Summary
Noi descriviamo un metodo per la determinazione quantitativa, misurazione in tempo reale di DNA glicosilasi e attività di endonucleasi di AP in lisati cellulari nucleari. Il test produce tassi di attività DNA Repair suscettibili di analisi cinetica ed è adattabile per la quantificazione delle attività di riparazione del DNA nei tessuti e lisati tumorali o con le proteine purificate.
Abstract
Noi descriviamo un metodo per la determinazione quantitativa, misurazione in tempo reale di DNA glicosilasi e attività di endonucleasi di AP in lisati cellulari nucleari di base utilizzando escissione riparazione (BER) segnali molecolari. Il substrato (beacon) è costituito da un deoxyoligonucleotide contenente una singola lesione base con un 6-carbossifluoresceina (6-FAM) porzione coniugata alla estremità 5 'e una frazione DABCYL coniugato all'estremità 3' dell'oligonucleotide. Il faro BER molecolare è 43 basi di lunghezza e la sequenza è progettato per favorire la formazione di una forcina struttura con 13 nucleotidi nel ciclo e 15 coppie di basi in 1,2 stelo. Quando ripiegato in questa configurazione il 6-FAM frazione viene bloccata mediante DABCYL in un modo non fluorescente tramite trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) 3,4. La lesione è posizionato in modo tale che in seguito alla rimozione lesione base e scissione filamento il restante 5 oligonucleotide base contenente il 6-FAM frazione viene rilasciato dallo stelo. Rilasciare undistacco dalle nd (DABCYL) risultati quencher in un aumento di fluorescenza che è proporzionale al livello di riparazione del DNA. Con la raccolta di più letture dei valori di fluorescenza, valutazione in tempo reale dell'attività BER è possibile. L'impiego di standard quantitativa PCR in tempo reale strumenti consente l'analisi simultanea di numerosi campioni. La progettazione di questi fari BER molecolari, con una lesione singola base, è suscettibile di analisi cinetica, la quantificazione BER e convalida inibitore ed è adattabile per la quantificazione dell'attività riparazione del DNA in tessuto e lisati cellulari tumorali o con proteine purificate. L'analisi dell'attività BER in lisati tumorali o tessuto aspira utilizzando questi segnali molecolari può essere applicabile a misurazioni biomarker funzionali. Inoltre, l'analisi dell'attività BER con proteine purificate utilizzando questo saggio quantitativo fornisce una rapida, ad alta capacità metodo per la scoperta e la convalida di inibitori BER.
Protocol
1. Beacon Progettazione Molecolare
1,1 Progettazione e ordinare il vostro segnale molecolare
Il design del faro molecolare deve considerare quanto segue:
- Abbiamo buoni risultati con il 43-mer oligonucleotidi di DNA. Il contenuto di GC deve essere> 32%. Escludere una base di G al 5 '.
- Richiesta 6-FAM (6-carbossifluoresceina) coniugazione sulla estremità 5 'e DABCYL come 3' modifica.
- La posizione della lesione deve essere su base # 6 dal 5 '.
- La lunghezza dello stelo o duplex forcina dovrebbe essere un minimo di 15 bp.
- La lunghezza dell'anello consigliato è di 13 basi.
- La struttura complessiva del faro è come mostrato nella Figura 1.
- Una volta la sequenza e la lesione di tipo è deciso, l'oligonucleotide può essere ordinato presso maggior parte delle aziende oligonucleotidiche. Ordiniamo i nostri oligonucleotidi dalla IDT e chiedere che gli oligonucleotidi sono HPLC purificato e provided come una polvere o in un formato essiccato.
1,2 ricottura il segnale molecolare
- Sciogliere oligonucleotidi di DNA liofilizzate in tampone di diluizione Oligo (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) per dare una soluzione concentrata molecolare Archivio Beacon di 40 pM.
- Preparare una soluzione 200Nm Molecular Beacon lavorativo dalla soluzione al 40 Molecular Beacon magazzino pM con il tampone di reazione BER (vedi sotto). Aggiungere la soluzione di 200 nM Molecular Beacon lavorando ad una provetta sterile 1,5 mL nero.
- Incubare la provetta contenente la soluzione di segnale molecolare 200 nM lavorare in un grande bicchiere di acqua bollente per 3 minuti.
- Dopo 3 minuti, togliere il bicchiere dalla fonte di calore e incubare i Beacons molecolari in acqua durante la notte per promuovere la ricottura. Utilizzare termicamente isolanti sia sopra che sotto il bicchiere per rallentare il processo di raffreddamento.
- Beacons aliquotare in sterili, nero provette da 1,5 ml, 100 microlitri per ogni tubo.
- Conservare a -30 ° C.
