퍼 5μL Hx 비컨 어떠한 lysate 없음 | (삼배하다의 시험) 15μL BER 버퍼 5μL Hx 비컨 5μL LN428 Lysate | (삼배하다의 시험) 15μL BER 버퍼 5μL Hx 비컨 5μL LN428/MPG의 LY물리게하다 |
| 음성 제어 20μL BER 버퍼 5μL lysate |
표 5. 분자 비컨 분석 설정.
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Discussion
수많은 분자와 helicase 활동 6의 DNA 중합 효소 활동 7,8, DNA ligase 활동 9, telomerase 활동 10, DNA photolyase 활동 11 DNA를 /을 포함하여 효소 활동을 감지하고 quantifying에 대한 용어는 '분자 비컨'를 사용하여 600 인용 이상있다 많은 사람 중에서 하이브리드 12, RNA. 위에 나열된 DNA의 복구 활동의 측정을위한 분자 비콘의 사용 이외에, 우리와 다른 BER 활동 1,2,13-15의 분석에 대해 이러한 프로브의 유틸리티를 증명하고있다.
우리가 여기에서 설명하는 실시간 BER 활동 분석은 단일 수정된베이스를 통합하고 병변 반대 자료의 다른 병변 또는 변경에 대한 BER 속도의 양적 평가 수 있도록합니다. 응용 프로그램은 분자 기계론의 연구에서 억제제 화면에 이르기까지 다양합니다. 우리는 lysa을 비교하여 BER의 특이성을 증명MPG에서 오셨이 아닌 표현 셀 및 컨트롤 신호의 활동의 부족으로 세포를 표현. 검정은 BER 단백질 MPG 2 XRCC1 1 표현의 결함 감지하므로 매우 민감하고 [준비 원고] 미성년자의 DNA 수리 운동 매개 변수의 변화와 DNA 수리 억제제의 효능을 발견하기에 충분합니다. 복수는 운동 속도와 그 운동 속도에 변화의 중요성을 계산 활성 수리 시간에 걸쳐 지원을 읽습니다. BER 분자 비콘 분석 따라서 DNA 수리 효소 억제제 (억제제 화면) 또는 개별 핵 부품의 역할에 대한 연구를위한 화면으로 높은 처리량 연구에 적합합니다. 핵 lysates의 분석은 BER 복합의 전체 맥락에서 DNA 수리의 평가는 따라서도 BER 기계 (예, 사후 번역 변경 또는 돌연변이)에 대한 간접적인 변경이나 영향을 묘사한 있습니다.
프로토콜은 설명한 바와 같이, 높은 재현성과 정량 결과를 얻을 수 있습니다. 그러나, 적절한 분석을 보장하기 위해 고려해야 할 몇 가지 세부 사항이 있습니다 : (1) 부정적인 컨트롤의 배경 값이 너무 높이들 : 이것은 잘못 보관하거나 Oligonucleotide의 제조가 원인일 수 있습니다. 비콘없이 lysates에서 높은 배경 값은 혼란함을 주죠 자동 형광을 (오염 또는 외인성 형광 단백질의 세포 표현하여 IE) 나타냅니다. 형광 단백질의 표현이 불가 피한 경우 기자 염색 및 형광 단백질에 대한 여기 / 방출 스펙트럼이 중복되지 않을 수 있습니다 (2) 층 (티맥스)이 낮을 : DNA 농도는 주어진 것보다 다릅니다. Nanodrop를 사용하여, 예를 들어 분광 광도법에 의한 DNA 농도 (OD 260nm)를 확인합니다. 낮은 층 (티맥스)와 높은 DNA 농도는 비콘의 부족 식구들 로딩을 나타냅니다. HPLC 정제는 수정되지 않은 DNA (위 참조)의 오염을 방지 (3) 수리 활동은 가난한 사람입니다 층 (티맥스) 값의 경우마지막 사이클 충분한 비컨 입력 및 형광 검출을 나타내는,이 핵 추출물 준비에 실패하는 것이 좋습니다 수도 있습니다. 핵 추출물 품질이 중요합니다. 사전 분석으로 실내 온도에 샘플에도 매우 짧은 노출 수리를 시작합니다 : 낮은 온도 장기 보관 -80에서 ° C와 (4) 복구 활동 곡선 높은 값으로 시작하는을 포함하여 절차를 걸쳐 보장되어야한다. 항상 유지 해야죠.
이것은 매우 민감하고 정량 BER 분석도 그에 따라 분자 비콘을 변경하여 기판 특이성에 대한 연구를 활성화, 단백질 정제의 분석에 적용됩니다. 마지막으로, 분석은 우리가 alkylating 에이전트 temozolomide 2 PARP1 억제제 potentiation에 대한 종양을 평가를 위해 제안된 것처럼, 응답 또는 치료 효능의 생체 자료로서 기능적 DNA를 복구 끝점을 측정할 수있는 기회를 제공하고, 종양 및 조직 lysates의 분석에 적용됩니다.
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Disclosures
RWS는 Trevigen 주식 저자의 다른 관심사 아무런 충돌이 없다는 것을 선언에 대한 과학적인 컨설턴트이다.
Acknowledgments
RWS이 작품은 피츠버그 재단과 국립 연구소 건강 (NIH) [; CA148629 ES019498 GM087798]에서 교부금에 의해 지원되었다. UPCI Lentiviral 시설에 대한 지원은 국립 보건원에서 암 센터 지원 그랜트에 의해 RWS에게 제공한 [P30 CA047904]. 지원은 또한 피츠버그 대학 약리학 계열 및 DS에 대한 화학 생물학에 의해 제공되었다. 지원은 또한 이력서에 ESTRO에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
- Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
- Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
- Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
- Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
- Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
- Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
- Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
- Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
- Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
- Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
- Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
- Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
