Summary
We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in cel nucleaire lysaten. De test levert de tarieven van de DNA-reparatie-activiteit vatbaar zijn voor kinetische analyse en is aanpasbaar voor de kwantificering van DNA Repair activiteit in weefsel en tumor lysaten of met gezuiverde eiwitten.
Abstract
We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in celkernen lysaten met behulp van base excisie reparatie (BER) moleculaire bakens. Het substraat (baken) bestaat uit een deoxyoligonucleotide met een base laesie met een 6-carboxyfluoresceïne (6 FAM) groep geconjugeerd aan het 5'-uiteinde en een Dabcyl groep geconjugeerd aan het 3'-uiteinde van het oligonucleotide. De BER moleculaire baken is 43 basen lang en de sequentie is ontworpen om de vorming van een lusstructuur stam-met 13 nucleotiden in de lus en 15 basenparen in de steel 1,2 bevorderen. Wanneer gevouwen deze configuratie de 6-FAM groep gedoofd door Dabcyl een niet fluorescerende wijze via Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 3,4. Het letsel is zodanig dat na base laesie verwijderen en onderdeel splitsing de resterende 5 base oligonucleotide met de 6-FAM groep vrijkomt van de steel. Laat eennd onthechting van de quencher (Dabcyl) resulteert in een toename van de fluorescentie die evenredig is aan het niveau van DNA-herstel. Door het verzamelen van meerdere leest van de fluorescentie waarden, real-time beoordeling van de BER-activiteit is mogelijk. Het gebruik van standaard kwantitatieve real-time PCR-instrumenten maakt de gelijktijdige analyse van een groot aantal monsters. Het ontwerp van deze BER moleculaire bakens, met een enkele base laesie, vatbaar is voor kinetische analyses, BER kwantificering en validatie-remmer en is aangepast voor de kwantificering van DNA-reparatie-activiteit in het weefsel en tumor cellysaten of met gezuiverde eiwitten. De analyse van de groepsvrijstellingsverordening activiteit in de tumor lysaten of weefsel zuigt het gebruik van deze moleculaire beacons van toepassing kunnen zijn om functionele biomarker-metingen. Verder is de analyse van de BER activiteit met gezuiverde eiwitten met behulp van deze kwantitatieve test voor een snelle, high-throughput methode voor de identificatie en validatie van de BER-remmers.
Protocol
1. Molecular Beacon Ontwerp
1.1 Het ontwerpen en bestellen van uw moleculair beacon
Het ontwerp van uw moleculair beacon moet rekening houden met het volgende:
- We hebben goede resultaten met 43-mer DNA-oligonucleotiden. De GC-inhoud moet> 32% zijn. Uitsluiten G base aan het 5 'uiteinde.
- Aanvraag 6 FAM (6 carboxyfluoresceïne) conjugatie aan het 5 'uiteinde en Dabcyl als 3' modificatie.
- De positie van de laesie moeten op basis # 6 van het 5 'uiteinde.
- De lengte van de stengel of haarspeld duplex moet een minimum van 15 bp zijn.
- De aanbevolen loop lengte is 13 basen.
- De algemene structuur van het baken is zoals weergegeven in figuur 1.
- Zodra de volgorde en de laesie-type wordt besloten, kan de oligonucleotide worden besteld bij de meeste Oligonucleotide bedrijven. We bestellen onze oligonucleotiden van IDT en verzoeken dat de oligonucleotiden zijn HPLC gezuiverd en provided als een poeder of in droge vorm.
1,2 Gloeien uw moleculair beacon
- Los gevriesdroogde DNA-oligonucleotiden in Oligo verdunning buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) tot een geconcentreerde Molecular Beacon Stock oplossing van 40 pM geven.
- Bereid een 200 nm Molecular Beacon werkende oplossing van de 40 uM Molecular Beacon stockoplossing met behulp van de BER reactie buffer (zie hieronder). Voeg de 200 nM Molecular Beacon werkende oplossing in een steriele zwart 1,5 ml buis.
- Incubeer de buis met 200 nM Molecular Beacon werkende oplossing in een bekerglas grote kokend water gedurende 3 minuten.
- Na 3 minuten, neem het bekerglas van de warmtebron en incubeer de Molecular Beacons in het water 's nachts te gloeien te bevorderen. Gebruik warmte-isolerende materiaal zowel boven als onder het bekerglas de koeling vertragen.
- Aliquot Beacons in steriele zwart 1,5 ml buizen, 100 ul van elke buis.
- Bewaren bij -30 ° C.
1.3 Kwaliteit beoordeling van uw moleculaire beacon
- Voer een smelt curve analyse te bevestigen dat de groepsvrijstellingsverordening moleculaire beacons niet fluoresceren tot het verwarmd zijn, om de optimale smelttemperatuur te bepalen en om te bevestigen dat elk baken zal fluoresceren bij verhitting.