1.3 Valutazione della qualità del segnale molecolare
- Eseguire l'analisi della curva di fusione per confermare che i fari BER molecolari non riscaldata fino a fluorescenza, per determinare la temperatura ottimale di fusione e di constatare che ogni indicatore si fluorescenza quando viene riscaldato.
- Per ogni beacon aggiungere il volume indicata della soluzione Molecular Beacon 200 nM di lavoro e buffer di reazione BER, come indicato nella tabella 1, a 6 pozzetti di una rapida Optical piastra a 96 pozzetti (Applied Biosystems, Cat # 4.346.906).
- Utilizzare tempo reale strumento PCR come il (Applied Biosystems) StepOnePlus sistema o simile per monitorare FAM-colorante eccitazione durante l'analisi della curva di fusione.
- Programma il real-time strumento PCR (sistema StepOnePlus) per monitorare FAM eccitazione colorante in funzione della temperatura crescente in piccoli incrementi per l'analisi della curva di fusione. Il sistema StepOnePlus è programmato per misurare FAM fluorescenzance e rampa da 25 ° C a 95 ° C a 0,5 ° C intervalli. Una curva di fusione tipica è mostrata in Figura 2.
- Fluorescenza di fondo Poca o nessuna deve essere visibile a temperature inferiori a 50 ° C. Verificare la presenza di un aumento uniforme e ripida in fluorescenza, indicativo di fari e di alta qualità pure. Valori di Tm circa 60 ° C a 80 ° C sono favorevoli e deve essere uguale per tutte le diluizioni.
- Determinare T max, la temperatura a fluorescenza massima [FL (max)] valori, da questa analisi. La proporzionalità dei valori di fluorescenza a T o T max m all'ingresso beacon (la concentrazione) deve essere lineare. Il valore di fluorescenza a T max, Fl (max), deve superare i valori di fondo a 37 ° C di almeno 5-volte.
2. Preparazione del lisato nucleare
2,1 Base Escissione Repair buffer di reazione 5 preparazione
- Aggiungere tutti i componenti elencatiin Tabella 2 e portare il volume del buffer a 900 ml con ddh 2 O.
- Regolare il pH a 7,8 con idrossido di potassio 8,0 N (Sigma, Cat # 17-8).
- Portare il volume del buffer a 1000 mL con ddh 2 O.
- Filtrare il buffer utilizzando 0,22 uM filtro, Nalgene 1 L filtro (cat # 167-0020).
- Aggiungi ditiotreitolo (DTT) immediatamente prima di utilizzare il tampone di reazione BER.
2,2 coltura cellulare e l'isolamento delle cellule
- Si consiglia di cellule in coltura fino al 90-100% confluenti. Isolate cellule di 4-6 piatti (150 mm) per ottenere sufficiente lisato nucleare per un set completo di analisi (circa 5 x 10 7 cellule del totale).
- Si consiglia di preparare 3 culture indipendenti per 3 pellet cellulari indipendenti di ottenere repliche biologiche per ogni analisi.
- Lisati nucleari sono facilmente preparati utilizzando la procedura di isolamento NucBuster (EMD Cat Bioscience Calbiochem # 71183-3) ALTHough qualsiasi protocollo di isolamento nucleare sarebbe opportuno (vedi sotto, sezione 2.3.).
2,3 preparazione lisato nucleare
- Prima di iniziare, un liofilizzato cocktail inibitore di proteasi (Calbiochem, Cat # 539.131, Set 1) è prima risospeso in 100 microlitri di acqua sterile per preparare un archivio di 100x. Utilizzare immediatamente o congelare in aliquote a -20 ° C per una conservazione a lungo termine. Calcolare 1 ml di stock di 100x per ogni 10 7 cellule estratte, se necessario.
- Tutte le fasi durante la procedura di estrazione deve essere eseguita su ghiaccio oppure a 4 ° C per garantire la stabilità della proteina.
- Etichettare 15 mL tubi Falcon e immettono sul ghiaccio.
- Rimuovere mezzi di crescita di cellule e lavare due volte con 7,5 mL di PBS freddo.
- Aggiungere 5 ml di PBS freddo ad ogni piatto e raschiare le cellule dalla piastra con un sollevatore cella. Trasferire le cellule al refrigerate 15 ml tubo Falcon.
- Centrifugare a bassa velocità (500x g, 4 ° C) per 5 minuti. Rimuovere il surnatantee stimare l'ematocrito al confronto. (Fino a volume di 250 pl ematocrito può essere elaborato in un unico tubo 1,5 mL)
- Centrifugare per un altro minuto 1 a 500x g e rimuovere il rimanente PBS con una pipetta. Risospendere il pellet di cellule in Reagente di estrazione NucBuster 1 secondo la dimensione del ematocrito: 150 ml del reagente di estrazione NucBuster 1 per 50 microlitri volume di ematocrito. (In alternativa, il pellet cellulare può essere surgelati in ghiaccio secco o con azoto liquido e conservati a -80 ° C fino al momento di procedere).
- Dopo la risospensione, trasferire lisato ad un pre-refrigerata tubo di 1,5 mL.
- Vortex 15 sec ad alta velocità, incubare su ghiaccio per 5 minuti, e ancora vortice 15 sec ad alta velocità.
- Centrifugare a 13.000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Surnatante contiene frazione citoplasmatica. Rimuovere e conservare a -80 ° C o scartare.
- Risospendere il pellet in una miscela di 1 pl di risospese 100x cocktail inibitore della proteasi, e 1 mu; l di 100 mM DTT e 75 microlitri di reagente di estrazione NucBuster 2 per volume di 50 microlitri ematocrito.
- Vortex 15 sec ad alta velocità, incubare su ghiaccio per 5 minuti, e ancora vortice 15 sec ad alta velocità.
- Centrifugare a 13.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Surnatante contiene proteine nucleari. Raccogliere il surnatante e procedere alla fase successiva.
2,4 Dialisi, la quantificazione delle proteine e aliquotando
- Tutte le fasi durante la procedura di dialisi deve essere eseguita con pre-raffreddate soluzioni, materiali e attrezzature per garantire la qualità estratto.
- Preparare tampone di dialisi (1 L richiesto per campione) come descritto in Tabella 3. Importante: Buffer deve essere freddo (4 ° C). Si consiglia di preparare almeno il giorno prima. Tampone di dialisi filtrata può essere conservato a 4 ° C indefinitamente DTT se non è stato aggiunto.
- Pre-chill bicchieri (2 bicchieri di 1 L per campione), tampone di dialisi, camere dialisi, micro-centrifugatubi, siringhe e aghi.
- Poco prima di usare - aggiungere 1 mL 1 M DTT per litro di buffer di dialisi.
- Dializzare il lisato preparata al punto 2.3 in 0.5 L pre-refrigerata buffer di dialisi per 90 minuti a 4 ° C con agitazione usando un Slide-A-Lyzer PIERCE cassette Dialisi (0,5-3 ml cassette dializzati con 7.000 MW di taglio).
- Trasferimento cassetta dialisi ad un secondo becher contenente 0,5 L pre-raffreddata tampone di dialisi e dializza lisato per 90 minuti a 4 ° C con delicata agitazione.
- Raccogliere la soluzione dializzato proteina nucleare dal cassetto dialisi con una siringa (Fisher, cat # 309659). Utilizzare una guarnizione diverso precedentemente utilizzato per iniettare la proteina nella cassetta dialisi. Si noti che l'estratto può essere cristallizzato a causa di alte concentrazioni di proteine. Cercate di includere nuvoloso cristalli cercano quando si rimuove la soluzione dializzato proteina nucleare.
- Aliquota del campione di micro-provette da centrifuga, 20 pl ciascuno. Congelamento rapido in ghiaccio secco e store a -80 ° C fino all'utilizzo.
- Determinare la concentrazione della proteina dializzato utilizzando protocolli standard. Esempi di attesi concentrazioni lisato nucleari sono mostrati in Tabella 4.
- Infine, lisati dovrebbe essere valutata per il controllo qualità. Valutazione dei lisati varierà con l'esperimento. Come descritto in precedenza, abbiamo routine lisati per analizzare l'espressione di proteine diverse con BER 1,2 immunoblot.
- La fase di dialisi è usato per fare una soluzione uniforme di reazione attraverso le linee cellulari per facilitare il confronto. Tralasciando la fase di dialisi può influire tassi enzimatici e analisi cinetica poiché le soluzioni saline e condizioni di reazione sono più identici nelle diverse linee cellulari e preparati a causa delle varie diluizioni necessarie. Tuttavia, abbiamo osservato che utilizzando lisati di maggiori di 5 pg / pl e aggiungendo tampone sufficiente reazione non consente omissione della fase di dialisi (dati non mostrati). Per th inibitore studia non richiedere che il confronto tra i lisati cellulari differenti, dialisi potrebbe non essere necessaria. Tuttavia, si consiglia la dialisi, come indicato.
3. Beacon Molecular Assay
3.1 Attrezzature requisiti
- Un quantitativa PCR in tempo reale strumento, come StepOnePlus qRT-PCR o comparabili, o da 96 pozzetti fluorometro piastra capace di rilevare e misurare FAM fluorescenza in tempo reale. Nota: Questa procedura è applicabile a qualsiasi macchina in grado di leggere i valori di fluorescenza dei fari e li registra in tempo reale. La macchina dovrebbe, tuttavia, consentono all'utente di accedere ai valori grezzi fluorescenza per l'analisi dei dati.