- Voor elk baken het aangegeven volume van 200 nM Molecular Beacon werkende oplossing en BER reactiebuffer toevoegen, zoals aangegeven in tabel 1, 6 putjes van een snelle optische plaat met 96 putjes (Applied Biosystems, Cat # 4346906).
- Gebruik een real-time PCR-instrument, zoals de StepOnePlus (Applied Biosystems)-systeem aan of overeenstemt met FAM-kleurstof excitatie volgen tijdens de smelt curve analyse.
- Programmeer uw real-time PCR instrument (StepOnePlus systeem) om FAM kleurstof excitatie te volgen als functie van de stijgende temperatuur in kleine stappen voor smelt curve analyse. Het StepOnePlus systeem is geprogrammeerd om FAM meten fluorescerenNVU en de helling van 25 ° C tot 95 ° C in 0,5 ° C af. Een typische smelt curve is weergegeven in figuur 2.
- Weinig of geen fluorescentie achtergrond zichtbaar moet bij temperaturen beneden 50 ° C. Controleer of er een uniforme en sterke stijging van de fluorescentie, indicatief voor zuivere en hoge kwaliteit bakens. Tm waarden 60 ° C tot 80 ° C gunstig en moeten gelijk zijn voor alle verdunningen.
- Bepaal T max, de temperatuur bij maximale fluorescentie [Fl (max)] waarden, van deze analyse. De evenredigheid van de fluorescentie waarden T m of T max het baken ingang (de concentratie) moet lineair. De fluorescentie waarde Tmax, Fl (max) dient dan achtergrond waarden bij 37 ° C van ten minste 5-voudige.
2. Nucleaire Lysate Voorbereiding
2.1 Base Excisie Reparatie reactiebuffer 5 voorbereiding
- Voeg alle genoemde componentenin tabel 2 en Om het volume van de buffer 900 ml met DDH 2 O.
- Pas de pH tot 7,8 met behulp van Kaliumhydroxide 8,0 N (Sigma, Cat # 17-8).
- Om het volume van de buffer tot 1000 ml met DDH 2 O.
- Filter de buffer met behulp van 0,22 urn filter, Nalgene 1 L-filter (cat # 167-0020).
- Voeg meteen Dithiothreitol (DTT) voordat u de BER reactie Buffer.
2,2 cel cultuur en celisolatie
- Er wordt voorgesteld om de cultuur cellen tot 90-100% samenvloeiing. Isoleer de cellen vier tot zes gerechten (150 mm) om voldoende nucleaire lysaat te verkrijgen voor een volledige set van analyses (ongeveer 5 x 10 7 cellen totaal).
- Het is aangeraden om 3 onafhankelijke culturen voor 3 onafhankelijke celpellets voor te bereiden op het verkrijgen biologische replicatieonderzoeken bij elke analyse.
- Nucleaire lysaten worden gemakkelijk bereid met behulp van de NucBuster isolatieprocedure (EMD bio-Calbiochem Cat # 71183-3) ALTHdoorgedreven eventuele nucleaire isolement protocol passend zou zijn (zie hieronder, paragraaf 2.3.).
2.3 Nucleaire lysaat voorbereiding
- Voorafgaand aan wordt een gelyofiliseerde Proteaseremmer Cocktail (Calbiochem, Cat # 539131, Set 1) eerste geresuspendeerd in 100 ul steriel water 100x voorraad te bereiden. Gebruik direct of in porties invriezen bij -20 ° C voor langdurige opslag. Bereken 1 pi van het 100x voorraad elke 10 7 geëxtraheerd cellen nodig.
- Alle stappen tijdens de extractie procedure moet worden uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C eiwit stabiliteit.
- Label 15 ml Falcon buizen en leg ze op ijs.
- Verwijder de groeimedia van cellen en was twee keer met 7,5 ml koud PBS.
- Voeg 5 ml koud PBS bij elk gerecht en schraap cellen van de plaat met behulp van een cel lifter. Breng cellen de gekoelde 15 ml Falcon buis.
- Centrifugeer bij lage snelheid (500x g, 4 ° C) gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatanten schat de hematocriet in vergelijking. (Tot 250 ul hematocriet kunnen worden verwerkt in een 1,5 ml buis)
- Centrifuge voor een andere 1 minuut bij 500x g en verwijder de resterende PBS met een pipet. Resuspendeer de celpellet in NucBuster Extractie Reagens 1 volgens de grootte van de hematocriet 150 pi NucBuster Extractie Reagens 1 per 50 pi hematocriet. (Alternatief kan de celpellet diepgevroren op droogijs of met vloeibare stikstof en bij -80 ° C tot gebruik plaatsvinden).
- Na resuspensie, over te dragen lysaat een vooraf gekoelde 1,5 ml buis.