- Centrifugare compatibile con ottiche di RT-PCR tubi o piastre utilizzati.
- Microsoft Excel per analizzare i dati raccolti.
3.2 Tamponi e reagenti
- Ottici RT-PCR tubi o piastre con coperture corrispondenti.
- BER tampone di reazione (vedere unBove e Tabella 2).
- Dializzato proteina nucleare estrae come preparato in Piazza di 2.3 e 2.4 e diluito a 2 pg / ml con proteine tampone di reazione contenente DTT BER.
- Beacons molecolari diluita a 200 micron con tampone di reazione BER per creare la soluzione Molecular Beacons di lavoro (vedi sopra).
3,3 Assay set-up (Tabella 5)
- Il qRT-PCR macchina non viene normalmente utilizzato come un fluorimetro modo il metodo di esecuzione deve essere cambiato.
- Programmare una prima fase e impostare la temperatura di reazione a 37 ° C con un tempo di ciclo (punti temporali di misurazione) di 20 sec con un minimo di 180 cicli (o più, a seconda del disegno test di riparazione). Assicurati di raccogliere i dati durante i cicli. Pertanto, la macchina raccogliere dati ogni 20 secondi per un totale di 1 ora.
- Creazione di una seconda fase che le rampe la temperatura Tmax del faro particolare, la temperatura massima di fluorescenza, come deterrenteestratto nella Fase 1.3 (Valutazione della qualità del segnale molecolare). Il tempo di ciclo deve ancora essere 20 secondi con un totale di 15 cicli. Questo raccoglierà dati ogni 20 secondi per 5 minuti alla massima fluorescenza possibili del faro. I valori di fluorescenza misurati durante i cicli a Tmax viene utilizzato per normalizzare i valori di fluorescenza in ciascun pozzetto (fase 4.2a). Se si utilizza più beacons diverse assicurarsi di includere misure che forniscono valori simili ripetitive per il Tmax di coloro fari pure.
- Impostare il volume di reazione di 25 pl.
- Set-up il progetto piastra sul qRT-PCR macchina utilizzando il software di Applied Biosystems. Siamo interessati solo nei valori grezzi di fluorescenza, quindi selezionare l'opzione "Curve Standard" - tipo di esperimento.
- Completa il layout piatto. Un esempio è mostrato nella Tabella 5. Non aggiungere niente ai pozzi selezionati come la curva standard.
3,4 Run test
- Follettoortant: uso pre-refrigerate materiali e soluzioni. Conservare in luogo fresco fino al run e la rilevazione.
- Aggiungere quantità appropriata di DTT al tampone di reazione BER da utilizzare.
- Diluire soluzione proteica ad una concentrazione di 2 ug / pl usando tampone di reazione BER (con DTT).
- Per gli esperimenti iniziali si consiglia di utilizzare 10 ug di lisato dializzato nucleare per bene (5 pl / pozzetto) e 1 pmole di substrato, il molecular beacon ad una concentrazione finale di 40 nM (5 pl / pozzetto). Abbiamo ottenuto costantemente alta qualità e risultati riproducibili con 10 ug di lisato cellulare, anche se è possibile che lisati cellulari o diversi substrati beacon possono dettare concentrazioni proteiche superiori o inferiori.
- I componenti del saggio in ciascun pozzetto sono 15 microlitri tampone di reazione BER, 5 microlitri faro e 5 microlitri lisato nucleare. Eseguire ogni beacon / lisato combinazione in triplice copia.
- Diversi controlli negativi sono necessari per ogni faro, compresi i campioni, senza faro, come 25 μ L di tampone di reazione BER solo, e 20 pl tampone di reazione BER con 5 lisato pl e 20 pl di tampone di reazione BER con 5 pl di beacon senza lisato.
- Diversi campioni di controllo sono necessari per ogni lisato nucleare. Questi includono un controllo negativo [15 microlitri tampone di reazione BER, 5 faro di controllo microlitri (nessuna lesione) e 5 microlitri del campione lisato]. Si consiglia inoltre di includere sperimentali controlli positivi, quali l'inserimento di THF contenente fari che imitano sito abasic contenente oligos e sono facilmente incisi [15 microlitri tampone di reazione BER, 5 faro ul THF e 5 microlitri del campione lisato]. Naturalmente, il controllo preciso positivo dipenderà dal disegno complessivo sperimentale.
- Come esempio, seguire tabella 5 per il layout piastra.
- Pipettare in provette ottici o piastre mentre su ghiaccio o supporto raffreddato per ridurre al minimo l'iniziazione di reazione prima del rilevamento del segnale.
- Pipettare buffer di reazione BER prima in tutti i pozzetti.
- Il beacons pipettare n secondo lo schema piastra in pozzi corretti e sempre pipettare lisati ultima nei pozzetti per ridurre al minimo l'inizio di reazione prima rilevazione del segnale.
- Tubi di tenuta o piastra a fondo, mescolare e girare con una centrifuga per raccogliere soluzioni al fondo delle provette o piastra
- Inserire la piastra in qRT-PCR macchina e iniziare a test.
- Dopo il completamento, esportare i dati grezzi, preferibilmente in formato Excel. Per il sistema StepOnePlus solo i dati multi-componente sono necessari. Questa contiene tutti i valori di fluorescenza a più letture ordinati per colore del colorante e bene.
4. Molecular Beacon Analisi Assay
Abbiamo usato il software Microsoft Excel per eseguire queste analisi e calcoli. Si consiglia di modelli che istituiscono e le macro che consentono l'analisi semplice e veloce, display grafico basato su dati derivati da formati standard da 96 pozzetti.
4,1 Rimozione di sfondo
">4,2 Fl (Tmax) normalizzazione
Per affrontare la variabilità in pipettaggio e rivelazione di fluorescenza in pozzetti differenti, abbiamo normalizzare i dati ai valori fluorescenza massima (che correlano con ingresso beacon).
- Calcolare i valori medi di fluorescenza di cicli a T max per il benessere individuale: Fl (T max) (passo 3.3aii).
- Calcolare il rapporto Fl (ciclo x) / Fl (T max) e moltiplicare per 100. Sotto l'ipotesi probabile che Fl (T max) corrisponde al massimo valore possibile di fluorescenza quando è completamente inciso, questi dati normalizzati rappresentano% da FAM (beacon =% BER inciso).
- Combina i campioni in triplicato la media dei dati (% da FAM) dei 3 pozzi per ogni ciclo (fino al ciclo di 180) e calcolare gli errori su ciascuno.
- Calcolare i tempi di moltiplicando 20 sec per ogni ciclo.
- Dal momento che il well-to-ben varianza nel rivelatore a fluorescenza può essere significativo, si consiglia di aggiungere un colorante fluorescente, come ROX per lo stock di segnale molecolare che serve come standard di ri-regolare i valori di fluorescenza dei singoli pozzi. In questo caso, il colorante ROX potrebbe essere usato come uno standard interno (riferimento passiva) in ogni singolo pozzetto. ROXspettri di eccitazione e di emissione (eccitazione - 588 nm, emissione 608 nm) è distinta da quella del 6-FAM colorante impiegato nel saggio (eccitazione - 495 nm, emissione - 520 nm). Il colorante ROX consentirebbe un passo di normalizzazione simile a convenzionali RT-PCR procedure che consente di normalizzazione ben oltre a differenze che possono verificarsi a causa di artefatti. Questi possono derivare da errori di pipettamento o possono provenire da well-to-well variazione di efficienza di rivelazione di fluorescenza.
4,3 Plot
- Tracciare i dati normalizzati di fluorescenza (% da FAM) contro il tempo (in secondi) in un grafico a dispersione con errori corrispondenti.
- Si consiglia di analizzare la cinetica di riparazione in almeno tre diverse preparazioni lisato nucleari rappresentano replica biologica. Per valutare la varianza, inter-sperimentali errori calcolati dalle medie di ogni singolo esperimento dovrebbe essere visualizzato.
- Un'analisi rappresentante di due lisati cellulari tumorali: LN428, un gliomalinea cellulare con livelli rilevabili di DNA metil purine glicosilasi (MPG) e LN428/MPG, la linea stessa cella progettata per l'espressione elevata di MPG; entrambe le linee cellulari hanno livelli equivalenti di AP endonucleasi 1 (APE1) 1,2. Ogni sono stati sondati per APE1 dell'attività e attività MPG utilizzando il BER THF Molecular Beacon (figura 3) e il BER Hx Molecular Beacon (figura 4), dove THF = tetraidrofurano (un substrato per APE1) e Hx = ipoxantina (un substrato per MPG) . Nota: In figura 3 (substrato THF), i risultati dei lisati LN428/MPG mostrano una minore fluorescenza massimo assoluto rispetto ai LN428 lisati. Questo è il risultato di un valore inferiore faro di ingresso come determinato usando valori Tmax (vedi 3.3a). Quando questo valore più basso è stato utilizzato per normalizzare i risultati, si traduce in un grande cambiamento nella trama. Questo illustra bene l'importanza di normalizzare i dati. Riportando i valori assoluti di fluorescenza solo suggerirebbe la REPAtassi di IR tra LN428 e le cellule LN428/MPG sono diversi. Tuttavia, quando i dati vengono normalizzati a considerare la ben-to-ben variabilità, il APE1-mediata differenza tasso di riparazione è dimostrato essere minimo.