- Vortex 15 sec bij hoge snelheid incuberen op ijs gedurende 5 minuten en vortex opnieuw 15 sec bij hoge snelheid.
- Centrifugeer bij 13.000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Supernatant bevat cytoplasmatische fractie. Verwijder en bewaar bij -80 ° C of te verwijderen.
- Resuspendeer de pellet in een mengsel van 1 pl geresuspendeerd 100x Proteaseremmer cocktail, 1 en mu; l van 100 mM DTT en 75 ul NucBuster Extraction reagens 2 per 50 ul hematocriet.
- Vortex 15 sec bij hoge snelheid incuberen op ijs gedurende 5 minuten en weer vortex 15 sec bij hoge snelheid.
- Centrifugeer bij 13.000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Supernatant bevat nucleaire eiwitten. Verzamel supernatant en ga verder met de volgende stap.
2,4 Dialyse, eiwit kwantificering en aliquoting
- Alle stappen tijdens de dialyse procedure moet worden uitgevoerd met pre-gekoelde oplossingen, materialen en apparatuur om extract kwaliteit te waarborgen.
- Bereid dialyse buffer (1 L nodig per monster) als aangegeven in tabel 3. Belangrijk: Buffer moet koud (4 ° C). We raden aan het voorbereiden op zijn minst de dag ervoor. Gefilterde dialyse buffer kan worden bewaard bij 4 ° C onbeperkt als DTT zijn toegevoegd.
- Pre-chill bekers (2 van 1 L bekers per monster), dialyse buffer, dialyse kamers, micro-centrifugebuizen, spuiten en naalden.
- Vlak voor het gebruik - Voeg 1 ml 1 M DTT per liter van de dialyse buffer.
- Dialyze het lysaat bereid in stap 2.3 in 0.5 L voorgekoelde dialyse buffer gedurende 90 minuten bij 4 ° C onder zacht roeren met een Pierce Slide-A-Lyzer dialyse cassette (0.5-3 ml dialyse cassettes 7.000 MW afsluiting).
- Overdracht dialyse cassette een tweede beker met 0,5 L voorgekoelde dialysebuffer en dialyze lysaat gedurende 90 minuten bij 4 ° C onder zacht roeren.
- Verzamel de gedialyseerd nucleaire eiwit-oplossing uit de dialyse cassette met een injectiespuit (Fisher, kat # 309659). Gebruik een andere pakking dan voorheen gebruikt om het eiwit te injecteren in de dialyse cassette. Merk op dat het extract kan door eiwitrijke concentraties gekristalliseerd. Probeer bewolkt op zoek kristallen bij het verwijderen van het gedialyseerde nucleaire eiwit-oplossing op te nemen.
- Aliquot het monster aan micro-centrifuge buizen, 20 ui per stuk. Snel bevriezing van droog ijs en opslage bij -80 ° C tot gebruik.
- Bepaal de concentratie van het gedialyseerde eiwit met behulp van standaard protocollen. Voorbeelden van verwachte nucleaire lysaat concentraties zijn weergegeven in tabel 4.
- Ten slotte moet lysaten worden geëvalueerd voor kwaliteitscontrole. Beoordeling van de lysaten zal variëren met het experiment. Zoals eerder beschreven, regelmatig analyseren lysaten expressie van meerdere BER eiwitten via immunoblot 1,2.
- De dialyse stap wordt gebruikt om een uniforme reactie oplossing te over de cellijnen voor vergelijkingsdoeleinden. Het weglaten van de dialyse stap van invloed kunnen zijn enzymatische tarieven en kinetische analyse, omdat het zout oplossingen en reactie-omstandigheden zijn niet meer identiek in de verschillende cellijnen en preparaten als gevolg van de vereiste verschillende verdunningen. We hebben echter vastgesteld dat met lysaten van meer dan 5 pg / pl en een voldoende reactiebuffer is weglating van de dialyse stap (gegevens niet getoond) toe. Voor remmer studies eop geen vergelijking tussen de verschillende cellysaten vereisen, kan dialyse niet vereist. Toch raden wij dialyse zoals aangegeven.
3. Molecular Beacon Assay
3.1 Voorschriften inzake de uitrusting
- Een kwantitatieve real-time PCR-instrument, zoals StepOnePlus qRT-PCR of vergelijkbaar, of een 96-wells plaat fluorometer in staat op te sporen en FAM fluorescentie te meten in real-time. Opmerking: Deze procedure is van toepassing op elke machine in staat om de fluorescentie waarden van de bakens te lezen en ze op te nemen in real-time. De machine moet echter, kan de gebruiker de ruwe fluorescentie waarden voor data-analyse te openen.
- Centrifugeer compatibel met optische qRT-PCR-buizen of platen worden gebruikt.