5. Risultati rappresentativi
Noi descriviamo un metodo per la determinazione quantitativa, misurazione in tempo reale di DNA glicosilasi e attività di endonucleasi di AP in lisati cellulari nucleari di base utilizzando escissione riparazione (BER) segnali molecolari (Figura 1). Una volta ricotto, è consigliabile eseguire una analisi della curva di fusione (Tabella 1) come una valutazione della qualità del segnale molecolare (Figura 2). Lisati nucleare può quindi essere preparata utilizzando i componenti del tampone elencati nella Tabella 2. Dializzare il lisato in 0,5 L pre-raffreddata tampone di dialisi per 90 minuti a 4 ° C con delicata agitazione usando un dialisi PIERCE Slide-A-Lyzer cassetta contro il tampone di dialisi elencati nella Tabella 3. Raccogliere ildializzato soluzione proteica nucleare dalla cassetta dialisi utilizzando una siringa. Utilizzare una guarnizione diverso precedentemente utilizzato per iniettare la proteina nella cassetta dialisi. Determinare la concentrazione della proteina dializzato utilizzando protocolli standard. Esempi di attesi concentrazioni lisato nucleari sono mostrati in Tabella 4. Eseguire la reazione come sopra indicato (fase 3.4), utilizzando il layout piastra come mostrato nella Tabella 5. Un'analisi rappresentante di due lisati cellulari tumorali: LN428, una linea di cellule di glioma con livelli rilevabili di DNA metil purine glicosilasi (MPG) e LN428/MPG, la linea stessa cella progettata per l'espressione elevata di MPG; entrambe le linee cellulari hanno livelli equivalenti di AP endonucleasi 1 (APE1) 1,2. Ogni sono stati sondati per APE1 dell'attività e attività MPG utilizzando il BER THF Molecular Beacon (figura 3) e il BER Hx Molecular Beacon (figura 4), dove THF = tetraidrofurano (un substrato per APE1) e Hx = ipoxantina(Un substrato per MPG). Infine, utilizzando un dU BER / A di segnale molecolare che riporta l'attività uracile glicosilasi, mostriamo che segnale e potenza del segnale è massima a 10 ug di proteine e diminuisce a un livello non rilevabile a 0,62 ug di proteine (figura 5).
Figura 1. La struttura generale del BER Molecular Beacon. Mostrato è la sequenza e il design generale dei Beacons BER molecolari utilizzati in questo documento come una molecola a singolo filamento, dopo la ricottura e di nuovo dopo la fusione. Il Bolded, Italics porzione della sequenza è lo stelo (15 basi) e la porzione della sequenza sottolineata è l'anello (13 basi). FAM = 5 'colorante fluorescente 6-carbossifluoresceina [sulla estremità 5'; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, coefficiente di estinzione (260 nm): 20.960; coefficiente di estinzione (a assorbanza max): 75.000] e DABCYL = l' quenching 3 'agente di Dab cyl [sulla 3 '; Abmax = 453 nm; Quenching intervallo = 425-520 nm] X = la lesione (varia a seconda della domanda di ricerca) e Y = la base di fronte alla lesione (varia a seconda della domanda di ricerca). .
Figura 2. Melt curva. Una curva di fusione rappresentante viene mostrato per il controllo molecolare Beacon BER (A), e le Beacons BER molecolare contenente il tetraidrofurano (THF) frazione (B) o la (Hx) ipoxantina frazione (C). Concentrazioni di oligonucleotidi variavano da 0 nM (blu scuro), 8 nm (rosso), 16 Nm (verde), 32 nm (viola), 64 nM blu a 128 nM (arancione). Come descritto nella Fase 1,3, gli oligonucleotidi sono stati ricotti riscaldata da 25 ° C a 95 ° C a 0,5 ° C intervalli e il sistema StepOnePlus è programmato per misurare FAM fluorescenza a ciascun intervallo di 0,5 ° C.
Figura 3. I dati rappresentativi utilizzando il BER THF segnale molecolare. Attività endonucleasica AP specifica per l'idrolisi del sito abasic analogico tetraidrofurano (THF) è stata misurata in lisati nucleari dalla linea cellulare di controllo (LN428) e la MPG iper-espressione linea cellulare (LN428/MPG) . Ciascun lisato è stata analizzata utilizzando il controllo di segnale molecolare BER (LN428, verde, LN428/MPG, viola) o il BER THF Molecular Beacon (LN428, blu, LN428/MPG, rosso). I risultati sono riportati come (A) le unità di risposta di fluorescenza media e (B) gli stessi dati normalizzati di ingresso faro come descritto nella sezione 4 (THF = tetraidrofurano).
Figura 4. Dati rappresentativo con il BER Hx Molecular Beacon glicosilasi attività DNA specifico per la rimozione del substrato MPG hypoxanthine (Hx) è stata misurata in lisati nucleari dalla linea cellulare di controllo (LN428) e la MPG iper-espressione linea cellulare (LN428/MPG). Ciascun lisato è stata analizzata utilizzando il controllo di segnale molecolare BER (LN428, verde, LN428/MPG, viola) o il BER Hx Molecular Beacon (LN428, blu, LN428/MPG, rosso). I risultati sono riportati come (A) le unità medi di risposta e di fluorescenza (B) gli stessi dati normalizzati come descritto nella sezione 4 di cui sopra (Hx = ipoxantina).
Figura 5. Dati rappresentativo con il dU BER / A Beacon molecolare a livelli differenti della proteina. DNA glicosilasi (UNG) attività specifica per la rimozione di uracile (dU / A) è stata misurata nei lisati nucleari da cellule T98G. Il lisato T98G stata analizzata utilizzando il controllo Beacon molecolare BER o il dU BER / A di segnale molecolare, a livelli di proteine di 10, 5, 2,5, 1,25 o 0,62 mcg, come indicato nella fIGURA. I risultati sono dati normalizzati come descritto nella Sezione 4.
| Concentrazione di Beacon (nM) | 0 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 |
| Beacon soluzione molecolare di lavoro (200Nm) aggiunto (pl) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 |
| BER tampone di reazione (w / o DTT) (pl) | 25 | 24 | 23 | 21 | 17 | 9 |
Tabella 1. Disposizione di un esperimento curva di fusione.
| 1 L totale | Volume di soluzione madre necessario | Con. di soluzione madre | Con finale. |
| HEPES-KOH | 25 mL | 1M pH7.8 | 25 mM </ Td> |
| KCl | 75 mL | 2 M | 150 mM |
| EDTA | 1 mL | PH8.0 0.5M | 0,5 mM |
| Glicerina | 10 mL | N / A | 1% |
| DTT (aggiungere prima dell'uso) | 0,5 mL | 1 M | 0,5 mM |
| H 2 O | 888,5 mL | N / A | N / A |
Tabella 2. BER buffer di reazione.
| 1 L totale | Volume di soluzione madre necessario | Con. di soluzione madre | Con finale. |
| HEPES-KOH | 50 mL | 1M pH7.5 | 50 mM |
| KCl | 50 mL | 2 M | 100 mM |
| EDTA | 1 mL | PH8.0 0.5M | 0,5 mM |
| Glicerina | 200 mL | N / A | 20% |
| DTT (aggiungere prima dell'uso) | 1 mL | 1 M | 1 mM |
| H 2 O | 698 mL | N / A | N / A |
Tabella 3. Dialisi tampone.
| Cella linea | La concentrazione di proteine (mg / mL) |
| LN428 | 5,34 |
| LN428/MPG | 4,79 |
Tabella 4. Determinazione della proteina risultati.
| Controllo Negativo 25μL BER Buffer | (Control Background) 20μL BER Buffer 5μL Con Beacon NO lisato | (Test in triplice copia) <br /> 15μL BER Buffer 5μL Con Beacon 5μL LN428 Lysate | (Test in triplice copia) 15μL BER Buffer 5μL Con Beacon 5μL LN428/MPG Lysate |
| Controllo Negativo 25μL BER Buffer | (Control Background) 20μL BER Buffer 5μL THF Beacon NO lisato | (Test in triplice copia) 15μL BER Buffer 5μL THF Beacon 5μL LN428 Lysate | (Test in triplice copia) 15μL BER Buffer 5μL THF Beacon 5μL LN428/MPG Lysate |
| Controllo Negativo 20μL BER Buffer 5μL lisato | (Control Background) 20μL BER Buffer 5μL Hx Beacon NO lisato | (Test in triplice copia) 15μL BER Buffer 5μL Hx Beacon 5μL LN428 Lysate | (Test in triplice copia) 15μL BER Buffer 5μL Hx Beacon LN428/MPG Ly 5μLsaziare |
| Controllo Negativo 20μL BER Buffer 5μL lisato |
Tabella 5. Beacon Molecular Assay set-up.