- Microsoft Excel voor het analyseren van gegevens verzameld.
3,2 Buffers en reagentia
- Optische qRT-PCR buizen of platen met bijbehorende kleppen.
- BER reactie buffer (zie eenBove en tabel 2).
- Gedialyseerd nucleaire eiwitextracten zoals bereid in stap 2.3 en 2.4 en verdund tot 2 mg / ul eiwit met BER reactiebuffer die DTT.
- Moleculaire Beacons verdund met 200 pM BER reactiebuffer de Molecular Beacons werkende oplossing (zie boven) te maken.
3,3 test set-up (tabel 5)
- De qRT-PCR machine wordt normaal gesproken niet gebruikt als een fluorimeter dus de run methode moet worden veranderd.
- Programma een eerste fase en stel de reactietemperatuur tot 37 ° C met een cyclustijd (tijd van de metingen) van 20 seconden met een minimum van 180 cycli (of meer, afhankelijk van de reparatie testontwerp). Zorg ervoor dat u gegevens te verzamelen tijdens de cycli. Daarom zal de machine verzamelen elke 20 seconden voor een totaal van 1 uur.
- Maak een tweede fase dat de laadbruggen de temperatuur tot Tmax van de bijzondere baken, de temperatuur met maximale fluorescentie, zoals af te schrikkenbepaald in stap 1.3 (Quality beoordeling van uw moleculair beacon). De cyclustijd mag weer 20 sec met een totaal van 15 cycli. Dit verzamelen 20 seconden gedurende 5 minuten bij de maximale fluorescentie mogelijk het baken. De fluorescentie gemeten waarden in de cycli bij Tmax wordt gebruikt om de fluorescentie waarden in elk putje (stap 4.2a) normaliseren. Bij gebruik van verschillende bakens moet u stappen die soortgelijke repetitieve waarden voor de Tmax van die bakens kan leveren, en op te nemen.
- Stel het reactievolume van 25 pi.
- Set-up de plaat ontwerp op de qRT-PCR-machine met de Applied Biosystems de software. We zijn alleen geïnteresseerd in het ruwe fluorescentie waarden, dus selecteer de "Standard Curve" - experiment type.
- Vul de plaat lay-out. Een voorbeeld is weergegeven in tabel 5. NIET iets toe aan de wells geselecteerd als de standaard curve.
3.4 Run-test
- Kabouterortant: Gebruik pre-gekoelde materialen en oplossingen. Koel bewaren tot run en detectie.
- Voeg passende hoeveelheid DTT de BER reactiebuffer worden gebruikt.
- Verdun eiwitoplossing tot een concentratie van 2 pg / pl gebruikt BER reactiebuffer (met DTT).
- Voor de eerste experimenten suggereren 10 pg gedialyseerd nucleaire lysaat per putje (5 ul / putje) en 1 pmol van substraat, de moleculaire baken 40 nM eindconcentratie (5 ul / putje) gebruikt. Wij hebben steeds verkregen hoge kwaliteit en reproduceerbare resultaten met 10 ug cellysaat, hoewel het mogelijk dat verschillende cellysaten of baken substraten kan vereisen hogere of lagere eiwitconcentraties.
- De test componenten in elk putje zijn 15 ul BER reactie buffer, 5 pi baken en 5 ul nucleaire lysaat. Run elk baken / lysaat combinatie in drievoud.
- Een aantal negatieve controles nodig zijn voor elke baken, met inbegrip van monsters zonder baken, zoals 25 &mu, L BER reactiebuffer alleen, en 20 pi BER reactiebuffer met 5 pi lysaat en 20 pi BER reactiebuffer met 5 pi baken zonder lysaat.
- Verschillende controlemonsters voor elke kern lysaat. Deze omvatten een negatieve controle [15 ul BER reactie buffer, 5 ul controle baken (geen letsel) en 5 ui sample lysaat]. We raden u ook aan experimentele positieve controles, zoals het opnemen van THF met bakens die abasic site met oligo's na te bootsen en worden gemakkelijk ingesneden [15 ul BER reactie buffer, 5 pi THF baken en 5 ul monster lysaat] op te nemen. Uiteraard zal de precieze positieve controle afhangen van de totale experimentele ontwerp.
- Als voorbeeld volgen tabel 5 hieronder voor de plaat lay-out.
- Pipetteer in de optische buizen of platen, terwijl op ijs of gekoelde stand om de reactie te minimaliseren initiatie voor signaal detectie.
- Pipet BER reactiebuffer eerst in alle putten.
- De n pipet bakens op basis van de plaat in de juiste lay-out putten en altijd pipet lysaten laatste in putten om de reactie te minimaliseren initiatie voor signaal detectie.
- Seal buizen of platen grondig mengen en draaien met een centrifuge oplossingen verzamelen op de onderzijde van de buizen of platen
- Plaats de plaat in qRT-PCR-machine en begint test.
- Na voltooiing, exporteren ruwe gegevens, bij voorkeur in Excel-formaat. Voor de StepOnePlus systeem alleen meerdere componenten gegevens nodig. Dit bevat de fluorescentie waarden op de verschillende leest gesorteerd kleurstof kleur en goed.
4. Molecular Beacon Assay Analyse
We gebruikten Microsoft Excel software om deze analyses en berekeningen uit te voeren. Wij raden aan tot vaststelling van sjablonen en macro's die gemakkelijk en snel analyses en grafiek geeft zal gebaseerd op de gegevens van de standaard 96-well formaat.
4.1 Verwijdering van Achtergrond
">4.2 Fl (Tmax) normalisatie
Om de variabiliteit in pipetteren en fluorescentie detectie in verschillende putten aan te pakken, we normaliseren de gegevens naar de maximale fluorescentie waarden (die correleren met baken ingang).
- Bereken de gemiddelde fluorescentie waarden cycli bij Tmax de afzonderlijke en: Fl (Tmax) (stap 3.3aii).
- Bereken de verhoudingen Fl (cyclus x) / Fl (T max) en vermenigvuldig dat met 100. Onder de waarschijnlijke veronderstelling dat Fl (T max) komt overeen met de maximaal mogelijke fluorescentie waarde wanneer deze volledig ingesneden, deze genormaliseerde gegevens vertegenwoordigen% gratis FAM (=% BER ingesneden baken).
- Combineer het drievoud monsters door het gemiddelde van de gegevens (% vrij FAM) van de 3 putten voor elke cyclus (cyclus tot 180) en bereken fouten op elk.
- Bereken keer vermenigvuldigen 20 sec bij elke cyclus.
- Sinds de well-to-well variantie in de fluorescentie detectie kan aanzienlijk zijn, raden we aan om een fluorescerende kleurstof, zoals ROX toe te voegen aan de moleculaire beacon voorraad die dient als standaard worden bijgestuurd fluorescentie waarden van de afzonderlijke putten. In dit geval zou de ROX kleurstof worden gebruikt als een interne standaard (passieve referentie) in elk goed. ROXexcitatie-en emissiespectra (excitatie - 588 nm, 608 nm emissie) verschilt van die van de 6-FAM kleurstof gebruikt in de assay (excitatie - 495 nm, emissie - 520 nm). De ROX kleurstof in staat zou stellen een normalisering stap vergelijkbaar is met conventionele RT-PCR-procedures die normalisering van de well-to-well verschillen die kunnen als gevolg van artefacten optreden mogelijk maakt. Deze kunnen het gevolg zijn van fouten of pipetteren kan van well-to-well variatie ontstaan in fluorescentie detectie-efficiëntie.
4,3 Plot
- Plot genormaliseerde fluorescentie data (% vrij FAM) tegen de tijd (in sec) in een scatterplot met bijbehorende fouten.
- Wij raden het analyseren van reparatie kinetiek in ten minste drie verschillende nucleaire lysaat voorbereidingen die biologische repliceert. Om variatie te beoordelen, dient onder-experimentele fouten berekend op basis van de gemiddelden van elke individuele experiment worden weergegeven.
- Een vertegenwoordiger analyse van twee tumor cellysaten: LN428, een glioomcellijn met niet-detecteerbare niveaus van methyl-purine DNA glycosylase (MPG) en LN428/MPG, dezelfde cellijn ontwikkeld voor de verhoogde expressie van MPG, beide cellijnen hebben het gelijktrekken van de AP endonuclease 1 (APE1) 1,2. Elke werden getest voor activiteit en APE1 MPG activiteit met de BER THF Molecular Beacon (figuur 3) en de BER Hx Molecular Beacon (figuur 4), waarbij THF = tetrahydrofuran (substraat voor APE1) en Hx = hypoxanthine (substraat voor MPG) . Opmerking: Figuur 3 (THF substraat) De resultaten van de LN428/MPG lysaten een lager maximum absolute fluorescentie ten opzichte van de LN428 lysaten. Dit is het gevolg van een lager baken ingang waarde bepaald met Tmax waarde (zie 3.3a). Bij deze lagere waarde waarop het normaliseren, resulteert dit in een grote verandering in de grafiek. Dit illustreert mooi het belang van het normaliseren van de gegevens. Opstellen van de absolute fluorescentie waarden alleen al zou suggereren dat de REPAir. tarieven tussen LN428 en LN428/MPG cellen zijn verschillend. Echter, wanneer de gegevens worden genormaliseerd op de well-to-well variabiliteit onderzocht, wenst de APE1-gemedieerde reparatie tarief verschil aangetoond dat het minimaal.