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Discussion
Ci sono più di 600 citazioni usando 'faro molecolare' il termine per rilevare e quantificare molecole di numerose attività enzimatiche, inclusa l'attività elicasi 6, attività di DNA polimerasi 7,8, l'attività del DNA ligasi 9, l'attività della telomerasi 10, l'attività del DNA fotoliasi 11 e DNA / RNA ibridi 12, tra molti altri. Oltre all'uso di segnali molecolari per la misurazione delle attività di riparazione del DNA sopra elencati, abbiamo e altri hanno dimostrato l'utilità di tali sonde per l'analisi dell'attività BER 1,2,13-15.
Il real-time saggio di attività BER descriviamo qui incorpora una singola base modificata e consente la valutazione quantitativa dei tassi di BER per diverse lesioni o alterazioni alla base di fronte alla lesione. Le applicazioni possono variare da molecolari studi meccanicistici agli schermi inibitori. Abbiamo dimostrato specificità BER confrontando Lysates da MPG cellule che esprimono con i non-cellule che esprimono e la mancanza di attività nel beacon di controllo. Il saggio è molto sensibile, permettendo la rilevazione di difetti in espressione del BER MPG proteine 2 o XRCC1 1 ed è sufficiente per rilevare variazioni minime dei parametri cinetici di riparazione del DNA e l'efficacia degli inibitori di riparazione del DNA [manoscritti in preparazione]. Letture multiple in tutto il sostegno attivo tempi di riparazione calcolato i tassi di cinetiche e il significato in ogni modifica di tali tariffe cinetici. Il test molecolare beacon BER è quindi adatto a high-throughput studi allo schermo per gli inibitori enzimatici di riparazione del DNA (schermi inibitori) o per gli studi sul ruolo dei singoli componenti nucleari. L'analisi dei lisati nucleari consente la valutazione della riparazione del DNA nel pieno contesto del complesso BER quindi anche raffigurante alterazioni indirette o influenze sulle macchine BER (es. post-traduzione modificazioni o mutazioni).
Ilprotocollo, come descritto, dovrebbe dare risultati altamente riproducibili e quantitativi. Tuttavia, ci sono molti dettagli da considerare per assicurare un'adeguata analisi: (1) I valori di fondo di controlli negativi potrebbero essere troppo elevate: Questo può essere dovuto a cattiva conservazione o la fabbricazione del oligonucleotide. Alti valori di fondo nei lisati senza fari indicano fluorescenza confondimento auto (cioè la contaminazione o l'espressione cellulare di proteine esogene fluorescenti). Se l'espressione di una proteina fluorescente è inevitabile, l'eccitazione / spettri di emissione per il colorante reporter fluorescente e proteine non possono sovrapporsi, (2) Fl (Tmax) è basso: concentrazione di DNA è diverso dato. Controllare la concentrazione di DNA mediante spettrofotometria (OD a 260 nm), per esempio, utilizzando il NanoDrop. Alta concentrazione di DNA a basso Fl (Tmax) indica un carico sufficiente FAM sul radiofaro. Purificazione HPLC previene la contaminazione con il DNA non modificato (vedi sopra), (3) attività di riparazione è povero: se i (Tmax) a valori di Flgli ultimi cicli indicano ingresso sufficiente faro e rivelazione di fluorescenza, questo potrebbe suggerire che la preparazione estratto nucleare fallito. Qualità estratto nucleare è fondamentale. Le basse temperature dovrebbe essere garantita durante tutta la procedura compresa stoccaggio a lungo termine a -80 ° C e (4) le curve di attività di riparazione avviare con elevati valori di esposizione: Anche molto breve dei campioni a temperatura ambiente prima dell'analisi iniziati riparazione. Conservare in luogo fresco in ogni momento.
Questo saggio BER molto sensibile e quantitativa è applicabile anche all'analisi di proteine purificate, consentendo studi sulla specificità di substrato alterando il beacon molecolare di conseguenza. Infine, il saggio è applicabile alle analisi di tumore e dei tessuti lisati, offrendo l'opportunità di misurare funzionali endpoint di riparazione del DNA come biomarker di risposta o di efficacia terapeutica, come abbiamo suggerito per valutare i tumori per PARP1 potenziamento inibitore della temozolomide agente alchilante 2.
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Disclosures
RWS è un consulente scientifico per Trevigen, Inc. Il resto degli autori dichiarano che non ci siano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione Pittsburgh e il National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] per RWS. Il supporto per lo strumento UPCI lentivirale è stata fornita RWS mediante la concessione di supporto Cancer Center dal National Institutes of Health [P30 CA047904]. Il sostegno è stato fornito anche dalla University of Pittsburgh Dipartimento di Farmacologia & Chemical Biology al DS. Il sostegno è stato fornito anche da ESTRO a CV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
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