5. Representatieve resultaten
We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in celkernen lysaten met behulp van base excisie reparatie (BER) moleculair beacons (figuur 1). Eenmaal gegloeid, raden we het uitvoeren van een smelt curve analyse (tabel 1) als een kwaliteit beoordeling van uw moleculair beacon (figuur 2). Nuclear lysaten kan dan bereid met de buffer componenten in tabel 2. Dialyze het lysaat van 0,5 L voorgekoelde dialyse buffer gedurende 90 minuten bij 4 ° C onder zacht roeren met een Pierce Slide-A-Lyzer dialyse cassette tegen dialyse buffer in tabel 3. Verzamel degedialyseerd kerneiwit oplossing uit de dialyse cassette met een injectiespuit. Gebruik een andere pakking dan voorheen gebruikt om het eiwit te injecteren in de dialyse cassette. Bepaal de concentratie van het gedialyseerde eiwit met behulp van standaard protocollen. Voorbeelden van verwachte nucleaire lysaat concentraties zijn weergegeven in tabel 4. Voer de reactie zoals hierboven (stap 3.4) met de plaat opstelling als weergegeven in Tabel 5. Een vertegenwoordiger analyse van twee tumor cellysaten: LN428, een glioom cellijn met niet-detecteerbare niveaus van methyl-purine DNA glycosylase (MPG) en LN428/MPG, dezelfde cellijn ontwikkeld voor de verhoogde expressie van MPG, beide cellijnen hebben het gelijktrekken van de AP endonuclease 1 (APE1) 1,2. Elke werden gezocht heeft naar APE1 activiteit en MPG-activiteit met behulp van de groepsvrijstellingsverordening THF Molecular Beacon (figuur 3) en de BER Hx Molecular Beacon (figuur 4), waar THF = tetrahydrofuran (een substraat voor APE1) en Hx = hypoxanthine(Substraat voor MPG). Ten slotte is het gebruik van een BER dU / A Molecular Beacon dat de verslagen over uracil glycosylase activiteit, laten we zien dat signaal of signaalsterkte maximaal is op 10μg eiwit en neemt af tot een niet-detecteerbare niveau 0,62 microgram eiwit (figuur 5).
Figuur 1. Algemene structuur van de groepsvrijstellingsverordening Molecular Beacon. Afgebeeld is de volgorde en de algehele vormgeving van de groepsvrijstellingsverordening Molecular Beacons hier gebruikt als een enkelstrengs molecuul, na gloeien en weer na het smelten. Het vet maken, Cursief deel van de reeks is de stam (15 basen) en het onderstreepte gedeelte van de reeks is de lus (13 basen). FAM = de 5 'fluorescente kleurstof 6-carboxyfluoresceïne [op het 5'-uiteinde; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, extinctiecoëfficiënt (260 nm): 20.960; extinctiecoëfficiënt (bij absorptie max): 75.000] en Dabcyl = de 3 'blusmiddel Dab cil [op het 3 'uiteinde; Abmax = 453 nm; Quenching Range = 425-520 nm] X = de laesie (varieert afhankelijk van de onderzoeksvraag) en Y = de basis tegenover de laesie (afhankelijk van de onderzoeksvraag). .
Figuur 2. Smelt Curve. Een representatieve smeltcurve wordt de BER Molecular Beacon Control (A) en de BER Molecular Beacons bevattende tetrahydrofuran (THF) deel (B) of hypoxanthine (HX) deel (C). Oligonucleotide concentraties varieerden van 0 nM (donker blauw), 8 nm (rood), 16 nm (groen), 32 nm (paars), 64 nM tot 128 nM blauw (oranje). Zoals beschreven in stap 1.3, werden de gegloeide oligonucleotiden verhit van 25 ° C tot 95 ° C in 0,5 ° C en het StepOnePlus wordt geprogrammeerd FAM fluorescentie te meten bij elke 0,5 ° C interval.
Figuur 3. Representatieve gegevens met behulp van de groepsvrijstellingsverordening THF Molecular Beacon. AP endonuclease activiteit die specifiek zijn voor hydrolyse van de abasic website analoge tetrahydrofuran (THF) werd gemeten in de nucleaire lysaten van de controle cellijn (LN428) en het MPG over-expressie cellijn (LN428/MPG) . Elke lysaat werd geanalyseerd met behulp van de groepsvrijstellingsverordening Molecular Beacon Control (LN428, groen; LN428/MPG, paars) of de groepsvrijstellingsverordening THF Molecular Beacon (LN428, blauw; LN428/MPG, rood). De resultaten worden gerapporteerd (A) de gemiddelde fluorescentie respons eenheden (B) dezelfde gegevens worden genormaliseerd om baken ingang zoals beschreven in punt 4 hierboven (THF = tetrahydrofuran).
Figuur 4. Representatieve gegevens met behulp van de groepsvrijstellingsverordening Hx Molecular Beacon DNA glycosylase activiteiten die specifiek zijn voor het verwijderen van de MPG substraat hypoxanthine (Hx) werd gemeten nucleaire lysaten van de controle cellijn (LN428) en MPG overexpressie cellijn (LN428/MPG). Elke lysaat werd geanalyseerd met behulp van de groepsvrijstellingsverordening Molecular Beacon Control (LN428, groen; LN428/MPG, paars) of de groepsvrijstellingsverordening Hx Molecular Beacon (LN428, blauw; LN428/MPG, rood). De resultaten worden gerapporteerd (A) de gemiddelde fluorescentie respons eenheden (B) dezelfde gegevens worden genormaliseerd als beschreven in punt 4 hierboven (Hx = hypoxanthine).
Figuur 5. Representatieve gegevens met behulp van de BER dU / A Molecular Beacon op verschillende eiwitgehaltes. DNA glycosylase (UNG) activiteit die specifiek zijn voor het verwijderen van uracil (dU / A) werd gemeten in de nucleaire lysaten van T98G cellen. De T98G lysaat werd geanalyseerd met behulp van de BER Molecular Beacon Control of BER dU / A Molecular Beacon op eiwitniveaus 10, 5, 2,5, 1,25 of 0,62 pg, zoals aangegeven in de fIGUUR. De resultaten zijn genormaliseerd gegevens zoals beschreven in punt 4 hierboven.
| Concentratie van Beacon (nM) | 0 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 |
| Molecular Beacon werkoplossing (200 Nm) toegevoegd (pi) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 |
| BER reactie Buffer (w / o DTT) (pi) | 25 | 24 | 23 | 21 | 17 | 9 |
Tabel 1. Lay-out van een smelt curve experiment.
| 1 L Totaal | Volume op voorraad Oplossing nodig | Con. op voorraad Solution | Final Con. |
| HEPES KOH | 25 mL | 1M pH7.8 | 25 mM </ Td> |
| KCl | 75 ml | 2 M | 150 mM |
| EDTA | 1 ml | 0,5 M pH 8,0 | 0,5 mM |
| Glycerol | 10 mL | N / A | 1% |
| DTT (toe te voegen voor gebruik) | 0,5 ml | 1 M | 0,5 mM |
| H2O | 888,5 mL | N / A | N / A |
Tabel 2. BER reactiebuffer.
| 1 L Totaal | Volume op voorraad Oplossing nodig | Con. op voorraad Solution | Final Con. |
| HEPES KOH | 50 ml | 1M pH 7,5 | 50 mM |
| KCl | 50 ml | 2 M | 100 mM |
| EDTA | 1 ml | 0,5 M pH 8,0 | 0,5 mM |
| Glycerol | 200 ml | N / A | 20% |
| DTT (toe te voegen voor gebruik) | 1 ml | 1 M | 1 mM |
| H2O | 698 ml | N / A | N / A |
Tabel 3. Dialysebuffer.
| Cell Line | Protein Concentratie (ug / ul) |
| LN428 | 5,34 |
| LN428/MPG | 4,79 |
Tabel 4. Eiwitbepaling resultaten.
| Negatieve Controle 25μL BER Buffer | (Achtergrond Control) 20μL BER Buffer 5 ul Con Beacon GEEN lysaat | (Test in drievoud) <br /> 15μL BER Buffer 5 ul Con Beacon 5 ul LN428 Lysate | (Test in drievoud) 15μL BER Buffer 5 ul Con Beacon 5 ul LN428/MPG Lysate |
| Negatieve Controle 25μL BER Buffer | (Achtergrond Control) 20μL BER Buffer 5 ul THF Beacon GEEN lysaat | (Test in drievoud) 15μL BER Buffer 5 ul THF Beacon 5 ul LN428 Lysate | (Test in drievoud) 15μL BER Buffer 5 ul THF Beacon 5 ul LN428/MPG Lysate |
| Negatieve controle 20μL BER Buffer 5 ul lysaat | (Achtergrond Control) 20μL BER Buffer 5 ul Hx Beacon GEEN lysaat | (Test in drievoud) 15μL BER Buffer 5 ul Hx Beacon 5 ul LN428 Lysate | (Test in drievoud) 15μL BER Buffer 5 ul Hx Beacon 5 ul LN428/MPG Lyverzadigen |
| Negatieve controle 20μL BER Buffer 5 ul lysaat |
Tabel 5. Molecular Beacon test set-up.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn meer dan 600 citaten gebruik van de term 'moleculaire baken' voor het detecteren en kwantificeren van tal van moleculen en enzymatische activiteiten, waaronder helicase activiteit 6, DNA-polymerase-activiteit 7,8, DNA-ligase activiteit 9, telomerase activiteit 10, DNA photolyase activiteit 11 en DNA / RNA hybriden 12, onder vele anderen. Naast het gebruik van moleculaire bakens voor het meten van het DNA bovengenoemde activiteiten, hebben we aangetoond en anderen de bruikbaarheid van deze probes voor de analyse van BER activiteit 1,2,13-15.
De real-time BER activiteit test beschrijven we hierin voorzien van een aangepaste basis en zorgt voor de kwantitatieve beoordeling van de BER tarieven voor verschillende laesies of wijzigingen in de basis tegenover de laesie. Toepassingen kunnen variëren van moleculaire mechanistische studies remmer schermen. We hebben aangetoond BER specificiteit door het vergelijken van Lysates van MPG expresserende cellen met niet-expresserende cellen en gebrek aan werkzaamheid in de controle bakens. De test is zeer gevoelig, waardoor de detectie van defecten in de expressie van de groepsvrijstellingsverordening eiwitten MPG 2 of XRCC1 1 en is voldoende om kleine veranderingen in de DNA-herstel kinetische parameters en de werkzaamheid van DNA-herstel-remmers te detecteren [manuscript in voorbereiding]. Meerdere leest in de actieve reparatietijd ondersteuning berekende kinetische tarieven en voor de betekenis van eventuele wijzigingen in die kinetische tarieven. De BER moleculaire beacon-test is daarom geschikt voor high-throughput studies om te screenen op DNA-reparatie-enzym-remmers (remmer schermen) of voor studies over de rol van individuele nucleaire componenten. De analyse van de nucleaire lysaten maakt de beoordeling van de DNA-reparatie in de volledige context van de groepsvrijstellingsverordening complex dus ook afbeeldingen van indirecte veranderingen of invloeden op de BER machines (bijv. post-vertaling wijzigingen of mutaties).
Deprotocol beschreven, moet opleveren zeer reproduceerbare en kwantitatieve resultaten. Echter, er zijn diverse details te overwegen om een goede analyse te garanderen: (1) Achtergrond waarden van de negatieve controles kan te hoog zijn: Dit kan te wijten zijn aan slechte opslag of vervaardiging van de oligonucleotide. Hoge achtergrond waarden in de lysaten zonder bakens geven aan verstorende auto-fluorescentie (dwz door verontreiniging of cellulaire expressie van exogeen fluorescerende eiwitten). Als expressie van een fluorescerend eiwit onvermijdelijk is, kan de bekrachtiging / emissiespectra van de reporter kleurstof fluorescent eiwit en niet overlappen, (2) Fl (Tmax) laag: DNA-concentratie is anders dan gegeven. Controleer DNA-concentratie door middel van spectrofotometrie (OD 260nm) voor bijvoorbeeld het gebruik van de NanoDrop. Hoge DNA-concentratie met een lage Fl (Tmax) geeft een onvoldoende FAM belasting van de bakens. HPLC zuivering onmogelijk wordt contaminatie met niet-gemodificeerde DNA (zie boven), (3) Reparatie activiteit is slecht: Als de Fl (Tmax) waarden opde laatste cycli geven aan voldoende baken in-en fluorescentie-detectie, kan dit erop dat de nucleaire extract voorbereiding mislukt. Nucleaire extract kwaliteit is van cruciaal belang. Lage temperaturen dient te worden gewaarborgd in de hele procedure, inclusief lange-termijn opslag bij -80 ° C en (4) Reparatie activiteit bochten te starten met hoge waarden: Zelfs zeer korte blootstelling van de monsters op kamertemperatuur vóór de analyse initieert reparatie. Koel bewaren te allen tijde.
Deze zeer gevoelige en kwantitatieve BER assay geldt ook voor de analyse van gezuiverde eiwitten, waardoor studies substraatspecificiteit door verandering van de moleculaire bakens daarvan. Ten slotte is de test is van toepassing op de analyse van de tumor en weefsel lysaten, biedt een kans om functionele DNA Repair eindpunten te meten als biomarkers van de reactie of therapeutische werkzaamheid, zoals wij hebben voorgesteld voor het evalueren van tumoren voor PARP1 remmer versterking van het alkyleringsmiddel temozolomide 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
RWS is een wetenschappelijk adviseur voor Trevigen, Inc De rest van de auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Pittsburgh Foundation en de National Institutes of Health (NIH) [GM087798, CA148629, ES019498] om RWS. Ondersteuning voor de UPCI Lentivirale faciliteit werd verstrekt aan RWS door de Cancer Support Grant van de National Institutes of Health [P30 CA047904]. Ook is steun verleend door de Universiteit van Pittsburgh Afdeling Farmacologie & Chemical Biology naar de DS. Ook is steun verleend door de ESTRO aan CV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
- Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
- Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
- Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
- Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
- Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
- Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
- Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
- Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
- Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
- Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
- Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
- Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
